Data wykonania ćwiczenia: 18.03.2013

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Inżynieria genetyczna – laboratorium

Sprawozdanie nr 3

1. CEL ĆWICZENIA:

Celem tego ćwiczenia było kolejno: wykonanie reakcji PCR w celu uzyskania insertu EcRDBD, elektroforeza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji w celu oszacowania jego stężenia, analityczna elektroforeza produktów PCR oraz izolacja produktów PCR metodą Clean-up.

PCR (Polymerase Chain Reaction) to metoda powielania (amplifikowania) określonej sekwencji DNA. Stosując metodę PCR możemy uzyskać miliony kopii sekwencji docelowej, pod warunkiem, że znamy sekwencje bezpośrednio do niej przylegające. Do przeprowadzenia tej reakcji, konieczna jest: para starterów, trifosforany wszystkich czterech deoksyrybonukleozydów (dNTP) i termostabilną polimerazę DNA. Jeden cykl reakcji PCR obejmuje: denaturację dwuniciowego DNA, hybrydyzację starterów z matrycą oraz właściwą syntezę DNA przy użyciu termostabilnej polimerazy DNA[1].

PCR jest metodą stosowana między innymi w medycynie, kryminalistyce lub sądownictwie. Za jej pomocą można z dużą łatwością wykryć różne wirusy lub bakterie. Na przykład można wykryć obecność wirusa niedoboru immunologicznego u ludzi, u których nie doszło do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko temu patogenowi. Stosując metodę PCR można na przykład wskazać winnego na podstawie DNA zawartego w cebulce włosa znalezionego na miejscu przestępstwa. Amplifikacja wielu genów może pomóc w ustaleniu biologicznych rodziców w sporach prawnych[1].

1. ODCZYNNIKI I APARATURA:

Odczynniki chemiczne i biochemiczne

1. Wektor pBlueScript/EcR zlinearyzowany enzymem EcoRI

2. Starter WR5 (przedni)

3. Starter WR6 (tylni)

4. Mieszanina dNTP o stężeniu 1,25 mM każdego

5. 25 mM MgCl₂

6. Bufor dla polimerazy Taq

   • 750 mM Tris-HCl (pH 8,8 w 25°C)

   • 500 mM KCl

   • 0,8% (v/v) Nonidet 40

7. Bufor TBE

   • 890 mM TRIS

   • 890 mM kwas borny

   • 20 mM EDTA

8. Bufor do nakładania próbek na żel agarozowy (bufor SB)

   • 100 mM EDTA

   • 20% (w/v) fikol 400

   • 0,25% (w/v) błękit bromofenolowy

   • 0,25% (w/v) ksylenocyjanol

9. Marker wagowy FastRuler^™ DNA Ladder, Middle Range, (MBI Fermentas)

10. Bufor TE

    • 10 mM TRIS-HCl pH 7,4

    • 1 mM EDTA

11. Odczynniki użyte do izolacji produktów PCR metodą Clean-up: roztwór G, roztwór A1.

Aparatura laboratoryjna:

1. Aparat do wykonywania elektroforezy BIO-RAD

2. 3 pipety automatyczne Eppendorf o zakresach objętości 2 μl - 20 μl, 20 μl‑200 μl oraz 200 μl - 1000 μl

3. Wirówka stołowa Eppendorf

4. Aparat do naświetlania żelu agarozowego światłem ultrafioletowym

5. Termocykler do prowadzenia reakcji PCR C-1000 Thermo Cycler

1. SKŁAD MIESZANIN WYKORZYSTANYCH W DOŚWIADCZENIU:

1. Mieszanina MIX przeznaczona na siedem reakcji PCR:

• 21 µl pBS-EcR/EcoRI (około 15 ng) – w próbce kontrolnej objętość wektora uzupełniamy wodą H₂O_{miliQ auto}

• 28,8 µl startera przedniego WR5 (50 pmol)

• 29,4 µl startera tylnego WR6 (50 pmol)

• 56 µl dNTP (C = 1,25 mM każdy)

• 14 µl MgCl₂ (25 mM)

• 35 µl buforu dla polimerazy Taq 10x

• 158,8 µl wody H₂O_{miliQ auto}

= 343,0 µl

1. Próbka do elektroforezy:

• 3 µl roztworu plazmidowego DNA po oczyszczeniu

• 7 µl buforu TE

• 2 µl buforu do próbek 6xSB

= 12 µl

1. Próbka do elektroforezy analitycznej produktu PCR:

• 5 µl próbki po PCR

• 5 µl buforu TE

• 2 µl buforu do próbek 6xSB

= 12 µl

1. SEKWENCJE STARTERÓW WYKORZYSTYWANYCH W REAKCJI PCR:

• Starter przedni (forward) -29 nukleotydów:

5’- GCC CGG (sekwencja ‘wąsa’) GGA TCC (sekwencja rozpoznawana przez enzym BamHI) gcg cca cgg gtg caa ga –3’ (sekwencja komplementarna do sekwencji cDNA genu EcR)

• Starter tylni (reverse) – 30 nukleotydów:

5’- GCC CGG GGA TCC gtc ctt ctc ctt ctg ggc -3’

Temperatura stapiania: 58 stopni Celsjusza.

