ĆWICZENIA 13.10.11r.

PODSTAWOWA APARATURA I METODY STOSOWANE W BADANIACH MIKROBIOLOGICZNYCH

Sterylizacja, czyli wyjaławianie – jest to zabicie lub usunięcie wszystkich drobnoustrojów – zarówno form wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych.

Wszystkie badania mikrobiologiczne należy wykonywać w warunkach jałowych. Z tego powodu sterylizuje się pomieszczenia laboratoryjne, szkło laboratoryjne oraz pożywki, na których hoduje się drobnoustroje.

Prace mikrobiologiczne wykonuje się przy palnikach – do 20 cm wokół płomienia znajduje się strefa jałowa.

METODY STERYLIZACJI

1. Sterylizacja termiczna – wysokotemperaturowa.

   1. NA SUCHO

1. Wyżarzanie – wyjaławianie ezy w płomieniu palnika przed /po posiewie drobnoustrojów.

2. Opalanie – wyjaławianie głaszczek, bagietek szklanych, moździerzy przez zanurzenie w alkoholu i opalanie płomieniem palnika, opalanie wlotu probówek/kolbek.

3. Suszarka – szafka metalowa ogrzewana elektrycznie, zaopatrzona w termometr/termoregulator oraz izolowana termicznie. Służy do sterylizacji szkła laboratoryjnego (odpowiednio umytego przy użyciu detergentów, wypłukanego w wodzie bieżącej/destylowanej, wysuszonego i zabezpieczonego przed rozjałowieniem – 160 – 180⁰C (1,5 – 3 godzin).

   1. NA MOKRO

1. Autoklaw (sterylizator parowy) – jałowienie pożywek (tych, które nie ulegają rozkładowi w temperaturze powyżej 100⁰C) w parze nasyconej i pod ciśnieniem. Najczęściej stosowane parametry jałowienia: 1 atm (0,1 MPa) - 121⁰C lub 2 atm (0,2 MPa) - 134⁰C przez czas 15 – 45 minut.

2. Aparat Kocha – sterylizuje się w nim pożywki do hodowli drobnoustrojów metodą tyndalizacji, czyli przez ogrzewanie ich w parze bieżącej w temperaturze 100⁰C przez 30 minut, trzykrotnie w odstępach 24 godzin.

Jednokrotne zastosowanie aparatu nie prowadzi do sterylizacji, ponieważ zabiciu ulegają tylko formy wegetatywne. Przez okres 24 godzin przetrwalniki „kiełkują”/przechodzą w formy wegetatywne. Ponowne zastosowanie aparatu Kocha powoduje ich zabicie. Proces powtarzamy trzeci raz, aby na pewno zabić wszystkie formy i uzyskać pełną jałowość.

1. Sterylizacja niskotemperaturowa.

1. STERYLIZACJA GAZOWA (tlenek etylenu, formaldehyd).

2. METODY RADIACYJNE

1. Promieniowanie UV (254 nm)

W pracowniach mikrobiologicznych sterylizuje się pomieszczenia prom. UV. Najsilniej działają promienie o długości fali 230 – 275 nm. Najczęściej jałowi się przez okres 30 minut do 2 – 3 godzin.

1. Promieniowanie jonizujące (beta, gamma, prom. Roentgena)

1. FILTROWANIE

- filtr Chamberianda (filtr porcelanowy)

- filtr Berkefelda (ziemia okrzemkowa)

- filtr Scholta (sproszkowane szkło)

- filtr Soltza (mieszanina azbestu i celulozy)

- filtr membranowy (estry celulozy).

Dezynfekcja - proces polegający na zastosowaniu środków chemicznych do nieodwracalnej inaktywacji drobnoustrojów – niekoniecznie wszystkich, ale do poziomu akceptowanego do określonego zastosowania na powierzchniach nieożywionych.

Ocena działania środków chemicznych na niszczenie drobnoustrojów (w %):

bdb – 100%

db – 90%

dst – 70 – 80 %

ndst – poniżej 70%

Środki odkażające działają bakterio- i grzybobójczo (zabicie drobnoustrojów) lub bakterio-/miko statycznie (zahamowanie wzrostu i rozwoju).

Podział:

1. Rozpuszczające – kwasy i zasady

2. Utleniające – woda utleniona, nadmanganian potasu, chlor, ozon

3. Odwadniające – alkohole, detergenty

4. Zmieniające napięcie powierzchniowe – detergenty.

Gotowe preparaty chemiczne to np. Sterinol, Cidex, Aldesan, Sekusept.

Stosuje się też gazowanie pomieszczeń tlenkiem etylenu.

Pasteryzacja – polega na jednorazowym ogrzaniu płynów do temperatury od 60 do około 80⁰C (pasteryzacja niska lub wysoka, długotrwała – około 30 minut lub krótkotrwała – kilkanaście sekund)/natychmiastowym schłodzeniu. Pasteryzacja powoduje jedynie zabicie form wegetatywnych drobnoustrojów.

Walidacja metod mikrobiologicznych – udowodnienie, że stosowane metody prowadzą do oczekiwanych rezultatów.

Przykład: testy przydatności pożywek mikrobiologicznych.

- badanie jałowości: przygotowana pożywka jest bez żywych drobnoustrojów

- badanie żyzności: po posiewie drobnoustroje dobrze rosną na pożywce.

BARWIENIE

Barwniki – substancje pochodzenia naturalnego lub syntetycznego, które absorbują się lub rozpuszczają w barwionych substratach, dając trwałe połączenia barwne.

Związki stosowane do barwienia posiadają zazwyczaj grupę chromoforową i auksochromową – NASILAJĄCĄ BARWĘ i UŁATWIAJĄCĄ BARWIENIE, tzn. mającą zdolność tworzenia soli z różnymi substancjami np. grupy -NH₃, -OH, -COOH itp.

Barwniki o takiej budowie podzielono na:

- kwaśne (eozyna, fuksyna kwaśna, zieleń jasna)

- zasadowe (błękit metylenowy, fiolet krystaliczny, fiolet goryczki, fuksyna zasadowa).

Barwniki kwaśne to sole, w których kationem jest metal, a jonem barwnym anion.

Barwniki zasadowe to sole, w których barwny jest kation; ich roztwory są na skutek hydrolizy lekko kwaśne.

Do barwienia drobnoustrojów stosuje się przeważnie barwniki zasadowe. Wynika to z budowy i składu chemicznego powierzchniowych warstw komórki, jak również ze znacznej zawartości kwasów nukleinowych.

Cele barwienia:

• Odróżnienie bakterii od składników otoczenia,

• Odróżnienie poszczególnych grup drobnoustrojów między sobą

• Odróżnienie pewnych szczegółów w budowie komórki

• Wykazanie zmian czynnościowych w komórce.

