WF – ćw.7

1

Ćwiczenie 7

Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz.

Oznaczenie witaminy C

A. Badanie aktywności enzymów z klasy oksydoreduktaz.

Odczynniki :

- 3% roztwór H

2

O

2

,

- roztwór KCN,
- roztwór benzydyny w kwasie octowym,
- roztwór fenolu
- roztwór pirogallolu
- odczynnik NADI (przygotować

bezpośrednio przed Użyciem, mieszając p-fenyleno-diaminę

z

α-naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml),

- bufor fosforanowy o pH 7,4,
- roztwór pirokatechiny

UWAGA!!! KCN jest silna trucizną !!!

!!!Wylewać tylko do specjalnie oznaczonego pojemnika !!!

S

PORZĄDZANIE WYCIĄGU ZIEMNIACZANEGO

Umyty i obrany ziemniak utrzeć na tarce. Miazgę włożyć do złożonej potrójnie gazy i zanurzyć w zlewce

zawierającej 200 cm

3

wody destylowanej. Zawartość zlewki łagodnie mieszać przez kilka minut. Otrzymuje się

wodny wyciąg z ziemniaka, zawierający enzymy oraz wypłukana skrobię. Po pewnym czasie, gdy skrobia opadnie

na dno zlewki, płyn należy zdekantować znad osadu i przesączyć. Część nadsączu (około 50 cm

3

) wlać do zlewki i

zagotować.

1. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI KATALAZY

Katalazy, obecne we wszystkich organizmach tlenowych, są metaloproteinami zawierającymi w swojej

cząsteczce żelazo. Katalizują rozkład H

2

O

2

. do wody i tlenu cząsteczkowego. Jest to szczególny przypadek reakcji

hydroperoksydazowej, w której H

2

O

2

jest jednocześnie donorem i akceptorem wodoru.

2H

2

O

2

→ 2H

2

O + O

2

Zasada wykrywania katalazy

Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H

2

O

2

katalizowanej przez katalazę wydzielając się z

roztworu powoduje jego silne pienienie.

WF – ćw.7

2

Wykonanie

Do trzech probówek napipetować po około 2 ml :

a - ekstraktu z ziemniaka ,
b - zagotowanego ekstraktu z ziemniaka
c - ekstraktu z ziemniaka z dwoma kroplami roztworu KCN.

Do każdej z prób dodać 5 kropli 3% nadtlenku wodoru. Gwałtownie wydzielające się pęcherzyki

tlenu są świadectwem prawidłowo przebiegającej reakcji.

2. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZ

Peroksydazy katalizują reakcję utleniania niektórych związków organicznych np. fenoli z równoczesną redukcją

nadtlenku wodoru

H

2

O

2

+ fenole → 2H

2

O + chinony

Enzymy tej grupy są odporne na temperaturę. Nie denaturują w temperaturze 70°C, inaktywują się

dopiero po ogrzaniu we wrzącej łaźni wodnej. Bogatym ich źródłem jest sok chrzanowy, a w tkankach

zwierzęcych wątroba i leukocyty.

Zasada wykrywania peroksydazy

Benzydyna w obecności H

2

O

2

ulega utlenieniu przez peroksydazę do błękitu benzydynowego, zgodnie z

poniższym równaniem reakcji

Wykonanie

Do 5 probówek odmierzyć podaną w tabeli objętość ekstraktu z ziemniaka, benzydyny, H

2

O

2

, KCN i H

2

O. Do

probówki nr 4 dodać zagotowany ekstrakt. Zawartość probówek wymieszać i postawić na 20 min. w temperaturze

pokojowej. Obserwować zachodzące zmiany i zanotować wyniki.

Próba

nr

Wyciąg

(ml)

Woda

(ml)

Benzydyna

(ml)

KCN

H

2

O

2

(ml)

1 2,5 0

0,1 0 0,1

2 2,5 0,1

0 0 0,1

3 2,5 0

0,1

2

krople

0,1

4 2,5 0

0,1 0 0,1

5 2,5 0,1 0,1 0 0

WF – ćw.7

3

3. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ

Oksydaza cytochromowa jest enzymem występującym w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, stanowi końcowy

element łańcucha oddechowego w komórce. Jej podstawowym zadaniem jest przeniesienie elektronów na tlen w

celu jego aktywacji. Enzym ten jest hemoproteiną zawierającą również atomy miedzi.