1. METODYKA I OPIS DOŚWIADCZENIA:

a) reakcja łańcuchowa polimerazy

W pierwszej części doświadczenia przeprowadzono reakcję PCR. W tym celu jedna grupa przygotowała MIX, o składzie podanym w podpunkcie a) spisu mieszanin. Następnie każda grupa pobrała po 49 µl przygotowanego roztworu MIX i dodała do probówki do PCR. Dodatkowo przygotowano jedną kontrolę, w której umieszczono: 4,2 µl startera WR5; 4,2 µl startera WR6; 8 µl mieszaniny dNTP; 2 µl MgCl₂; 5 µl buforu dla polimerazy Taq oraz 25,6 µl H₂O. Wszystkie próbki wirowano przez 2 minuty przy najwyższych obrotach (13200 rpm). Po tym czasie probówki umieszczono w termocyklerze przeznaczonym do prowadzenia reakcji PCR. Ustawiono cały program i uruchomiono urządzenie. Po pierwszym cyklu denaturacji trwającym 180 sekund w temperaturze 95°C do każdej probówki dodano po 1 µl termostabilnej polimerazy DNA Taq. Jest to tak zwany gorący start, który zwiększa specyficzność reakcji. Następnie uruchomiono właściwy program PCR. Najpierw aparat przeprowadził 5 cykli, w których miały miejsce: denaturacja w 95°C przez 60 sekund, hybrydyzacja w 58°C przez 30 sekund oraz polimeryzacja w 72°C przez 30 sekund. Po tych 5 cyklach przeprowadzone zostało 15 cykli, w których miały miejsce: denaturacja w 95°C przez 60 sekund oraz hybrydyzacja i polimeryzacja w 72°C przez 60 sekund. Następnie nastąpiło dokończenie polimeryzacji w 72°C przez 120 sekund oraz schodzenie mieszaniny do 12°C.

b) elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA po oczyszczeniu i defosforylacji

W trakcie trwania reakcji polimeryzacji wylano żel do elektroforezy tworząc w nim dwa rzędy studzienek w odległości około 5 cm od siebie tak aby można było przeprowadzić elektroforezę plazmidu pGEX-2T z poprzedniego ćwiczenia oraz elektroforezę produktów PCR. Z lodówki wyjęto i rozmrożono próbki z poprzedniego ćwiczenia zwierające plazmidowy DNA oczyszczony po trawieniu i defosforylacji. Następnie przygotowano próbkę do nałożenia na żel agarozowy, o składzie podanym w podpunkcie 3.b (grupy, które w poprzednim ćwiczeniu otrzymały około 60 µl roztworu plazmidowego DNA pobrały go 6 µl zmniejszając ilość buforu TE do 4 µl). Całość krótko zwirowano w celu dokładnego wymieszania.

c) analiza elektroforetyczna produktów PCR

Po zakończonej reakcji PCR podobnie przygotowano próbkę produktów tej reakcji to elektroforezy (skład w podpunkcie 3.c). Całość również krótko zwirowano w celu dokładnego wymieszania. Mając przygotowane wszystkie próbki przystąpiono do przygotowaniu elektroforezy. W górnej części żelu nałożono po 12 µl próbek po PCR w pierwszej studzience umieszczając 5 µl markera FastRuler^™. Marker w takiej samej ilości nałożono w pierwszej studzience w dolnym rzędzie, natomiast w pozostałych studzienkach w tym rzędzie nałożono po 12 µl próbki zawierającej plazmidowy DNA. Elektorforezę prowadzono przy napięciu 80 V przez 30 minut.

d) izolacja produktu PCR (protokół Clean-Up: A&A Biotechnology)