Aby sporządzić barwnik przygotowuje się roztwory macierzyste, czyli nasycone roztwory alkoholowe w stosunku 1:10. Na 1 g barwnika daje się 10 ml 96% spirytusu. Zlany znad osadu roztwór macierzysty barwnika rozcieńcza się wodą destylowaną/dodaje ewentualnie bejców.

Np. fuksyna zasadowa alkoholowo-wodna składa się z 10 ml roztworu macierzystego fuksyny/90 ml wody destylowanej; błękit metylenowy wg Loefflera zawiera 30 ml roztworu macierzystego błękitu i 100 ml 0,01% roztworu wodnego KOH.

HODOWLA MIKROORGANIZMÓW

1. Warunki rozwoju mikroorganizmów: obecność wody, soli mineralnych i substancji odżywczych oraz odpowiednie pH, temperatura i skład atmosferyczny środowiska.

2. Środowiska, w których sztucznie stworzono odpowiednie warunki odżywcze/pH dla drobnoustrojów nazywamy pożywkami lub podłożami mikrobiologicznymi.

3. Ilość podłóż stosowanych obecnie w laboratoriach mikrobiologicznych jest bardzo duża, zarówno ze względu na różne kierunki badań, jak i wielką liczbę drobnoustrojów i ich zróżnicowanie pod względem fizjologicznym.

4. Cechy charakterystyczne podłóż: łatwo dostępne źródło węgla (za wyjątkiem autotrofów) i azotu (za wyjątkiem asymilatorów azotu atmosferycznego), obecność soli mineralnych, izotoniczność środowiska i odpowiednie pH.

5. Podział podłóż:

- ze względu na konsystencję: płynne, półpłynne (agar-agar 0,1 – 0,7%), stałe (środki zestalające: agar-agar 1,5% - 2% lub żelatyna – 10% zimą i 15 – 20% latem).

- ze względu na skład chemiczny: syntetyczne (sztuczne) – bezbiałkowe o ściśle określonym składzie chemicznym, naturalne – białkowe z dodatkiem naturalnych produktów, np. mleka, surowicy krwi itp.; oraz minimalne – zawierające absolutnie niezbędne składniki podtrzymujące wzrost, pełne – z dodatkiem związków dla optymalnego wzrostu i rozwoju mikroorganizmów.

- ze względu na wzrost drobnoustrojów: zwykłe (kolektywne, podstawowe, ogólne, uniwersalne) i specjalne (wybiórcze, selektywne, np. agar Endo dla Escherichia coli podłoże Ashby’ego dla Azotobacter) o składzie: substancje zestalające, składniki odżywcze, wybiórcze (barwniki, sole mineralne, sole kwasów organicznych, pH, czyli czynniki hamujące wzrost niektórych grup drobnoustrojów) lub różnicujące (związki, które pod wpływem enzymów mogą być rozkładane do produktów dających się łatwo wykryć).

1. Charakterystyka podstawowych podłóż mikrobiologicznych:

Bulion zwykły – podłoże płynne, ogólne dla bakterii, skład: 15 g „suchego bulionu” (wyciąg mięsny z dodatkiem 2% peptonu), 1000 ml wody destylowanej, pH 7,0 – 7,2; sterylizacja w autoklawie.

Agar zwykły – MPA (mięsno-peptynowy agar) – podłoże stałe, ogólne dla bakterii, skład: 1000 ml bulionu + 2% agar-agar, temperatura rozpuszczania 95-99⁰C, temperatura krzepnięcia 45-48⁰C, pH 7,4 – 7,6; sterylizacja w autoklawie.

Żelatyna – podłoże stałe, ogólne dla bakterii proteolitycznych, skład: 1000 ml bulionu + 10-20% żelatyny, pH 7,8; sterylizacja w aparacie Kocha – metodą tyndalizacji.

Pożywka brzeczkowa (brzeczka) – podłoże stałe, ogólne dla grzybów, skład: 1000 ml brzeczki niechmielowanej (browarnianej) + 2% agar-agar, pH 5,5 – 5,8; sterylizacja w autoklawie.

1. Metody hodowli:

1. hodowla statyczna – do czasu wyczerpania składników pokarmowych lub zatrucia własnymi produktami

2. hodowla ciągła – stały dopływ pożywki i odpływ zużytego podłoża.

Pośrednie (hodowlane) metody pomiaru ilości drobnoustrojów (metoda płytkowa, metoda rozcieńczeń).

1. Zgodnie z warunkami rozwoju drobnoustrojów stosuje się odpowiednie podłoża, hodowlę prowadzi się w optymalnej temperaturze i odpowiednim składzie atmosfery środowiska. Ogólne warunki hodowli dla większości drobnoustrojów mezofilnych są następujące:

drobnoustroje	pożywka	temperatura	pH	czas hodowli
bakterie	MPA bulion	37⁰C 37⁰C	~ 7 ~ 7	24 h 24 h
bakterie proteolityczne	żelatyna	20-22⁰C	~ 7	48 h
grzyby	brzeczka	28⁰C	~ 5,6	3 dni

Mikroorganizmy tlenowe i względnie beztlenowe hoduje się w termostatach (inkubatorach, cieplarkach) lub hodowlę przeprowadza się pod parafiną, olejem, warstwą agaru 3% itp. lub w obecności mikroorganizmów usuwających tlen z pożywki. Hodowlę beztlenowców można także prowadzić w eksykatorach próżniowych lub specjalnych aparatach – an aerostatach.

1. Przechowywanie drobnoustrojów.

Mikroorganizmy przechowuje się w chłodniach w temperaturze +1 do +4⁰C, w zamrażarkach lub w postaci zliofilizowanej.

Liofilizacja – wysuszanie drobnoustrojów w niskiej temperaturze w próżni.

Mikrobiologia to nauka o drobnoustrojach, do których zaliczamy:

1. Virales

2. Procaryota:

   1. Bakterie,

   2. Riketsje,

   3. Mikoplazmy,

   4. Sinice.

3. Eucaryota:

   1. Grzyby mikroskopowe,

   2. Glony jednokomórkowe i kolonijne,

   3. Pierwotniaki.

METODA IZOLACJI MIKROORGANIZMÓW:

1. Metoda opadowa

2. Metoda odciskowa

3. Metoda posypowa

4. Metoda płytkowa rozcieńczeń Kocha

5. Metoda posiewu po wieloboku

Metoda płytkowa rozcieńczeń Kocha

Posiew to metoda uzyskania pojedynczych, odosobnionych kolonii bakterii, czy grzybów na podłożach mikrobiologicznych.

Metoda ta jest powszechnie znana, jako posiew redukcyjny. Jej twórcą jest niemiecki mikrobiolog Robert Koch. Metody tej można używać tylko podczas wysiewania na podłoża stałe.

