Data wykonania ćwiczenia: 05.03.2013 r.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Enzymologia – laboratorium

Kolorymetryczne oznaczanie stężenia białka przez reakcję z barwnikiem

Coomassie Brilliant Blue G-250

1. Wstęp.

Celem ćwiczenia jest, jak podano w tytule, oznaczenie stężenia białka, dzięki jego reakcji z barwnikiem Coomassie Blue. Metoda ta nosi nazwę metody Bradford. Nasza grupa wykonała oznaczenia immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu oraz standardu immunoglobuliny G w obecności NaCl.

Mechanizm oddziaływań białka z barwnikiem nie jest dokładnie znany, ale przypuszcza się, że wiąże się on do reszt arginylowych i aromatycznych. Gdy białko zwiąże barwnik, roztwór ma zabarwienie niebieskie – maksimum absorbcji przy dł. fali 595 nm. Warto zaznaczyć, że sam błękit Coomassie, bez związanego białka ma maksimum absorbcji przy 465 nm i barwę czerwoną. Metoda Bradford nie daje liniowych wyników, więc aby takowe otrzymać należy sporządzić wykres zależności ilorazu A₅₉₅/A₄₆₅ od masy użytego standardu. Metoda Bradford, jest bardzo czuła i prosta w wykonaniu. Pozwala oznaczyć od 1 do 50 µg białka. Ponadto barwnik Coomassie nie wiąże się z krótkimi peptydami o masie mniejszej niż 3000 Da.

1. Metodyka i obliczenia.

   1. Wykonanie krzywej standardowej.

W tym celu pobrano 0,5 ml standardu i dodano do 2 ml buforu standardowego (w skład którego wchodzą 10 mM Tris i 100 mM NaCl) o pH=7,0. Zmierzono absorbancje tego roztworu przy 280 nm(A₂₈₀); wyniosła ona 0,145. Na podstawie prawa Lamberta-Beera, znając współczynnik ekstynkcji dla immunoglobuliny G – A₂₈₀^0,1%=1,5 oraz drogę optyczną (l=1 cm) wyznaczono rzeczywiste stężenie standardu (wartość należało uprzednio pomnożyć przez 5, bo do pomiarów wzięto roztwór 5-krotnie rozcieńczony):

$$c = \frac{A_{280}}{A_{280}^{0,1\%}}*l*5 = \frac{0,145}{1,5}*1*5 = 0,4835\frac{\text{µg}}{\text{µl}}$$

Następnie przygotowano serię rozcieńczeń standardu do sporządzenia krzywej standardowej. Do każdej z próbek dodano 1 ml odczynnika Bradford i inkubowano ją przez 5 min, po czym zmierzono absorbancję. Dane potrzebne do wykonania rozcieńczeń oraz pomiary absorbancji kolejnych próbek przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1. Przygotowanie standardu immunoglobuliny G oraz pomiary absorbancji próbek.

Nr próbki	mstandardu[µg] ^teoretyczna	mstandardu[µg] ^rzeczywista	Vstandardu[µl]	Vbuforu[µl]	A595*	A465	A595/A465
1	0	0	0	100	odnośnik	0,896	-
2	1	0,907	2	98	0,048	0,899	0,0533
3	2	1,934	4	96	0,082	0,872	0,09403
4	5	4,835	10	90	0,235	0,806	0,292
5	10	9,67	20	80	0,484	0,707	0,685
6	20	19,34	40	60	0,873	0,583	1,497
7	40	38,68	80	20	1,427	0,371	3,846

* Podczas pomiaru absorbancji przy 595 nm, jako próbkę od zerowania aparatu użyto tę oznaczoną nr 1, czyli zawierającą bufor i odczynnik Bradford. Natomiast podczas pomiaru absorbancji przy 465 nm, wyzerowano aparat w obecności próbki zawierającej sam bufor, bez odczynnika Bradford.

Wykonano wykres krzywej standardowej, który jest zależnością A₅₉₅/A₄₆₅ od masy użytego standardu.

Wykres 1. Zależność A₅₉₅/A₄₆₅ od masy użytego standardu.

1. Wyznaczenie stężenia:

• próbki immunoglobuliny G (o nieznanym stężeniu)

• standardu immunoglobuliny G w obecności 3 M NaCl.

Przygotowano:

• 4 probówki rozcieńczeń roztworu immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu (próbki 8-11), które dopełniono do 100 µl buforem. Objętości próbek zamieszczono w tabeli 2.

• 4 probówki standardu immunoglobuliny G (próbki 12-15), do których dodano wymienione w tabeli 2. objętości 3 M NaCl oraz dopełniono buforem w ten sposób, aby w każdej znalazło się po 10 µg białka. Dane i obliczenia dotyczące tych próbek znajdują się w tabeli 3.

