Data wykonania ćwiczenia: 22.04.2013

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Inżynieria genetyczna – laboratorium

Sprawozdanie nr 7

1. CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia była analiza białkowych produktów ekspresji z wektora pGEX-2T i pGEX-2T/EcRDBD za pomocą elektroforezy SDS-PAGE (wg Laemlli’eg).

1. ODCZYNNIKI ORAZ APARATURA:

Odczynniki:

• Roztwory do elektroforezy w układzie Laemlli’ego (SDS-PAGE):

• 4% żel poliakrylamidowy (PAG) zagęszający:

• Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) (ROTH) 0,933 ml

• Upper Tris-HCl (pH = 6,8) 1,750 ml

• H₂O_{milliQ auto.} 4,205 ml

• SDS (10%) 0,070 ml

• APS ((NH₄)₂S₂O₈) 0,035 ml

• TEMED 0,007 ml

• 12% żel poliakrylamidowy (PAG) rozdzielający:

• Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) (ROTH) 4,000 ml

• Lower Tris-HCl (pH = 8,8) 2.500 ml

• H₂O_{milliQ auto.} 3,340 ml

• SDS (10%) 0,100 ml

• APS ((NH₄)₂S₂O₈) 0,050 ml

• TEMED 0,010 ml

• 5x bufor do elektroforezy:

• 25 mM Tris zasada

• 192 mM glicyna

• 1% (w/v) SDS

• pH powinno być równe 8,3

• Roztwór do barwienia żeli:

• 40% (v/v) metanol

• 10% (v/v) kwas octowy

• 0,2% (w/v) Coomassie Blue R-250

• Roztwór do odbarwiania żeli:

• 40% (v/v) metanol

• 10% (v/v) kwas octowy

Aparatura:

• Aparat do wykonywania elektroforezy BIO-RAD

• Termomikser Thermomixer Comfort Eppendorf

• Wirówka stołowa Eppendorf

1. METODYKA

Próbki przygotowane w poprzednim ćwiczeniu zawierające białka bakteryjne denaturowano przez okres 10 minut w temperaturze 95  w termomikserze, po czym odwirowano w wirówce stołowej Eppendorf przez okres 10 minut przy 13800 obrotach na minutę. Na żel naniesiono po 5 μl markera wagowego PMWM (MBI Fermentas) (M), oraz po 15 μl próbek zawierających białko fuzyjne GST-EcRDBD (N1/1, A, B, C, D1), próbek z białkiem GST pozbawionej ekspresjonowanej domeny wiążącej DNA EcRDBD (N1/2, D2), oraz dwóch próbek wypełniających studzienki, aby zapobiec tworzeniu się ‘uśmiechniętego żelu’ składających się jedynie z buforu 2xSB.

Elektroforezę prowadzono w żelu poliakrylamidowym o wymiarach 97 x 55 x 1,5 mm w układzie nieciągłym, składającym się z żelu zagęszczającego 4% i rozdzielającego 12%, w warunkach denaturujących. Rozdział prowadzono w buforze 1xSDS-PAGE przy natężeniu 30 mA przez czas około godziny. Po elektroforezie żel umieszczono dwukrotnie w roztworze do odbarwiania żeli przez 10 minut, tak aby odpłukać SDS. Żel następnie zabarwiono Coomassie Blue R-250 i odbarwiono poprzez moczenie w roztworze do odbarwiania żeli.

1. WYNIKI ELEKTROFOREZY

Aby przeanalizować próbki białek po elektroforezie, wykonano wykres zależności f(Rf)=logM, gdzie Rf to współczynnik retencji białek markerowych, natomiast M to masa cząsteczkowa tych białek. Zależność ta stanowi krzywą wzorcową i jest podstawą do określania masy cząsteczkowej analizowanych produktów.