Posiew redukcyjny jest najpopularniejszą metodą posiewu, na co wpływa jego uniwersalność względem ilości mikroorganizmów w wyjściowej zawiesinie. Istnieje kilka możliwości poprawnego wysiania materiału metodą redukcyjną, nieznacznie różniących się między sobą. My zaproponujemy chyba najprostszą z nich. Sam proces posiewania podzielić można na cztery części. Wygodnie byłoby, szczególnie przy dużej liczbie posiewów, zaopatrzyć się w cztery kolejno ułożone w stojaku (aby nie mieszało się, które są "gorące", a które nie) ezy - po jednej do każdego etapu. Po pobraniu materiału wcześniej wysterylizowaną w płomieniu palnika ezą należy rozprowadzić go po podłożu do około 40% szerokości szalki Petriego w identyczny sposób, jak w przypadku "metody pierwszej" (etap 1). Następnie sterylizujemy użytą ezę, dla wygody obracamy płytkę o 90° i kolejną z rzędu pętlą bakteriologiczną powtarzamy czynność (etap 2). Obracamy znów płytkę Petriego (trzymając się obranego kierunku) i powtarzamy czynności (etap 3). W etapie 4 kolejną ezą poruszamy w taki sposób, aby zmieścić się w górnej części etapu trzeciego i wolnej przestrzeni pośrodku. W tym momencie posiew został zakończony, płytkę możemy włożyć do cieplarki. Sami za to możemy wziąć pierwszą ezę i zacząć wszystko od początku...

Schemat posiewu redukcyjnego
etap 1	etap 2	etap 3	etap 4

MORFOLOGIA BAKTERII:

- FORMY KULISTE:

Układy:

• Micrococcus (ziarniak),

• Diplococcus (dwoinka),

• Tetragenes (czwórniak),

• Sarcina (sześcianka),

• Streptococcus (paciorkowiec),

• Staphylococcus (gronkowiec).

- FORMY CYLINDRYCZNE:

• Bacillus (laseczka),

• Clostridium (laseczka),

• Streptobacillus (laseczka),

• Bacterium (pałeczka).

- FORMY SPIRALNE:

• Spirillum (śrubowiec),

• Spirochaeta (krętek),

• Vi brio (przecinkowiec).

TEORETYCZNE METODY BARWIENIA BAKTERII

Rodzaje barwienia:

- barwienie proste polega na wprowadzeniu do komórki jednego barwnika,

pozytywne negatywne

obserwujemy zabarwione obserwujemy niezabarwione

drobnoustroje na bezbarwnym tle drobnoustroje na barwnym tle

- barwienie złożone – w czasie barwienia stosuje się kilka barwników w mieszaninie lub kolejno po sobie oraz odbarwiacze.

Sporządzanie preparatów bakteriologicznych:

1. Na odtłuszczone szkiełko podstawowe nanosimy za pomocą wyjałowionej ezy 2-3 krople płynu fizjologicznego (0,85% roztworu NaCl) – [dotyczy hodowli bakterii z podłoża stałego].

2. Ponownie wyjałowioną ezą pobieramy badany materiał, wprowadzamy go do kropli soli fizjologicznej i wykonujemy rozmaz.

3. Wyjaławiamy ezę.

4. Rozmaz suszymy na wolnym powietrzu.

5. Preparat utrwalamy poprzez trzykrotne przeprowadzenie go przez płomień palnika.

CEL UTRWALANIA:

- zabicie komórek bakterii,

- częściowa denaturacja białka i rozerwanie struktur komórkowych, co powoduje odsłanianie grup czynnych biorących udział w reakcji i ułatwia wniknięcie barwnika do wnętrza komórki.

1. Utrwalony preparat studzimy na wolnym powietrzu.

BARWIENIE BAKTERII METODĄ PROSTĄ POZYTYWNĄ:

1. Na wysuszony i utrwalony preparat działamy fuksyną alkoholowo-wodną, przez 1,5-2 minut.

2. Preparat spłukujemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją.

Olejek imersyjny – wyciąg z drzewa cedrowego, który niweluje zjawisko załamania promieni świetlnych podczas przechodzenia ze środowiska optycznie rzadszego, jakim jest powietrze, do środowiska optycznie gęstszego, jakim jest szkło.

Posługiwanie się mikroskopem imersyjnym:

1. Umieścić kroplę olejku imersyjnego na szkiełku przedmiotowym z preparatem.

2. Kondensor podnieść do góry.

3. Odszukać obiektyw imersyjny (100x powiększony).

4. Umieścić szkiełko przedmiotowe na stoliku.

5. Opuścić obiektyw do zanurzenia w olejku zawsze patrząc z boku, aby nie uszkodzić obiektywu.

6. Nastawić światło lusterkiem.

7. Obiektyw powoli podnosić do góry ŚRUBĄ MAKROMETRYCZNĄ do momentu pojawienia się obrazu.

8. Ostrość regulować ŚRUBĄ MIKROMETRYCZNĄ (pół obrotu).

Powiększenie mikroskopu – iloczyn powiększenia okularu i obiektywu, np. 10 x 100 = 1000, 12,5 x 100 = 1250.

Barwienie proste pozytywne fuksyna alkoholowo-wodna 1,5 min.

Forma kulista

Gronkowiec (Staphylococcus)

ĆWICZENIA 27.10.11r.

ASYMILATORY AZOTU ATMOSFERYCZNEGO

Asymilatory wolnego azotu

bakterie symbiotyczne wolnożyjące

- tlenowe

- beztlenowe

Symbiotyczne asymilatory wolnego azotu:

• Rhizobium

• Bradyrhizobium

• Azorhizobium

• Sinorhizobium

• Mesorhizobium

• Allorhizobium

• Frankia (promieniowiec, symbioza z olchą)

Bakterie symbiotyczne

Bakterie brodawkowe – bakterie glebowe żyjące w symbiozie z roślinami motylkowymi.

brodawka BAKTEROID

forma czynna

wiąże azot atmosferyczny!

ruchliwe pałeczki partie włośnikowe nić infekcyjna

korzenia

Bakteroid - postać rozwojowa bakterii brodawkowych, współżyjących z roślinami bobowatymi (motylkowatymi), silnie nabrzmiałe twory powstające po wniknięciu bakterii do korzeni rośliny.

Rhizobium (9 gatunków)

Np. Rhizobium leguminosarum

1. Biotyp: Viciae (wyka, groch – symbioza)

bakteroid biotypu Viciae

1. Biotyp: Trifolii (koniczyna)

bakteroid biotypu Trifolli

1. Biotyp: Phaseoli (fasola)

bakteroid biotypu Phaseoli

Korzyści wynikające z symbiozy:

1. Roślina dostarcza bakteriom:

- wodę,

- sole mineralne,

- tlen,

- związki organiczne.