Do wszystkich probówek dodano 1 ml odczynnika Bradford, inkubowano przez 5 min. w temperaturze pokojowej, po czym zmierzono ich absorbancje.

Na podstawie równania krzywej standardowej z wykresu 1. obliczono ilości (w µg) białka dla każdego z 8 roztworów:

$$m_{x} = \frac{\frac{A_{595}}{A_{465}}}{0,0934}$$

Gdzie:

- m_x - oznacza x w równaniu krzywej standardowej

- $\frac{A_{595}}{A_{465}}$ – oznacza y w równaniu krzywej standardowej

Następnie obliczono stężenie białka w każdej z próbek (8-15), ze wzoru:

$$C_{x} = \frac{m_{x}}{V_{x}}$$

Gdzie :

- V_x – oznacza całkowitą objętość próbki, która wynosiła dla każdej 100µl.

Dzieląc stężenie białka w próbce przez krotność jej rozcieńczenia, otrzymano wyjściowe stężenia białka (C_w).

Tabela 2. Wyniki pomiarów absorbancji oraz obliczeń dla immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu.

Nr próbki	Vbiałka [µl]	A595	A465	A595/ A465	mx	Cx	Cw
8	10	0,055	0,909	0,060506	0,647816	0,006478	0,064782
9	20	0,105	0,882	0,119048	1,2746	0,012746	0,06373
10	40	0,231	0,830	0,278313	2,979799	0,029798	0,074495
11	60	0,466	0,734	0,634877	6,797402	0,067974	0,11329

Tabela 3. Wyniki pomiarów absorbancji oraz obliczeń dla immunoglobuliny G w obecności 3 M NaCl.

Nr próbki	Vbiałka [µl]	VNaCl [µl]	A595	A465	A595/ A465	mx	Cx	Cw
12	20	0	0,572	0,669	0,855	9,154	0,0915	0,458
13	20	10	0,520	0,720	0,722	7,733	0,0773	0,387
14	20	20	0,480	0,738	0,6504	6,964	0,0696	0,348
15	20	50	0,405	0,754	0,537	5,751	0,0575	0,288

1. Wnioski:

W doświadczeniu skorzystano z metody Bradford, jednak znane są też inne metody kolorymetrycznego oznaczania białka, takie jak:

• Metoda Lowry’ego – składa się z reakcji biuretowej, w której wiązania peptydowe (co najmniej 2) w białku kompleksują jony Cu²⁺ co powoduje powstanie fioletowego zabarwienia (maksimum absorbcji przy 505 nm), następnie jony miedzi z tych kompleksów są redukowane odczynnikiem Folina-Ciocalteu, roztwór zmienia barwę na niebieską. Redukcja ta zwiększa czułość oznaczenia, które opiera się na samej reakcji biuretowej. Jest jednak bardziej skomplikowana od metody Bradford. Pozwala na wykrycie bardzo krótkich łańcuchów białkowych.

• Metoda BCA – również składa się z reakcji biuretowej, po niej dodaje się do roztworu kwasu bicynchoninowego, który tworzy kompleks z jonami miedzi. Intensywność zabarwienia zależy od ilości obecnego białka i zmienia się od barwy szarozielonej (dla małych stężeń) do czerwono fioletowej (dla dużych). Maksimum absorbcji roztwór uzyskuje przy 562 nm. Jest także czulsza od metody Lowry’ego oraz pozwala wykryć krótkie peptydy.

Analizując wyniki pomiarów dla immunoglobuliny G o nieznanym stężeniu, można przypuszczać, że metoda z jakiej skorzystaliśmy w ćwiczeniu nie okazuje się do końca skuteczna, ponieważ otrzymane stężenie wyjściowe dla każdej z próbek 8-11 powinno być zbliżone. Może to być także spowodowane błędem w pipetowaniu, lub niedopilnowaniem czasu reakcji (5 min). Widać, że próbka nr 11 zdecydowanie odbiega od pozostałych, więc odrzucając ją oraz uśredniając wyniki dla próbek 8-10 otrzymamy stężenie immunoglobuliny, które wynosi 0,0677 µg/µl.

W przypadku wyników pomiarów i obliczeń dla immunoglobuliny G w obecności chlorku sodu, widać że w miarę zwiększania objętości NaCl obserwujemy spadek stężenia białka, chociaż w każdej z próbek jest go taka sama ilość. Dzieje się tak, ponieważ NaCl powoduje wysalanie białka, czyli zmniejszenie jego rozpuszczalności w roztworze. Przy wysokich stężeniach chlorku sodu może dojść do wytrącenia się białka z roztworu. Można zatem wywnioskować, że metoda Bradford nie pozwoli wyznaczyć poprawnie stężenia białek, które w danym roztworze są praktycznie nierozpuszczalne.