Zasada wykrywania aktywności oksydazy cytochromowej

Obecność oksydazy cytochromowej w ekstrakcie tkankowym można wykazać w reakcji, w której wykorzystywany

jest odczynnik NADI. W skład odczynnika wchodzą:

α-naftol i p-fenylenodiamina zmieszane w stosunku 1:1. W

wyniku nieenzymatycznej redukcji zawartego w mitochondriach cytochromu c przez

p-fenylenodiaminę powstaje p-fenylenodiimina, która w obecności

α -naftolu przechodzi w barwny, niebieski

kompleks.

Wykonanie

Do 4 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości poszczególnych roztworów; do probówki nr 4 dodać

zagotowany nadsącz. Próby starannie wymieszać i pozostawić na 30 min w temperaturze pokojowej. Obserwować

powstanie niebieskiej barwy. Wyniki zapisać w tabeli.

Próba

nr

Wyciąg

(ml)

Woda

(ml)

Bufor pH 7,4

(ml)

KCN

NADI

(ml)

1 1 0

1 0 0,1

2 1 0

1

1

kropla

0,1

3 1 0,1 1 0 0
4 1 0

1 0 0,1

4. W

YKRYWANIE AKTYWNOŚCI OKSYDAZY POLIFENOLOWEJ

Oksydazy katalizują odrywanie się elektronów od utlenianego substratu i dwu- lub czteroelektronową redukcję

cząsteczki tlenu. Produktami reakcji katalizowanych przez te enzymy jest woda lub nadtlenek wodoru. Substratem

w reakcjach utleniania mogą być m.in. o- i p-difenole. Powstają chinony, a w wyniku ich kondensacji tworzą się

barwne pochodne. Oksydaza fenolowa, zwana również oksydazą polifenolową, tyrozynazą lub katecholazą, jest

metaloproteiną i zawiera miedź, która przyjmuje elektrony od difenoli i przekazuje na tlen cząsteczkowy.

Zasada wykrywania oksydazy polifenolowej

Oksydaza polifenolowa utlenia pirokatechinę do chinonów, które kondensując dają ciemnobrunatne zabarwienie.

WF – ćw.7

4

Wykonanie

Do 5 probówek odmierzyć podane w tabeli objętości ekstraktu z ziemniaka, wody, buforu, pirokatechiny

i 4% roztworu KCN. Do probówki nr 4 dodać ekstrakt zawierający termicznie denaturowane białka. Zawartość

wszystkich probówek starannie wymieszać, zanotować czas i pozostawić w temperaturze pokojowej. W celu

lepszego dostępu tlenu, próby od 1-4 co pewien czas wstrząsnąć. Po 20 min zanotować wyniki reakcji.

Próba

nr

Wyciąg

(ml)

Woda

(ml)

Bufor pH 7,4

(ml)

KCN

Pirokatechina

(ml)

1 1 0

1 0 0,1

2 1 0,1 1 0 0
3 1 0

1

2

krople

0,1

4 1 0

1 0 0,1

5 1 0

1 0 0,1

Do 2 probówek wlać po 5 cm

3

wyciągu ziemniaczanego. Następnie do probówek wprowadzić kolejno:

do pierwszej – 10 kropli 1% roztworu fenolu,
do drugiej – 10 kropli 1% roztworu pirogallolu.

Zawartość probówek zmieszać i obserwować zmianę zabarwienia.

UWAGA: Podobny efekt obserwuje się bez powyższych odczynników, np. na obranym ziemniaku, który po

pewnym czasie sinieje, ponieważ obecne w nim związki typu o-difenoli ulegają utlenieniu.