1. Bakterie dostarczają roślinie związki azotu, do produkcji których azot czerpany jest z atmosfery.

Wolnożyjące asymilatory azotu atmosferycznego

Tlenowe:

• Azotobacter (Chroococcum – bakteria glebowa wiążąca azot)

• Arthrobacter

• Aerobacter

• Flavobacterium

• Derxia

• Beijerinckia

• Azomonas

• Pseudomonas

Beztlenowe:

• Clostridium (pasteurianum)

• Chlorobium

• Chromatium

• Desulfovibrio

Azotobacter chroococcum

Gatunek odkryty w roku 1901 przez Beijerincka.

Młode komórki mają postać krótkich, grubych ziarniaków połączonych parami i posiadających wspólną otoczkę śluzową – ZOOGLEĘ. Bakteria gramujemna.

Wymagania Azotobacter sp.:

1. Gruzełkowata struktura gleby

2. pH = 6-8

3. Gleby żyzne, bogate w związki organiczne, sole mineralne, a szczególnie: P, Mg, Ca, S, Fe, Mo.

Azot dostępny jest dla innych organizmów dopiero po obumarciu komórek Azotobacter.

Azotobacter chroococcum jest wykorzystywany jako szczepionka bakteryjna doglebowa, w celu wzbogacenia gleby w azot – AZOTOBAKTERYNA.

Wykonanie preparatu:

1. Na wysuszony i utrwalony preparat działamy fuksyną zasadową przez 1,5 – 2 minut. Następnie preparat spłukujemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją.

Azotobacter sp.

Barwienie proste pozytywne

– fuksyna zasadowa (1,5 – 2 minut)

BARWIENIE ZŁOŻONE METODĄ GRAMA W MODYFIKACJI HUCKERA

W metodzie Grama stosujemy:

- barwnik podstawowy – fiolet krystaliczny

- bejca (zaprawa, utrwalacz) – płyn Lugola (I w KI, jod w jodku potasu)

- odbarwiacz – 95% etanol

- barwnik kontrastowy – safranina

1. BAKTERIE GRAMDODATNIE – zatrzymują barwnik podstawowy (fiolet) po utrwaleniu go płynem Lugola i nie odbarwiają się pod wpływem alkoholu. W metodzie Grama barwią się na kolor fioletowy. Zaliczamy do nich wszystkie laseczki i formy kuliste.

2. BAKTERIE GRAMUJEMNE – nie zatrzymują kompleksu fiolet krystaliczny – jod, odbarwiają się pod wpływem alkoholu i przyjmują barwnik kontrastowy. W metodzie Grama barwią się na kolor różowy. Należą do nich wszystkie pałeczki.

FORMY CYLINDRYCZNE BAKTERII:

PAŁECZKA

• Gramujemne

• Nie wytwarzają przetrwalników

• Brak zjawiska atrakcji barwnika w barwieniu prostym negatywnym

• Zwykle mniejsze

LASECZKA

• Gramdodatnie

• Wytwarzają przetrwalniki

• Wykazują zjawisko atrakcji barwnika w barwieniu prostym negatywnym

• Zwykle większe

Bacillus	Clostridium
Tlenowe lub względnie beztlenowe	Beztlenowe
Średnica przetrwalnika nie przekracza średnicy komórki wegetatywnej	Średnica przetrwalnika przekracza średnicę komórki wegetatywnej

TECHNIKA BARWIENIA METODĄ GRAMA W MODYFIKACJI HUCKERA

Na wysuszony i utrwalony preparat działamy:

1. Fiolet krystaliczny – 1 minuta.

2. Spłukujemy wodą.

3. Płyn Lugola (I w KI) – 1 minuta.

4. Spłukujemy wodą.

5. Preparat odbarwiamy alkoholem do momentu spływania bezbarwnych kropli alkoholi po powierzchni preparatu (ok. 30 sekund).

6. Przerywamy działanie odbarwiania wodą.

7. Preparat podbarwiamy safraniną – 45 sekund.

8. Spłukujemy wodą.

9. Preparat suszymy i oglądamy pod imersją.

Wynik barwienia metodą Grama:

BAKTERIE GRAMUJEMNE BAKTERIE GRAMDODATNIE

ĆWICZENIA, 17.11.11r.

BARWIENIE PROSTE NEGATYWNE

Barwienie negatywne polega na tym, że barwnik znajdujący się w stanie małej dyspersji (b. gruboziarnisty) nie wnika do wnętrza komórki bakteryjnej, zabarwia jedynie tło. Przy tym sposobie barwienia nie zabarwione bakterie widoczne są na barwnym tle.

Najczęściej stosowany barwnik:

- tusz chiński,

- nigrozyna,

- cyjanochina (tło czerwone),

- kolargol (tło czerwone),

- czerwień Kongo (tło czerwone).

W barwieniu prostym negatywnym bakterie gram dodatnie wykazują zjawisko atrakcji barwnika, polegające na asocjacji cząsteczek barwnika na powierzchni niezabarwionej komórki.

Bakterie gramujemne nie wykazują zjawiska atrakcji barwnika i tło preparatu jest równomiernie wybarwione. Jednakże czasami można zaobserwować wewnątrz nie wybarwione komórki, delikatną smugę barwnika lub punkcik, co tłumaczy się większą przepuszczalnością ściany komórkowej u bakterii gram ujemnych.

BAKTERIE GRAMUJEMNE BAKTERIE GRAMDODATNIE

brak zjawiska atrakcji barwnika zjawisko atrakcji barwnika

Barwienie negatywne służy do obserwacji bakterii nie wchłaniających uniwersalnych barwników mikrobiologicznych, np. krętek blady (Treponema pallidum).

MORFOLOGIA PROMIENIOWCÓW

PROMIENIOWCE – ACTINOMYCES

Są to gram dodatnie bakterie o różnorodnych cechach morfologicznych fizjologiczno-biochemicznych, o składzie nukleotydowym G + C (guanina + cytozyna) w DNA > 55 mol % (55 – 75 mol %). Są ogniwem pośrednim pomiędzy bakteriami właściwym, a grzybami.

Cechy upodobniające promieniowce do bakterii i grzybów:

CECHY BAKTERII	CECHY GRZYBÓW
Organizmy prokariotyczne	Wytwarzają pseudogrzybnię
Brak uorganizowanego jądra komórkowego	Rozmnażanie

Cechy fizjologiczne promieniowców:

1. Różnorodność procesów rozmnażania (zarodniki – arthrospory, aleuriospory, zoospory - pływki, fragmentacja strzępek, podział komórek).

2. W większości tlenowce (zdarzają się również wyjątki mikroaerofile i betlenowce – głownie pasożyty).

3. Większość to saprofity (nieliczne to pasożyty i chemoautotrofy).

4. Organizmy jednokomórkowe. Komórki mają postać rozgałęzionej strzępki, która może tworzyć dwa rodzaje grzybni:

- grzybnia powietrzna (powierzchniowa) – odpowiada za procesy rozmnażania

- grzybnia podłożowa – przytwierdza do podłoża, odpowiada za pobieranie składników odżywczych.