W tym samym czasie przystąpiono do izolacji produktów PCR metodą Clean-up. Roztwór po PCR przeniesiono do czystej probówki Eppendorf i dodano do niego około 180 µl roztworu G. Zawiera on sól chaotropową dzięki czemu może on związać zawarty w roztworze DNA. Następnie mieszaninę krótko odwirowano, naniesiono na kolumnę ze złożem krzemionkowym i wirowano przez 30 sekund przy 10000 rpm. Po tym czasie kolumnę przeniesiono do kolejnej probówki Eppendorfa, a przesącz odrzucono. Na kolumnę nałożono 600 µl roztworu A1 służącego przepłukaniu DNA zatrzymanego na złożu. Probówkę z kolumną wirowano przez 30 sekund przy 10000 rpm. Po tym czasie kolumnę ponownie przełożono do czystej probówki Eppendorfa a przesącz odrzucono, na kolumnę nałożono 300 µl roztworu A1 i ponownie wirowano przy 10000 rpm, lecz tym razem przez 2 minuty. Po tym wirowaniu kolumnę ponownie przełożono do czystej probówki Eppendorfa i zwirowano jeszcze raz przy takich samych parametrach w celu dokładnego jej wysuszenia. Kolumnę przeniesiono do kolejnej probówki i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Po tym czasie na złoże nałożono 15 µl H₂O, krótko zwirowano, nałożono kolejne 15 µl H₂O, inkubowano przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i zwirowano przez 1 minutę przy 10000 rpm. Następnie przesącz przeniesiono do czystej probówki Eppendorfa jednocześnie mierząc objętość roztworu. Wyniosła ona 26 µl.

Po skończonej elektroforezie wykonano zdjęcie żelu przy długości fali około 254 nm. Okazało się, że reakcja PCR nie została wykonana poprawnie gdyż nie było żadnych prążków na zdjęciu żelu. Należało więc przystąpić to powtórzenia reakcji PCR, ale tym razem została ona przeprowadzona poprawnie, więc przystąpiono do analizy wyników doświadczenia.

1. WYNIKI ELEKTROFOREZY

Elektroforetyczna analiza plazmidowego DNA oczyszczonego po trawieniu i defosforylacji:

Elektroforetyczna analiza produktów PCR:

1. KOMENTARZ I WNIOSKI:

• Reakcję PCR wykonano aby zamplifikować domenę wiążącą DNA receptora EcR znajdującego się na dwuniciowym cDNA.

• Chlorek magnezu w odpowiednim stężeniu (aby zminimalizować ilość powstałego niespecyficznego produktu), dostarczył niezbędnych dla funkcjonowania polimerazy Taq jonów magnezu.

• Wykonano również reakcję kontrolną, która pomogła stwierdzić, że DNA nie jest zanieczyszczone innym DNA, ani też zanieczyszczenie nie występowały w zastosowanych odczynnikach – nie zaobserwowano innych prążków oprócz rozmytego na samym dole, oznaczającego użyte do reakcji startery.

• Polimerazę dodano poprzez ‘gorący start’, ponieważ enzym ten nawet w niższej temperaturze wykazuje aktywność enzymatyczną, mimo że wydajność jest znacznie obniżona. Dzięki takiemu wprowadzaniu enzymu mieszanina reakcyjna jest zdenaturowana (oczyszczona z ewentualnie występujących w niej niepożądanych białkach)

• W doświadczeniu termocykler wyposażony był w płaszcz grzejny, jednakże w starszych modelach powinno się mieszaninę zalać olejem mineralnym, aby roztwór nie parował i skład mieszaniny nie ulegał zmianie poprzez osadzanie się pary na wewnętrznej stronie wieczka eppendorfki.

• Czas syntezy był dłuższy podczas pierwszych pięciu cykli programu PCR reakcji, aby mieć pewność, że nić została zsyntetyzowana do końca. W kolejnych cyklach starter związany jest z matrycą na całej jego długości, dlatego można było zsynchronizować proces stapiania i polimeryzacji - temperatura topnienia pierwszych pięciu cykli była wyższa.

• Wynik elektroforezy oczyszczonego i defosforylowanego plazmidu pGEX‑2T ukazał te same wyniki co elektroforeza z ćwiczenia nr 1 – prążki znajdują się na tej samej wysokości (ok. 4948 pz), natomiast charakteryzują się mniejszą grubością od poprzednich, co może potwierdzać pomyślność przeprowadzonych na nich procesów oczyszczania i modyfikowania, lub utracenia części wektora podczas tych procesów (ćwiczenie nr 2).

• Wynik elektroforezy produktu PCR wyszedł pomyślnie, gdyż otrzymano oczekiwany insert o długości 321 pz, o prążkach znacznej grubości, świadczących o wydajnym procesie jego amplifikacji. Wynik ukazuje również brak innego DNA lub zanieczyszczeń, gdyż oprócz pożądanych prążków nie występują na żelu żadne inne.

• Produkt PCR oczyszczono, jednakże następnie nie poddano go analizie, więc nie da się stwierdzić, czy jego izolacja została wykonana poprawnie.

1. LITERATURA:

Piśmiennictwo

1. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer; Biochemia; wydanie szóste; Wydawnictwo Naukowe PWN; Warszawa 2009; 140-142;

2. Instrukcja do ćwiczenia nr 3 – Laboratorium Inżynierii Genetycznej

http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/133/INSTRUKCJE_2012_2013_zima/Inzynieria_Genetyczna_-_Instrukcja_3.pdf

Inne

1. Notatki z zajęć laboratoryjnych