AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW

PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

W WYBRANYCH

MIĘŚNIACH KURCZĄT

UTRZYMANYCH

W RÓŻNYCH SYSTEMACH

- metodyka badań

Promotor:

Dyplomant:

Dr inż. Małgorzata Korzeniowska

Anna

Włodarczyk

ENZYMY

PRZECIWUTLENIAJĄCE

• Są to specjalne enzymy

wykorzystywane do usuwania wolnych

rodników.

• Należą do nich między innymi:

Dysmutaza ponadtlenkowa
Peroksydaza glutationowa
Katalaza

DYSMUTAZA PONADTLENKOWA

(SOD)

• Wszystkie znane dysmutazy to

enzymy katalizujące reakcję
dysmutacji anionorodnika
ponadtlenkowego do nadtlenku
wodoru
i tlenu cząsteczkowego

O

2-·

+ O

2-·

+ 2H

+

 H

2

O

2

+ O

2

PEROKSYDAZA GLUTATIONOWA

(GPX)

• Substratem dla peroksydazy

glutationowej jest zredukowany
glutation (GSH), który zostaje
utleniony do disulfidu glutationu
(GSSG)

2GSH + H2O2 -> GSSG + 2 H2O

KATALAZA (CAT)

• Katalizuje ona reakcję

dysproporcjonowania nadtlenku
wodoru, prowadzących do powstania
tlenu cząsteczkowego i wody.

H

2

O

2

+ Fe

+3

-CAT -> 2H

2

O + O + Fe

+5

-CAT

H

2

O

2

+ O=Fe

+5

-CAT-> Fe

+3

-CAT + H

2

O +

O

2

AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW

PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

• Mają na nią wpływ różne czynniki,

takie jak:

Stężenie enzymu
Stężenie substratu
Inhibitory
Temperatura
pH

• Enzymy przeciwutleniające rozkładają

reaktywne formy tlenu dzięki czemu
zapobiegają różnym zmianą wywołanym w
organizmie przez ten czynnik.

MATERIAŁ BADAWCZY

• Mięśnie udowe kurcząt

Charakterystyka mięśni udowych:

 mięśnie czerwone (ciemne)
 metabolizm glikolityczno-

oksydatywny
lub wyłącznie tlenowy

CEL PRACY

• Określenie aktywności enzymów

przeciwutleniających w mięśniach
udowych kurcząt.

SCHEMAT DOŚWIADCZENIA

TKANKA

MIĘŚNIOWA

DYSMUTAZA

PONADTLENKOWA

KATALAZA

PEROKSYDAZA

GLUTATIONOWA

HOMOGENIZACJA

WIROWANIE

SUPERNATANT

OZNACZENIA

OZNACZENIE DYSMUTAZY

PONADTLENKOWEJ (SOD)

• Aktywność enzymu oznaczono metodą

spektrofotometryczną korzystając z
gotowych testów firmy Cayman.

• Doświadczenie jest oparte na śledzeniu

zmian absorbancji przy 525nm w
obecności lub nieobecności badanej próby
po dodaniu odczynnika R1 w celu
określenia maksymalnego przyrostu
absorbancji na jednostkę czasu.

REAKCJA ENZYMATYCZNA SOD

• Metoda jest

oparta na
śledzeniu
szybkości
reakcji
autooksydacj
i odczynnika
R1
katalizowane
j przez SOD

OZNACZENIE PEROKSYDAZY

GLUTATIONOWEJ (GPx)

• Aktywność enzymu oznaczono metodą

spektrofotometryczną korzystając z gotowych
testów firmy Cayman.

• Oznaczenie aktywności c-GPx polega na

dodaniu badanej próby do roztworu
zawierającego glutation (GSH), reduktazę
glutationową (GR) i NADPH.

• Początek reakcji jest po dodaniu wodorotlenku

tert-butylu i rejestruje się zmiany absorbancji
w czasie 3 minut.

REAKCJA ENZYMATYCZNA GPx

• Metoda oparta jest na

wykorzystywaniu następujących ,

sprzężonych ze sobą następujących

reakcji:

• Utlenianie NADPH do NADP

+

powoduje

spadek absorbancji przy długości fali

340nm, co pozwala na oznaczenie

aktywności GPx

OZNACZENIE KATALAZY (CAT)

• Aktywność enzymu oznaczono metodą

spektrofotometryczną korzystając z
gotowych testów firmy Cayman.

• Katalaza jest enzymem biorącym udział w

rozkładzie nadtlenku wodoru zgodnie z
reakcją:

REAKCJA ENZYMATYCZNA CAT

• Reakcję prowadzono w środowisku

buforu fosforanowego w
temperaturze 30

o

C

• Rozkład nadtlenku mierzono poprzez

spadek ekstynkcji przy długości fali
240nm w którym zakresie H

2

O

2

absorbuje promieniowanie
ultrafioletowe.

OZNACZENIA:

• Oznaczenia wykonujemy w 2
powtórzeniach
przy odpowiednich rozcięczeniach i
próbę ślepą która jest wykonywana
bez dodatku enzymu.

DZIĘKUJĘ ZA

UWAGĘ

Literatura:

1. Bartosz G. 2009. Druga twarz tlenu.

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

2. Kleczkowski M., Kluciński W., Sitarska E., Sikora J.

1998. Stres oksydacyjny i wybrane wskaźniki
stanu antyoksydacyjnego zwierząt. Medycyna
Weterynaryjna: 166 – 171.

3. Kopeć W. 2009. Przetwórstwo mięsa drobiu –

podstawy biologiczne i technologiczne: 91-94

4. www.sfd.pl/Enzymy_-

_krótka_charakterystyka_i_klasyfikacja-
t417421.html

5. pml.strefa.pl/ePUBLI/147/14.pdf – Enzymy

antyoksydacyjne bydowa, właściwośi, funkcje