5. Mają zdolność do autolizy – rozpadu grzybni na fragmenty.

6. Wytwarzają heterokarionty poprzez funkcję protoplastów.

7. Są głównie mezofilami.

* Strzępki promieniowców tworzą grzybnię.

Wybrane rodzaje promieniowców:

• Nocardia sp.

• Actinomyces sp.

• Streptomyces sp.

Znaczenie promieniowców:

1. Uczestniczą w procesie tworzenia gleby.

2. Biorą udział w syntezie i rozkładzie próchnicy.

3. Uczestniczą w tworzeniu się struktury gleby.

4. Produkują metabolit zwany geosminą, który nadaje glebie charakterystyczny ziemisty zapach (Streptomyces odorifer).

5. Biorą udział w przemianach związków fosforowych (głównie Streptomyces sp. uruchamia nierozpuszczalne fosforany).

6. Niektóre gatunki współżyją z roślinami wyższymi i wiążą azot atmosferyczny (np. Frankia alni).

7. Wykazują uzdolnienia w zakresie adsorpcji i degradacji miko toksyn.

8. Produkują witaminy (zwłaszcza z grupy B), enzymy, oraz są głównymi producentami antybiotyków.

9. Uczestniczą w samooczyszczaniu się wód.

10. Są wskaźnikami terenów roponośnych (węgiel jako źródło energii).

11. Są silnymi alergenami, niektóre są szkodnikami magazynów, wiele gatunków ma właściwości chorobotwórcze (gruźlica, trąd, promienica, nokardioza).

ANTYBIOTYK - jest to substancja chemiczna pochodzenia biologicznego (lub jej syntetyczny analog), która wybiórczo działa zabójczo lub statycznie na drobnoustroje w niskich stężeniach – oligodynamicznie. Antybiotyki są produktami wtórnego metabolizmu drobnoustrojów. Wytwarzanie antybiotyku jest cechą szczepową.

Promieniowce produkujące antybiotyki:

Streptomyces grisens – streptomycyna

Streptomyces erythreus – erytromycyna

Streptomyces venezuelae – chloramfenikol

Streptomyces aureofaciens – tetracyklina

Streptomyces noursei – nystatyna

Antybiotyki też są wytwarzane przez grzyby pleśniowe.

MYKOTOKSYNY - toksyny wytwarzane przez niektóre gatunki grzybów (pleśni) z rodzajów: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizoctonia, Claviceps i Stachybotrys. Optymalna temperatura w jakiej tworzą się mykotoksyny oscyluje w granicach 20-25 °C. Źródłem mykotoksyn są najczęściej zakażone produkty żywnościowe, toksynotwórcze pleśnie mogą także namnażać się w budynkach. Często są to substancje rakotwórcze i mutagenne; m.in. hamują syntezę DNA oraz powodują zmiany w metabolizmie RNA.

Mykotoksyny mogą być przyczyną ostrych i przewlekłych zatruć (także śmiertelnych), mogą powodować alergie, grzybice, choroby układu oddechowego, pokarmowego i wątroby, a także liczne choroby związane z osłabieniem układu odpornościowego.

Do mykotoksyn zalicza się m.in. aflatoksyny, ochratoksyny (m.in. ochratoksynę A), patulinę i kwas aspergilowy.

Cel ćwiczeń: obserwacja mikroskopowa promieniowców.

Na wysuszony i utrwalony preparat działamy fioletem krystalicznym przez 2 minuty, następnie spłukujemy go wodą, suszymy i oglądamy przez imersję.

ĆWICZENIA, 24.11.11r.

MORFOLOGIA GRZYBÓW cz. 1.

Systematyka grzybów wg Gaϋmana:

Typ: Fungi

1. Klasa: Archimycetes – pragrzyby (grzyby o plechach okresowo lub stale nagich, np. rak ziemniaczany).

2. Klasa: Phycomycetes – pleśniaki, glonowce (grzybnia o strzępkach jednokomórkowych, przeważnie niepodzielna przegrodami poprzecznymi, zarodnie z zarodnikami).

3. Klasa: Ascomycetes – workowce (zarodnia w postaci worka – ascus, z zarodnikami – ascosporami – zwykle po 8 w worku; w workach zachodzi proces koniugacji).

4. Klasa: Basidiomycetes – podstawczaki.

5. Klasa: Denteromycetes – grzyby niedoskonałe (wielokomórkowe, nie są znane stadia płciowe, rozmnażają się przez konidia).

SYSTEMATYKA DROŻDŻY

TYP: Fungi
KLASA: Ascomycetes (workowce)
RODZINA: Saccharomycetaceae (drożdże szlachetne)
RODZAJ: Saccharomyces Np. Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarnicze) Saccharomyces elipsoideus (drożdże winne) Saccharomyces carlsbergensis/uvarum (drożdże piwne)

TEST NA ŻYWOTNOŚĆ DROŻDŻY

błękit metylenowy

+ komórki martwe komórki żywe

zawiesina drożdży ciemnoniebieskie bezbarwne

Preparaty przyżyciowe, szkiełko nakrywkowe, kondensor poodsuwany, preparat ustawiamy pod średnim powiększeniem mikroskopu (40-krotnym).

TEST NA ODŻYWIANIE DROŻDŻY (WYKRYWANIE GLIKOGENU)

płyn Lugola

+ ziarna glikogenu

zawiesina drożdży ceglastopomarańczowy kolor

Bez rozmazu, 1-2 krople.

Bakterie – 1000x lub 1250x

Grzyby – 400x lub 100x

Długość ogniskowej – 3,2 mm

KLASA: Phycomycetes (pleśniaki)

RZĄD: Mucorales

RODZINA: Mucoraceae

1. RODZAJ: Mucor

2. RODZAJ: Rhizopus

Np. Rhizopus nigruans – pleśniak czarny

Preparaty przyżyciowe

pH = 5,6 na brzeczce

28⁰C

czas inkubacji – 3 dni (72 h)

Bakterie 37⁰C

ĆWICZENIA 01.12.11r.

MORFOLOGIA GRZYBÓW

SYSTEMATYKA GRZYBÓW WG GAÜMANA:

Typ: Fungi

1. Klasa: Archimycetes – pragrzyby (grzyby o plechach okresowo lub stale nagich, np. rak ziemniaczany).

2. Klasa: Phycomycetes – pleśniaki, glonowce (grzybnia o strzępkach jednokomórkowych, przeważnie nie podzielona przegrodami poprzecznymi, zarodnie z zarodnikami).

3. Klasa: Ascomycetes – workowce (zarodnia w postaci worka – ascus, z zarodnikami – ascosporami – zwykle po 8 w worku. W workach zachodzi proces koniugacji).

4. Klasa: Basidiomycetes – podstawczaki.

5. Klasa: Deuteromycetes – grzyby niedoskonałe, wielokomórkowe, nie są znane stadia płciowe, rozmnażają się przez konidia).

