Data wykonania ćwiczenia: 11.03.2013 r.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Enzymologia – laboratorium

Zapoznanie się z metodą określania aktywności aldolazowej wykorzystującej test hydrazynowy oraz sporządzenie nasyconego roztworu siarczanu amonu.

1. Wstęp.

Celem pierwszej części ćwiczenia było zapoznanie się z metodą określania aktywności aldolazowej wykorzystującą test hydrazynowy. Aldolaza jest enzymem należącym do klasy liaz. Katalizuje przede wszystkim reakcję rozszczepienia aldolowego. Substratem dla tego enzymu jest jedna sześciowęglowa cząsteczka 1,6‑difosforanu fruktozy (FDP), produktami reakcji są triozy: aldehyd 3‑fosfoglicerynowy (GAP) i fosfodihydroksyaceton (DHAP). Reakcja rozszczepiania aldolowego jest reakcją odwracalną i reakcja odwrotna - kondensacja aldolowa - jest wykorzystywana w procesie glukoneogenezy[1].

Wykorzystywany w tej części ćwiczenia test hydrazynowy. Test ten polega na tym, że do roztworu zawierającego siarczan hydrazyny oraz substrat jakim jest FDP dodajemy aldolaze. Następnie mierzymy zmianę absorbancji tej próbki w czasie. Absorbancję mierzymy przy długości fali 240 nm, ponieważ jest to idealna długość fali dla pomiaru stężenia hydrazonu. W czasie pomiaru w próbce zachodzi następująca reakcja:

Rysunek 1 Schemat reakcji zachodzączej w przeprowadzonym doświadczeniu, czyli rozszczepienie aldolowe z wykorzystaniem aldolazy, a nastepnie reakcja GAP z siarczanem hydrazyny. [2]

Celem drugiej części ćwiczenia było przygotowanie nasyconego roztworu siarczanu amonu. Roztwór nasycony to taki roztwór, który w określonych warunkach termodynamicznych (ciśnienie, temperatura) nie zmienia swego stężenia w kontakcie z substancją rozpuszczoną. Oznacza to, że bez zmian warunków termodynamicznych z roztworu nasyconego nie wytrąca się żaden osad, ale nie można też w nim rozpuścić więcej substancji.

1. Metodyka, opracowanie wyników i obliczenia.

   1. Część pierwsza ćwiczenia:

• Pierwszym etapem tej części było wyznaczenie stężenia aldolazy. W tym celu do dwóch kuwet odmierzono po 3 ml buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) o pH 7,2. Następnie te kuwety umieszczono w spektrofotometrze i wykonano zerowanie aparatu przy długości fali 280 nm. Jedną kuwetę (oznaczoną jako „próbka”) i dodano do niej 20 µl stężonego roztworu aldolazy i dokładnie wymieszano zawartość kuwety. Tak przygotowaną mieszaninę umieszczono w spektrofotometrze i zmierzono absorbancję przy tej samej długości fali. Wynosiła ona 0,0888. Roztwór z kuwety oznaczonej jako „próbka” przelano do probówki podpisanej „Ald” i przystąpiono do obliczeń w celu wyznaczenia stężenia aldolazy w probówce podpisanej „Ald”.

$$C_{\text{ald}}^{2} = \frac{A_{280}}{E_{280}^{0,1\%} \times l} = \frac{0,0888}{0,91 \times 1} = 0,098\frac{\text{mg}}{\text{ml}}\backslash n$$

• Drugim etapem było przeprowadzenie testu hydrazynowego. W tym celu do dwóch czystych probówek dodano po 1,5 ml 2,6 mM siarczanu hydrazyny zawartego w buforze (100 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) o pH 7,5. Następnie dodano do obu kuwet po 200 µl 30 mM fruktozodifosforanu (FDP). Tak przygotowane kuwety umieszczono w spektrofotometrze i wyzerowano aparat przy długości fali 240 nm. Następnie obydwie kuwety wyjęto z aparatu i dodano do jednej 50 µl roztworu aldolazy z probówki podpisanej „Ald” (jest to obliczona objętość odpowiadająca masie aldolazy równej około 5 µg), a do drugiej tyle samo buforu (10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA) o pH 7,2. Zawartość kuwet dokładnie wymieszano, umieszczono je spektrofotometrze i rozpoczęto pomiar absorbancji przy długości fali 240 nm. Pomiar trwał dokładnie 3 minuty, a po tym czasie wydrukowano wykresy wraz z obliczonymi przez program parametrami. Opisane czynności powtórzono jeszcze 3 razy odpowiednio dla około 2,5 µg aldolazy (25 µl roztworu z probówki podpisanej „Ald”), około 7,5 µg aldolazy (75 µl roztworu) i około 8 µg aldolazy (80 µg roztworu). Dla wszystkich pomiarów wydrukowano wykresy i dołączono do sprawozdania. Ponadto obliczono aktywność aldolazową, specyficzną i całkowitą otrzymanego preparatu. Dane potrzebne do obliczeń umieszczono w tabeli 1.

