Laboratorium biochemii

Wpływ temperatury na aktywność enzymów (ćw E)

1. Cel ćwiczenia

• Zbadanie wpływu temperatury na aktywność enzymów na przykładzie reakcji hydrolizy przez inwertazę zawartą w wyciągu drożdżowym.

• Zapoznanie się z jedną metod oznaczania stężenia cukrów redukujących- metodą Nelsona.

1. Odczynniki

• Roztwór inwertazy z wyciągu drożdżowego – enzym,

• 2% roztwór wodny sacharozy –substrat,

• 0,005% roztwór wodny glukozy – standard (produkt),

• 1/15 bufor fosforanowy o pH 5,6,

• Odczynnik miedziowy A (2,4% NaKC₄H₄O₆, 5%NaHCO₃, 4%Na₂CO₃, 3,6% K₂C₂O₄)

• Odczynnik miedziowy B (1,3% CuSO₄∙5H₂O),

• Odczynnik arseno-molibdenowy (5% (NH₄)₆Mo₇O₂₄∙4H₂O, 4% H₂SO₄, 0.6% Na₂HAsO₄∙7H₂O)

1. Szkło i aparatura

• Probówki kalibrowane,

• Probówki chemiczne,

• Pipety automatyczne oraz tipsy,

• Parafilm,

• Kuwety,

• Specol,

• Termostat nastawiony na 40˚C,

• Termostat nastawiony na 55˚C,

• Łaźnia z lodem(4˚C)

• Zlewka i piecyk elektryczny do przygotowania łaźni wodnej na 100˚C.

1. Wykonanie ćwiczenia

1. Przygotowanie krzywej standardowej:

1. Przygotowano 26 suchych probówek chemicznych i podpisano je zgodnie z tabelami 1 i 2 oraz łaźnię wodną na 100˚C.

2. Przygotowano odczynnik miedziowy do oznaczania stężenia glukozy: zmieszano 6 ml odczynnika A z 6 ml odczynnika B.

3. Do 16 probówek kalibrowanych, które ponumerowano zgodnie z tabelą 1, odmierzono po 0,5ml odczynnika miedziowego i pozostawiono do dalszej części ćwiczenia.

4. Do probówek 1-6 odmierzono 0,005% standardu glukozy zgodnie z tabelą 1.

5. Roztwory glukozy uzupełniono wodą destylowaną do 0,5ml zgodnie z tabelą 1.

1. Badanie wpływu temperatury na aktywność inwertazy:

1. Do 10 probówek chemicznych ponumerowanych zgodnie z tabelą 2 dodano po 0,5ml 1/15 buforu fosforanowego o pH 5,6 oraz po 5ml 2% sacharozy-substratu.

2. Próbki umieszczono w łaźniach wodnych o różnych temperaturach (zgodnie z tabelą 2) i inkubowano przez 5 min.

3. Wyjęto probówki z łaźni i przygotowano stoper.

4. Do probówek nieprimowanych dodano po 0,5 ml enzymu i zaczęto odmierzać czas (10min.)

5. Do probówek primowanych dodano po 0,5 ml wody destylowanej.

6. Wszystkie próbki dobrze zamieszano, włożono do łaźni jak wcześniej i prowadzono inkubacje dokładnie przez 10 min (od momentu ,w którym dodano enzymu),

7. Po 10 min pobrano po 0,1 ml każdej mieszaniny reakcyjnej i dodano do przygotowanych wcześniej probówek kalibrowanych z odczynnikiem miedziowym zgodnie z tabelą 1 (przerwano reakcje).

8. Do probówek 7,7’-11,11’ dodano po 0,4 ml wody destylowanej.

9. Próby 1-11’ inkubowano 20 min w 100˚C w celu stworzenia optymalnych warunków do przebiegu reakcji z odczynnikiem miedziowym.

10. Oziębiono probówki w zimnej wodzie.

11. Dodano po 0,5ml odczynnika arseno-molibdenowego i dobrze zamieszano.

12. Roztworu dopełniono wodą destylowaną do objętości 5 ml (zgodnie z podziałką na probówkach kalibrowanych) i ponownie zamieszano.

13. Odczytano absorbancje prób 1-11’ przy długości fali 660 nm wobec odnośnika (próbki 1), a wyniki zanotowano w tabeli 1.