Klasa: Ascomycetes
Rodzina: Saccharomycetaceae
Rodzaj: Saccharomyces
Gatunki: Saccharomyces cerevisiae (drożdże piekarnicze)
Saccharomyces calsbergensis (drożdże piwne)
Saccharomyces elipsoideus (drożdże winne)


Klasa: Deuteromycetes
Rodzaje: Candida, Rhodotorula, Sporobolomyces, Torulopsis

Drożdże to jednokomórkowe grzyby, nie zawierające chlorofilu, są typowymi chemoorganotrofami. Wśród drożdży można spotkać zarówno organizmy saprofityczne jak i pasożyty. Rozmnażają się przez podział, pączkowanie i zarodniki workowe.

Próba na odżywianie drożdży

Drożdże + płyn Lugola Substancja zapasowa (glikogen) wybarwia się na kolor ceglasty

Próba na żywotność drożdży

Drożdże + błękit metylenowy żywe drożdże – komórki pozostają bezbarwne,

martwe drożdże – komórki wybarwiają się na niebiesko

KLASA: Phycomycetes
RZĄD: Mucorales
RODZINA: Mucoraceae

Rodzaj: Mucor

kolumella

sporangium

sporangiospory

sporangiofor

Mucor sp.

Rodzaj: Rhizopus

Rhizopus sp.

stolony

rhizoidy

KLASA: Deuteromycetes
RZĄD: Moniliales
RODZINA: Moniliaceae

Rodzaj: Aspergillus

Aspergillus niger

konidia

sterigmy

konidiofor

Rodzaj: Penicillium

konidia

sterigmy I i II rzędowe

konidiofor

Penicillium sp.

Rodzaj: Oospora

oidia

Oospora lactis

Rodzaj: Trichothecium

konidia

Trichothecium sp.

RODZINA: Dematiaceae

Rodzaj: Cladosporium

konidia

Cladosporium sp.

Rodzaj: Alternaria

konidia

Alternaria sp.

RODZINA: Tuberculariaceae

Rodzaj: Fusarium

chlamydospory

makrokonidia

mikrokonidia

Fusarium sp.

MIKOTOKSYNY są to substancje biologicznie czynne, produkowane przez grzyby toksynotwórcze z klasy Deuteromycetes. Działają one totalnie na mikro – i makroorganizmy. Działanie ich może być mutagenne, teratogenne, kokarcinogenne i fitotoksyczne.

GRZYBY TOKSYNOTWÓRCZE:

1. Aspergillus flavus - aflatoksyny

2. Aspergillus fumigatus - ochratoksyny

3. Aspergillus ochraceus - ochratoksyny

4. Aspergillus terreus – kwas terreikowy

5. Aspergillus versicolor - sterygmatocystyna

6. Penicillium citrinum - cytrynina

7. Penicillim rugulosum - rugulozyna

8. Alternaria alternata - alterotoksyna

9. Alternaria longipes - alternariol

10. Fusarium graminearum - zearalenon

11. Trichothecium roseum - trichotecyna

ĆWICZENIA 08.12.11r.

ANALIZA MIKROBIOLOGICZNA WODY W ASPEKCIE SANITARNO-HIGIENICZNYM

ANALIZA MIKROBIOLOGICZNA:

ANALIZA ILOŚCIOWA ANALIZA JAKOŚCIOWA

Przeliczamy! - identyfikacja (diagnostyka) drobnoustrojów

- określa się ilość drobnoustrojów w 1g, 1 cm³, 1 m³

METODY ILOŚCIOWEJ ANALIZY MIKROBIOLOGICZNEJ:

1. METODY BEZPOŚREDNIE:

1. Liczenie drobnoustrojów w komorach (np. w komorze Thoma).

2. Liczenie drobnoustrojów na preparatach barwionych

- Prescotta-Breeda (pipeta 0,01 ml, szablon)

- Burriego (eza z wykalibrowanym oczkiem o pojemności 0,001 ml)

- rozmaz na powierzchni 1 cm² (szablon pod szkiełkiem)

1. Liczenie na filtrze membranowym

1. METODY POŚREDNIE:

1. Metoda optyczna (nefelometria)

2. Metoda enzymatyczna (np. próba reduktazowa)

3. Metoda płytkowa rozcieńczeń Kocha

4. Metoda filtracyjna (filtrów membranowych) – filtr z drobnoustrojami odbity na pożywce

5. Metoda wskaźnikowa

ASPEKT SANITARNY – występowanie drobnoustrojów chorobotwórczych (metoda wskaźnikowa*).

ASPEKT HIGIENICZNY – zanieczyszczenie wody odchodami.

CEL: określenie ogólnej liczby drobnoustrojów w jednostce objętościowej wody oraz określenie tzw. wskaźników sanitarnych (określenie sanitarno-higieniczne*).

MIKROFLORA WÓD:

1. DROBNOUSTROJE AUTOCHTONICZNE – głównie bakterie autotroficzne (foto- i chemoautotrofy), a także saprofity, np.: bakterie – Pseudomonas, Achromobacter; grzyby – Mucor, Leptomitus, Saprolegnia.

2. DROBNOUSTROJE ALLOCHTONICZNE – saprofity i pasożyty naniesione z: gleby i powietrza, ścieków, przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt.

Schemat metody płytkowej rozcieńczeń Kocha na przykładzie analizy wody.

METODA PŁYTKOWA ROZCIEŃCZEŃ KOCHA jest pośrednią metodą służącą do liczenia drobnoustrojów i polega ona na sporządzaniu serii kolejnych rozcieńczeń kolejnego materiału, a następnie na przenoszeniu ich na odpowiednie podłoża.

SCHEMAT ROZCIEŃCZEŃ – ANALIZA WODY

PODŁOŻE	ROZCIEŃCZENIE	Średnia ilość jtk lub miano
	N	10
Bulion z laktozą i purpurą bromokrezolową	+	+
MPA	+	+
Żelatyna	+	+
Brzeczka	+	+

ĆWICZENIA 15.12.11r.

ODCZYT MIKROBIOLOGICZNEJ ANALIZY WODY.

WSKAŹNIKI ZANIECZYSZCZENIA WÓD:

1. Bakterie grupy coli

- gramujemne pałeczki

- nie wytwarzają przetrwalników

- są względnymi beztlenowcami (względnie beztlenowe!)

- fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 24-48h w temp. 35-37⁰C (cecha biochemiczna)

Należą do rodzaju: Escherichia, Citrobacter i Enterobacter w obrębie rodziny Enterobacteriaceae.

1. Bakterie grupy coli TYPU KAŁOWEGO

- gramujemne pałeczki

- nie wytwarzają przetrwalników

- są względnymi beztlenowcami (względnie beztlenowe!)

- fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w ciągu 24-48h w temp. 44⁰C (organizmy termofilne)

- przeprowadzają charakterystyczne procesy biochemiczne

Większość tych bakterii występujących w wodach i ściekach to Escherichia coli.

1. ESCHERICHIA COLI

Pałeczka okrężnicy. Bytuje w okrężnicy jelita grubego ludzi i zwierząt. Jej rola fizjologiczna polega na wykorzystywaniu resztek pokarmowych, syntetyzowaniu witamin z grupy B i K oraz na antagonistycznym wpływie na inne drobnoustroje.

RODZINA ENTEROBACTERIACEAE

Obejmuje 14 rodzajów. Są to bakterie chorobotwórcze, warunkowo chorobotwórcze (np. Escherichia coli) i saprofity (głównie glebowe).

Gramujemne pałeczki, nie przetrwalnikują, względnie beztlenowe.

Chorobotwórcze:

Salmonella (wywołuje dur brzuszny), Shigella (czerwonka), Proteus (zakażenie układu moczowego), Klebsiella (pneumoniae, pałeczka zapalenia płuc).

Bakterie grupy coli:

Fermentują laktozę z wytworzeniem kwasu i gazu w temp. 35-37⁰C w przeciągu 48h. Charakterystycznie rosną na agarze Endo – czerwone kolonie z metalicznym połyskiem.

Typ kałowy:

Escherichia coli

Typ kałowy i ziemny:

Citrobacter i Enterobacter (w zależności od gatunku)

METODY BADAŃ

1. Badania wstępne – przeprowadza się je metodą fermentacyjną probówkową (FP).

Purpura bromokrezolowa, fiolet, kwaśne środowisko, żółty.

Fermentacja laktozy z wydzieleniem kwasu, izolacja bakterii grupy coli.

1. Badania potwierdzające.

- metoda fermentacyjna probówkowa (LPB)

Potwierdzenie wyników: 33 (wcześniej) 44⁰C (teraz)

- metoda rozsiewu powierzchniowego

Podłoże wybiórcze agar Endo

(MPA – mięsno-peptynowy agar) + laktoza + fuksyna zasadowa (ciemnoróżowy) + bezwodny siarczyn sodu (Na₂SO₃) (bladoróżowy)

Escherichia coli siarczan sodu (Na₂SO₄)

Pod wpływem metabolizmu Escherichii coli agar Endo przyjmuje podłoże ciemnobordowe, a kolonie Escherichia coli przyjmują charakterystyczny metaliczny połysk.

ODCZYT MIKROBIOLOGICZNEJ ANALIZY WODY

1. Określenie miana drobnoustrojów – miano jest to najmniejsza ilość (objętość) badanego produktu (najważniejsze rozcieńczenie), w której stwierdza się jeszcze obecność badanych mikroorganizmów.

MIANO coli – jest to najmniejsza objętość badanej wody lub ścieków, wyrażona w cm³, w której stwierdza się obecność bakterii grupy coli.

1. Oznaczanie ogólnej liczby jednostek tworzących kolonie (jtk) mikroorganizmów w 1 cm³ wody.

L = ∑ xy/ n

gdzie:

L – ilość organizmów w 1 cm³ wody

x – ilość kolonii w danym rozcieńczeniu

y – rozcieńczenie

n – ilość odczytów

Klasyfikacja wód powierzchniowych oraz warunki jakim powinny odpowiadać ścieki odprowadzane do wód:

Dz.U. Nr 116 z 16 XII 1991r.

Wartości wskaźników zanieczyszczeń śródlądowych wód powierzchniowych:

Miano coli typu kałowego:

I klasa czystości – 1,0 i powyżej

II klasa czystości – 0,1 i powyżej poz. 56

III klasa czystości – 0,01 i powyżej

Bakterie chorobotwórcze niewykrywalne w żadnej klasie poz. 57

ĆWICZENIA 05.01.12r.

BAKTERIE FERMENTACJI MLEKOWEJ

FERMENTACJA to enzymatyczny rozkład związków organicznych przebiegający bez udziału tlenu, dostarczający energii magazynowanej w postaci cząsteczek ATP.

Produktami fermentacji oprócz energii zmagazynowanej w ATP, są związki organiczne bardziej zredukowane lub utlenione niż substrat.

Wśród produktów fermentacji dominują:

Kwasy organiczne, alkohole, gazy, jak : CO₂ i H₂

np. fermentacja alkoholowa, mlekowa, masłowa, propionowa i inne.

Bakterie mlekowe wywołują właściwą fermentację mlekową, polegającą na przekształceniu cukrów, zwłaszcza prostych (głównie heksozy) w kwas mlekowy.

1. Homofermentacja mlekowa: produktem fermentacji jest prawie wyłącznie kwas mlekowy (>90%).

2. Heterofermentacja mlekowa: różne produkty – kwas mlekowy (60-90%) oraz między innymi kwas octowy, alkohole, CO₂.

Lactococcus – homofermentatywne

Leuconostoc – heterofermentatywne

Lactobacillus – homo-, heterofermentatywne

Cechy rodziny Lactobacillaceae (bakterie mlekowe):

1. Gramdodatnie laseczki

2. Nie wytwarzają przetrwalników!

3. Są nieorzęsione (brak zdolności ruchu)

4. Względne beztlenowce

5. Z cukrów wytwarzają prawie wyłącznie kwas mlekowy

6. Nie wytwarzają katalazy

7. Nie redukują azotanów

8. W podłożu wymagają adeniny, tyminy i hipoksantyny

9. Nie rozkładają białka

10. Giną w temp. 65-75⁰C w ciągu 15 minut

11. Nie fermentują sacharozy, mannitolu i gliceryny (cukry złożone)

12. Fermentują heksozy (cukry proste)

WYKORZYSTANIE BAKTERII MLEKOWYCH:

1. Przemysł mleczarski:

- ukwaszanie śmietanki spożywczej

- dojrzewanie serów podpuszczkowych

- ukwaszanie mleka przeznaczonego do produkcji serów twarogowych

- produkcja mlecznych napojów fermentowanych

1. Przemysł warzywny: kiszenie ogórków, kapusty i innych produktów.

2. Przemysł mięsny: „dojrzewanie” surowych wędlin: metka, salami.

3. Przemysł piekarniczy: produkcja zakwasów chlebowych.

4. Przemysł paszowy: produkcja kiszonek.

Barwienie preparatów z mleka i przetworów mlecznych:

Barwienie proste pozytywne: błękit metylenowy według Löfflera (roztwór wodny błękitu + KOH) – czas barwienia 10-15 minut.

Zjawisko metachromacji:

Polega na wybarwieniu z różną intensywnością, a nawet w odmiennych kolorach. Spowodowane jest asocjacją cząsteczek barwnika na różnych substancjach barwionych.

Lactobacillus sp.

Lactococcus sp.

Leuconostoc sp.