Tabela 1. Dane potrzebne do obliczenia aktywności aldolazowej, specyficznej i całkowitej. Dane pochodzą z wcześniejszych obliczeń lub zostały zaczerpnięte z wykresów.

Nr pomiaru	V1->2 [µl]	Cald^2 [mg/ml]	V2->3 [µl]	$\frac{A_{240}}{\min}$ [1/min]
1	20	0,098	50	0,05402
2			25	0,02705
3			75	0,07198
4			80	0,07741

$$\text{Akt}_{ald1}^{3} = \frac{\frac{A_{240}}{\min}}{\varepsilon_{H} \times l} = \frac{\frac{0,05402}{\min}}{2,73\ \text{mM}^{- 1} \times \text{cm}^{- 1} \times 1\ cm} = 0,0198\ \frac{\text{mM}}{\min}\backslash n$$

$$R_{2}^{1} = \ \frac{V_{3}}{V_{2 \rightarrow 3}} = \ \frac{1,75}{0,05} = 35\backslash n$$

$$R_{1} = \ \frac{V_{2}}{V_{1 \rightarrow 2}} = \frac{3,02}{0,02} = 151\backslash n$$

$$\text{Akt}_{ald1}^{1} = \text{Akt}_{ald1}^{3} \times R_{1} \times R_{2}^{1} = 0,0198 \times 151 \times 35 = 104,64\frac{U}{\text{ml}}$$

Akt_tot1¹ = Akt_ald1¹ × V₁ = 104, 64 × 1 = 104, 64 U ∖ n

$$C_{\text{ald}}^{1} = C_{\text{ald}}^{2} \times R_{1} = 0,098 \times 151 = 14,8\ \frac{\text{mg}}{\text{ml}}$$

$$\text{Akt}_{spec1}^{1} = \frac{\text{Akt}_{ald1}^{1}}{C_{\text{ald}}^{1}} = \frac{104,64}{14,8} = 7,07\ \frac{U}{\text{mg}}$$

• Wszystkie wyniki zebrano w tabeli 2.
  
  Tabela 2. Obliczone aktywności aldolazowa, całkowita i specyficzna dla poszczególnych pomiarów.

Nr pomiaru	Aktald^3 [U/ml]	R2	R1	Aktald^1 [U/ml]	Akttot^1 [U]	Aktspec^1 [U/mg]
1	0,0198	35	151	104,64	104,64	7,07
2	0,0099	69	151	103,15	103,15	6,97
3	0,0264	23,67	151	94,36	94,36	6,38
4	0,0286	22,25	151	96,09	96,09	6,49

1. Druga część ćwiczenia:

• W tej części ćwiczenia przygotowano roztwór nasycony siarczanu amonu. W tym celu na wadze laboratoryjnej odważono 90 g stałego siarczanu amonu i wsypano do kolby o pojemności 300 ml. Następnie do tej kolby wlano 100 ml 1 mM EDTA i całość ogrzewano nad palnikiem aż do rozpuszczenia całej soli. Po tym czasie roztwór przeniesiono pod włączony wyciąg i dodawano kroplami za pomocą pipety Pasteura 5 % roztwór amoniaku cały czas badając pH roztworu przy użyciu papierków uniwersalnych. Amoniaku dodawano do momentu, gdy pH wyniosło około 7,5. Gdy to nastąpiło cały roztwór przesączono przez wcześniej przygotowany lejek Buchnera, używając dodatkowo pompki wodnej. Przesączony roztwór przelano do czystej podpisanej kolby, przykryto folią aluminiową i pozostawiono do ostygnięcia.

1. Wnioski:

Obliczone w pierwszej części ćwiczenia aktywności specyficzne aldolazy różnią się miedzy sobą nieznacznie. Pierwsze dwie wartości są do siebie zbliżone, jednak dwie pozostałe od nich odstają. Wartości różniące się względem pierwszych dwóch pomiarów to wartości dla pomiarów, w których dodano największą porcję roztworu aldolazy. Tak więc różnica może wynikać z błędu pipetowania. Zdecydowanie aktywność specyficzna dla pierwszego pomiaru jest największa, mimo że to nie aktywność dla najmniejszej porcji roztworu aldolazy. Może to być spowodowane tym, że przy dodawaniu FDP do kuwet w danym pomiarze nie zmieniano tipsa do pipety, więc roztwór FDP mógł zostać zanieczyszczony buforem z siarczanem hydrazyny. Spadek aktywności specyficznej aldolazy w kolejnych pomiarach mógł być też spowodowany tym, że roztwór aldolazy był zbyt długo przetrzymywany w temperaturze pokojowej i wraz z upływem czasy tracił on swoją aktywność.

LITERATURA:

1. J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer; Biochemia, wydanie szóste; Wydawnictwo Naukowe PWN; Warszawa 2009; Rozdział 16.

2. http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_2/enzymology.pdf; 11.03.2012; 20:05