1. Tabele pomiarowe

Nr probówki	V odczynnika miedziowego [ml]	V standardu glukozy [ml]	V H2Odest [ml]	Próby E+ S przygotowanie wg tabeli 2.	V odczynnika arseno-molibdenowego [ml]	A660	A660/kor/	Masa glukozy [μg]
1	0,5	-	0,5		0,5	odnośnik	-	0
2	0,5	0,1	0,4		0,5	0,070	-	5
3	0,5	0,2	0,3		0,5	0,106	-	10
4	0,5	0,3	0,2		0,5	0,256	-	15
5	0,5	0,4	0,1		0,5	0,149	-	20
6	0,5	0,5	-	Nr	V [ml]	0,5	0,257	-
7	0,5	-	0,4	12	0,1	0,5	0,147	0,083
7’	0,5	-	0,4	12’	0,1	0,5	0,064
8	0,5	-	0,4	13	0,1	0,5	0,336	0,297
8’	0,5	-	0,4	13’	0,1	0,5	0,039
9	0,5	-	0,4	14	0,1	0,5	0,554	0,491
9’	0,5	-	0,4	14’	0,1	0,5	0,063
10	0,5	-	0,4	15	0,1	0,5	0,543	0,472
10’	0,5	-	0,4	15’	0,1	0,5	0,071
11	0,5	-	0,4	16	0,1	0,5	0,052	0
11’	0,5	-	0,4	16’	0,1	0,5	0,052

Tabela 1.

Tabela 2.

	V buforu fosforanowego [ml]	V sacharozy [ml]	T [^ºC]	V enzymu [ml]	V H2Odesl [ml]
12	0,5	5	4	0,5	0
12’	0,5	5	4	0	0,5
13	0,5	5	25	0,5	0
13’	0,5	5	25	0	0,5
14	0,5	5	40	0,5	0
14’	0,5	5	40	0	0,5
15	0,5	5	55	0,5	0
15’	0,5	5	55	0	0,5
16	0,5	5	100	0,5	0
16’	0,5	5	100	0	0,5

Tabela 3.

Treakcji [^ºC]	A660 /kor/	mG^P [μg]	mG^M [μg]	nG^M [μmol]	Aktinwertazy [U/ml]
4	0,083	9,222	553,333	3,074	0,615
25	0,297	33,000	1980,000	11,000	2,200
40	0,491	54,556	3273,333	18,185	3,637
55	0,472	52,444	3146,666	17,481	3,496
100	0	0	0	0	0

1. Obliczenia

Stężenie masowe roztworu glukozy

Masa glukozy dla próbki 1. (pozostałe próbki analogicznie)

Wykres zależności absorbancji od masy glukozy dla próbek 1-6 /krzywa standardowa/:

Do sporządzenia krzywej standardowej wyeliminowałyśmy pomiary z próbki 4 (zaznaczone na czerwono), co znacznie polepszyło wartość R². Błędy pomiaru w próbkach 4 spowodowane są prawdopodobnie niewłaściwym przygotowaniem roztworów.

Krzywa standardowa dla ćwiczenia:

Obliczanie ΔA₆₆₀/kor/ dla próbek 7-11:

Dla próbki 7. (pozostałe próbki analogicznie):

ΔA₆₆₀ /kor/ = 0,147-0,064 = 0,083

Obliczenie masy glukozy w reakcji enzymatycznej dla próbek 7-11:

ΔA660 /kor/ = 0,009 ∙ m_G^P

$$m_{G}^{P} = \ \frac{A_{660}/kor/}{0,009}$$

Dla próbki 7. (pozostałe próbki analogicznie):

$m_{G}^{P} = \ \frac{0,083}{0,009} = 9,222$ [μg]

Obliczanie masy glukozy w próbkach 12-16:

Obliczanie dla próbki 12. (pozostałe analogicznie):

$$m_{G}^{M} = \ \frac{9,222\ \bullet 6}{0,1} = 553,333\ \lbrack\mu g\rbrack$$

Obliczanie liczności glukozy w próbkach 12-16:

$$n = \frac{m}{M}$$

Obliczanie dla próbki 12. (pozostałe analogicznie):

$$n = \ \frac{553,333 \bullet 10^{- 6}}{180} = 3,074 \bullet 10^{- 6} = 3,074\ \lbrack\mu mol\rbrack$$

Obliczanie aktywności inwertazy:

Obliczenia dla próbki 12. (pozostałe analogicznie):

$$\text{Akt}_{\text{inwertazy}} = \ \frac{3,074}{10 \bullet 0,5} = 0,615\ \lbrack\frac{U}{\text{ml}}\rbrack$$

1. Analiza wyników i wnioski

• Powyższy wykres przedstawia zależność aktywności enzymu (inwertazy) od temperatury prowadzenia doświadczenia,

• Temperatura wpływa na aktywność inwertazy,

• Początkowo aktywność enzymu wzrasta wraz z temperaturą, w zakresie temperatur ok. 40-55 ^ºC aktywność osiąga optimum, powyżej tej temperatury aktywność inwertazy spada, następuje denaturacja cieplna enzymu,

• Temperatura optymalna otrzymana w doświadczeniu jest porównywalna z danymi literaturowymi,

• Optimum temperaturowe dla inwertazy można uznać za wąskie,

• Wyznaczenie krzywej standardowej konieczne było do obliczenia zmiany ilości glukozy po dodaniu enzymu, na jej podstawie możliwe było obliczenia masy glukozy powstałej w reakcji.

• Cel ćwiczenia został zrealizowany.