Data wykonania ćwiczenia: 09.04.2013 r.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Enzymologia – laboratorium

Identyfikacja dansylowanych aminokwasów metodą cienkowarstwowej chromatografii na płytkach poliamidowych.

1. Wstęp.

Celem przeprowadzonego ćwiczenia była identyfikacja dansylowanych w poprzednim ćwiczeniu peptydów. Dansylowanie peptydu to reakcja badanego białka z chlorkiem dansylu (DNS-Cl). Związek ten reaguje z aminami pierwszo- i drugorzędowymi znajdującymi się na N-końcu, a także z grupami łańcuchów bocznych aminokwasów, takimi jak: sulfhydrylowa cysteiny, hydroksylowa tyrozyny, ε-aminowa lizyny, imidazolowa histydyny. Tak zaznakowane aminokwasy są uwidaczniane przy użyciu długości fali z zakresu 290-380 nm.

Rysunek 1 Schemat reakcji dansylowania peptydu[1].

Chromatografia cienkowarstwowa polega na rozdzieleniu badanych związków w kilku układach różnych rozpuszczalników (w naszym przypadku układ 1: octan etylu - etanol - amoniak; układ 2: n-propanol - chloroform - 99,7% kwas octowy), a następnie poprzez wzbudzenie fluorescencji przy odpowiedniej długości fali (w naszym przypadku 254 nm). Zaletami tej metody są przede wszystkim dobra rozdzielczość, prosta i tania aparatura oraz krótki czas potrzebny do identyfikacji. Główną wadą jest niestabilność dansylowanych pochodnych po rozwinięciu w układzie rozpuszczalników, jednak na płytkach poliamidowych aminokwasy te są znacznie bardziej stabilne niż na płytkach krzemionkowych[2].

1. Wykonanie ćwiczenia.

Od asystentki pobrano próbki dansylowanych aminokwasów oraz ampułki z dansylownym peptydem. Całość dansylowanego peptydu przeniesiono do probówki Eppendorfa i umieszczono w wirówce próżniowej. Wirowanie prowadzono w temperaturze 65 °C przez 20 minut. W tym czasie oznaczono płytki poliamidowe. Na jednej z nich zaznaczono, w rogu około 1cm od krawędzi, krzyżykiem miejsce na które później nałożono peptyd, a na drugie w podobny sposób, ale kółkiem miejsce na które później nałożono mieszaninę aminokwasów. Następnie przygotowano tę mieszaninę poprzez zmieszanie w jednej probówce Eppendorf po 50 µl każdego ze sporządzonych w poprzednim ćwiczeniu aminokwasów. Probówki z mieszaniną zwirowano w wirówce stołowej, a następnie naniesiono ja na płytki poliamidowe. W tym celu użyto pipet automatycznych ustawionych na 2 µl. Naniesiono jedną kroplę w oznaczone miejsce i suszono suszarką z odległości około 25 cm aż do całkowitego wyschnięcia kropli. Następnie naniesiono następną kroplę i czynność powtórzono 7 razy. Po skończeniu wirowania probówek z peptydem dodano do nich pod wyciągiem po 10 µl pirydyny. Całość wymieszano tak, żeby osad się rozpuścił a następnie naniesiono badany peptyd na płytkę poliamidową w taki sam sposób jak pojedyncze aminokwasy.

Tak przygotowane płytki umieszczono w statywie aparatu do chromatografii. Do kuwety tego aparatu wlano 50 ml układu pierwszego, czyli: octan etylu - etanol - amoniak. Statyw umieszczono w kuwecie w taki sposób aby nie zanurzyć płytek w rozpuszczalniku. Aparat pozostawiono tak przez 15 minut w celu zrównoważenia płytek w oparach rozpuszczalnika. Po tym czasie statyw opuszczono do rozpuszczalnika i obserwowano szybkość jego przechodzenia przez płytki. W momencie gdy rozpuszczalnik dotarł do końca płytki statyw wyciągnięto z kuwety i płytki wysuszono suszarką. Jednocześnie z kuwety wylano układ pierwszy, umyto ją i umieszczono w niej 50 ml drugiego układu chromatograficznego, czyli: n-propanol - chloroform - 99,7% kwas octowy. Statyw z płytkami obrócono o 90° i umieszczono w kuwecie również nie zanurzając płytek w rozpuszczalniku. Ponownie równoważono je przez 15 minut w oparach rozpuszczalnika, a po tym czasie zanurzono je i obserwowano pasmo rozpuszczalnika. Gdy doszło ono do końca płytek zakończono chromatografie. Płytki wyjęto z kuwety, wysuszono i analizowano w świetle ultrafioletowym przy długości fali 254 nm.

Rysunek 2 Teoretyczny wynik przeprowadzonej chromatografii przedstawiający lokalizację poszczególnych aminokwasów na płytce[3].

Rysunek 3 Zdjęcie wykonanej przez nas chromatografii. Po lewej stronie znajduje się płytka z pochodnymi wolnych aminokwasów, a po prawej z badanym peptydem.

1. Wnioski:

Rozwinięcie chromatografu w dwóch kierunkach, w dwóch różnych układach rozpuszczalników pozwala na zidentyfikowanie dansylowanych pochodnych di‑lizyny, di-tyrozyny, fenyloalaniny, leucyny, izoleucyny, proliny, waliny, metioniny i glicyny[2]. W naszym przypadku na płytkę nakładaliśmy mieszaninę proliny, argininy i glicyny. Porównując zdjęcie płytki z pochodnymi wolnych aminokwasów z teoretycznym wynikiem chromatografii można zobaczyć, że chromatografia została wykonana poprawnie, gdyż na płytce znajdują się trzy punkty odpowiadające lokalizacji argininy (po lewej), proliny (u góry) i glicyny (pod proliną). Jasny punkt znajdujący się na dole płytki odpowiada wolnemu DNS.

Porównując obraz na płytce na którą nałożono pochodne wolnych aminokwasów z obrazem płytki, na która nałożono dansylowany peptyd można określić aminokwas znajdujący się na jego N-końcu. Tym aminokwasem jest glicyna, gdyż widać wyraźny sygnał na środku płytki zlokalizowany w takim samym miejscu jak sygnał dla dansylowanej glicyny na lewej płytce. Na tej płytce podobnie jak na płytce z pochodnymi wolnych aminokwasów widać wyraźną plamkę na dole płytki. Odpowiada ona pewnie podobnie jak w przypadku drugiej płytki wolnemu DNS.

Do odwirowanych w wirówce probówek zawierających dodawaliśmy 10 µl pirydyny w celu ponownego rozpuszczenia peptydu. Pirydyna jest bardzo dobrym rozpuszczalnikiem dla peptydów[4] i bardzo możliwe, że wzmacnia ona również fluorescencje dansylowanych aminokwasów.

LITERATURA:

1. http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_5/cwiczenie_5.pdf

2. http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_6/cwiczenie_6.pdf

3. http://eportal-ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_6/chromatogram.pdf

4. http://eportal‑ch.pwr.wroc.pl/file.php/148/Instrukcje/cwiczenie_6/Gray_Methods_in_Enzymology_25.pdf