Drożdże

MIKROFLORA FERMENTOWANYCH PRODUKTÓW MLECZARSKICH

1. KWAŚNE MLEKO:

Lactococcus lactis subsp. lactis

Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris (paciorkowce)

Lactococcus lactis subsp. cremoris

Lactococcus lactis subsp. diacetilactis

- jest produktem pierwszego etapu zakwaszania,

- występują tylko formy kuliste.

Leuconostoc (heterofermentatywne)

Lactococcus (właściwe paciorkowce mlekowe)

1. JOGURT:

Lactobacillus delbrϋcki subsp. bulgaricus

Strepococcus salivarius subsp. thermophilus

- zachodzi fermentacja wysokotemperaturowa,

- występują bakterie termofilne.

Lactobacillus (długie nieprzetrwalnikujące laseczki)

Streptococcus

Bifidobacterium (zakrzywione lub lekko rozgałęzione jelitowce)

1. KEFIR:

Candida kefir (drożdże)

Leuconostoc sp.

Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus kefir

Lactobacillus lactis

Lactobacillus kefiranofaciens

Lactococcus sp.

- zachodzi fermentacja alkoholowo-mlekowa,

- występuje ok. 1% alkoholu.

Drożdże

Lactobacillus (krótszy niż w jogurcie)

Lactococcus

ĆWICZENIA 12.01.12r.

BAKTERIE FERMENTACJI MLEKOWEJ W ZAKISZONYM MATERIALE POCHODZENIA ROŚLINNEGO

Kiszenie pasz i warzyw sprzyja:

1. Rozdrobnieniu materiału

2. Stworzeniu warunków beztlenowych

3. Zaopatrzeniu bakterii mlekowych w składniki pokarmowe

MINIMUM CUKROWE – odpowiednia ilość cukru umożliwiająca wytworzenie kwasu mlekowego w ilości pozwalającej na obniżenie pH zakiszonego materiału do wartości 4,2.

MIKROFLORA FERMENTOWANYCH PRODUKTÓW POCHODZENIA ROŚLINNEGO

Ogórki:

Lactobacillus plantarum (gramdodatnie)

Lactobacillus acidophilus

Lactococcus lactis (paciorkowiec – forma kulista)

Pediococcus acidilactici (paciorkowiec)

Kapusta:

Lactobacillus brevis

Lactobacillus lactis (forma cylindryczna)

Lactobacillus bulgaricus

Enterococcus faecium (paciorkowiec)

Lactococcus plantarum

CEL ĆWICZEŃ:

Obserwacja mikroskopowa bakterii mlekowych występujących w zakiszonym materiale pochodzenia roślinnego (woda spod kiszonej kapusty i ogórków).

Barwienie złożone metodą Grama w modyfikacji Huckera.

ĆWICZENIA 19.01.12r.

SZKODNIKI FERMENTACJI MLEKOWEJ

ZESPÓŁ MIKROFLORY SZKODLIWEJ

GRUPY DROBNOUSTROJÓW	WŁAŚCIWOŚCI BIOCHEMICZNE	SPOSÓB OCHRONY
BAKTERIE GNILNE	Tlenowy i beztlenowy rozkład białek	Szybkie zakwaszanie poprzez minimum cukrowe
BAKTERIE MASŁOWE	Fermentacja masłowa	Szybkie obniżenie pH poniżej wartości 4,2
BAKTERIE CELULOLITYCZNE	Redukcja celulozy i pektyn	Zabezpieczenie minimum cukrowego
BAKTERIE RZEKOMEJ FERMENTACJI MLEKOWEJ (np. Escherichia coli)	Wytwarzanie indolu i acetony (wskaźnik złego stanu sanitarnego)	Ochrona kiszonek przed zanieczyszczeniem glebą i nawozem
GRZYBY - Oospora lactis - grzyby toksyno twórcze - drożdże	Rozkład kwasów i mineralizacja masy roślinnej do CO2 i H2O, wytwarzanie substancji toksycznych	Zachowanie warunków beztlenowych

Oospora lactis rozkłada kwas mlekowy, odkwasza środowisko i tym samym umożliwia rozkrój innych szkodników fermentacji mlekowej.

BAKTERIE FERMENTACJI MASŁOWEJ

FERMENTACJA MASŁOWA - jest typowym procesem beztlenowym, w wyniku którego przy rozkładzie węglowodanów powstaje kwas masłowy.

Jest to heterofermentacja, ponieważ oprócz kwasu masłowego i CO₂ produkowane są także:

• Kwas octowy

• Butanol

• Aceton

• Metan

• Propan

BAKTERIE MASŁOWE NALEŻĄ DO JEDNEGO RODZAJU – Clostridium, np.:

• Clostridium acetobutylicum

• Clostridium butyricum

• Clostridium falsineum

• Clostridium pasteurianum

CECHY BAKTERII NALEŻĄCYCH DO RODZAJU Clostridium:

- gramdodatnie laseczki

- beztlenowe

- przetrwalnikują

- heterotrofy

- mezofilne

JAKO SZKODNIKI WYSTĘPUJĄ W SILOSACH I PRZY DOJRZEWANIU SERÓW

Z uwagi na to, że wymagania bakterii masłowych są niemal identyczne jak bakterii mlekowych, zabezpieczenie kiszonki przed ich występowaniem jest stosunkowo trudne. Jedynie szybkie obniżenie pH do wartości mniej niż 4,2 chroni kiszonkę przed tymi bakteriami (pH = 4,2 jest wartością graniczną zakwaszania tolerowaną przez Clostridium).

DZIAŁANIE NIEPOŻĄDANE:

• Naruszenie struktury tkankowej roślin oraz rozkład ściany komórkowej, co powoduje tzw. mazistość kiszonek

• Późne wzdęcie serów

• Psucie konserw warzywnych i owocowych

• Bombaż konserw

ZASTOSOWANIE BAKTERII MASŁOWYCH

Roszarnictwo lnu, konopi i innych roślin zawierających włókna łykowe (atakują pektyny, rozluźniają strukturę tkankową i pozwalają na szybkie oddzielenie włókien celulozowych).

BARWIENIE PRZETRWALNIKÓW METODĄ SCHAEFFERA-FULTONA:

Barwienie złożone, barwienie przetrwalników.

Na wysuszony i utrwalony preparat działamy:

1. Zielenią malachitową w 5% wodnym roztworze, podgrzewając do „trzeciej pary”.

2. Po ostudzeniu preparat spłukujemy wodą.

3. Preparat podbarwiamy safraniną przez 1 minutę.

4. Preparat spłukujemy wodą, suszymy i oglądamy pod imersją.

WYNIK BARWIENIA:

- przetrwalniki wybarwiają się na kolor zielony,

- komórki wegetatywne wybarwiają się na kolor czerwony.

Bacillus sp. Clostridium sp.

komórki wegetatywne

przetrwalniki