Odległość wędrówki czoła próbki markerowej względem skali odniesienia kartki w programie MWord (powiększenie 100%)

Y = 6,5 cm

Przykładowe obliczenie Rf dla białka dehydrogenazy mleczanowej:

$$\mathbf{Rf =}\mathbf{\ }\frac{\mathbf{X}}{\mathbf{Y}}\mathbf{=}\frac{\mathbf{2,9}}{\mathbf{6,5}}\mathbf{= 0,446}$$

Tabela 1 - wyniki do sporządzenia krzywej standardowej

Białko	X [cm]	Rf	M [kDa]	logM [log(kDa)]
Beta – galaktozydaza	0,7	0,108	116,0	2,065
Albumina wołowa	1,4	0,215	62,2	1,794
Owoalbumina	2,1	0,323	45,0	1,653
Dehydrogenaza mleczanowa	2,9	0,446	35,0	1,544
Restryktaza Bsp98I	3,8	0,585	25,0	1,398
Beta-laktoglobulina	4,8	0,738	18,4	1,264
Lizozym	5,4	0,831	14,4	1,158

Rysunek 2 - Krzywa standardowa wyznaczona dla markera wagowego

Rysunek 4 - Wynik elektroforezy SDS-PAGE 3D

Aby wyznaczyć masę białka kontrolnego i fuzyjnego wystarczy wstawić parametry do prostej wyznaczonej z krzywej standardowej, w której y stanowi logarytm z masy cząsteczkowej, natomiast x jest współczynnikiem retencji białek:

Współczynniki retencji dla ekspresjonowanych białek:

1. $Rf_{\text{GST}} = \frac{2,5}{4,4} = 0,568$

2. $Rf_{\text{GST} - EcRDBD} = \frac{1,8}{4,4} = 0,409$

Podstawiając otrzymane dane do wzoru otrzymujemy:

1. log(M)_GST = −1, 1506 • 0, 568 + 2, 0874 = 1, 434

2. log(M)_{GST − EcRDBD} = −1, 1506 • 0, 409 + 2, 0874 = 1, 617

Tym samym masy naszych białek wynoszą:

1. M_GST = 10^log(M)_GST = 10^1, 434 = 27, 2 kDa

2. M_{GST − EcRDBD} = 10^{log(M)_{GST − EcRDBD}} = 10^1, 617 = 41, 4 kDa

Wynika z tego iż masa EcRDBD wynosi ok. 14, 2 kDa.

1. KOMENTARZ I WNIOSKI:

• Dodawany do żeli TEMED jest katalizatorem wolnych rodników APS’u (nadsiarczanu amonu)

• Dodawany APS służy do generowania wolnych rodników, które następnie atakują akrylamid i umożliwiają polimeryzację żelu.

• Bisakrylamid służy jako substancja sieciująca akrylamid

• Po wylaniu dolnego żelu nawarstwiamy wodę, aby oddzielić żel od tlenu, który poprzez dostarczenie wolnych rodników mógłby spowolnić sieciowanie.

• Glicyna znajdująca się w buforze do elektroforezy jest zagęszczaczem. W żelu zagęszczającym, którego pH wynosi 6,8, czyli jest zbliżone do pI glicyny (6,7-6,8) najszybciej poruszają się jony Cl­^-, następnie nasze skompleksowane białko z SDS, a na końcu glicyna. W ten sposób glicyna zagęszcza próbkę białka poprzez „pchanie jej”. Natomiast w żelu rozdzielającym, którego pH wynosi 8,8, glicyna występuje w formie aniony, więc wyprzedza nasze skompleksowane białko. Białko nie jest „popychane” przez glicynę i następuje jego rozdział.

• Znajdujący się w mieszaninie do barwienia żeli metanol jest rozpuszczalnikiem dla barwnika Coomassie Blue, który łączy się z białkiem.

• Znajdujący się w mieszaninie do barwienia żeli kwas octowy „wytrąca” białka w żelu, czyli utrwala ich pozycję.

• Obliczona przez nas masa EcRDBD wynosi ok. 14,2 kDa. Jest to wartość zbliżona do wartości obliczonej na podstawie instrukcji, czyli 11,6 kDa (masa GST=38556,9 Da, masa GST-EcRDBD=26986,3 Da). Nieznaczna różnica może wynikać z niedokładnych obliczeń: punkty krzywej standardowej nie leżą idealnie na linii trendu, odległość X mogła zostać zmierzona nie dokładnie. Inna przyczyną mogło być jakieś zanieczyszczenie GST‑EcRDBD.