5. Wrażliwość peroksydaz i oksydaz na temperaturę

Do trzech probówek odmierzyć po 5 cm

3

wyciągu ziemniaczanego. Wszystkie probówki ogrzewać na łaźni wodnej

o temperaturze 70°C przez 10 min. Następnie dodać:

do pierwszej probówki 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny,
do drugiej probówki 10 kropli 1% roztworu pirokatechiny i 3% roztworu nadtlenku wodoru.

Zanotować wyniki reakcji.

B. Oznaczanie witaminy C

Kwas L-askorbinowy (witamina C) jest

związkiem krystalicznym, dobrze rozpuszczalnym

w wodzie a jego roztwory mają kwaśny smak.

Wykazuje właściwości redukujące. Jego forma

utleniona to kwas dehydroaskorbinowy.

Układ oksydoredukcyjny kwas askorbinowy ↔ kwas dehydroaskorbinowy może uczestniczyć

w regulowaniu potencjału oksydoredukcyjnego w komórce i brać udział w transporcie elektronów.

Ponieważ witamina C występuje w znacznych ilościach w gruczołach nadnercza, przypuszcza się, że

uczestniczy ona w syntezie hormonów sterydowych. Witamina C uczestniczy w produkcji kolagenu

i podstawowych białek w całym organizmie (kości, chrząstki, ścięgna, więzadła). Jako jeden

WF – ćw.7

5

z najważniejszych przeciwutleniaczy pełni także istotną funkcję w reakcjach odtruwania i odporności

organizmu chroniąc go przed procesami utleniania, uczestniczy w metabolizmie tłuszczów, cholesterolu

i kwasów żółciowych.

Wśród metod oznaczania witaminy C można wyróżnić

metody fizykochemiczne: chromatografia

cieczowa, metoda spektrofotometryczna i metoda potencjometryczna oraz metody chemiczne.

Odczynniki:

- r-r 2,6-dichlorofenolindofenolu (

2,6-DPIP)

- 1%

FeCl

3

- 1%

K

3

Fe(CN)

6

- 1% witamina C

- 1% i 2% kwas szczawiowy

- 10% kwas trichlorooctowy (TCA)

- 2%

H

2

SO

4

- 10%

NaOH

- odczynnik

Folina

- 10%

HCl

1. Reakcja z żelazicyjankiem potasu

Przygotować dwie próbówki. Do pierwszej dodać 5 kropli 1% r-ru witaminy C, a do drugiej 5 kropli

wody. Następnie do obydwu próbówek dodać 1 kroplę 10% NaOH i 1 kroplę 1% żelazicyjanku potasu.

Zawartość probówki wymieszać, a następnie dodać 3 krople 10% HCl i 1 kroplę 1% FeCl

3

. Obserwacje

zanotować w zeszycie.

2. Oznaczanie witaminy C metodą Folina

Zasada oznaczenia

W obecności kwasu askorbinowego kwas fosfomolibdenowy (VII) ulega redukcji do mieszaniny

niższych tlenków molibdenu – błękitu molibdenowego. Odczynnik ten jest również specyficznie

redukowany przez kwas askorbinowy w pH 1-7. W tym zakresie pH i poza witaminą C inne reduktory

obecne w płynach ustrojowych i tkankach nie redukują go.

Wykonanie

1. Otrzymanie homogenatu

Każdy 1 g tkanki zalać 1 cm

3

10% TCA, a następnie homogenizować przez 5 minut. Osad

odwirować przy 3000 obr./min

2. Przygotowanie krzywej wzorcowej

WF – ćw.7

6

Przygotować krzywą standardową poprzez wykonanie szeregu rozcieńczeń roztworu wzorcowego

kwasu askorbinowego o stężeniu 0,1mg / cm

3

według tabeli :

Stężenie kwasu

askorbinowego

0

μ

g/ml 2,5

μ

g/ml 5

μ

g/ml 12,5

μ

g/ml 25

μ

g/ml 35

μ

g/ml

R-r wzorcowy [ml]

0 0,05 0,1 0,25 0,5 0,7

10% TCA [ml]

2,0 1,95 1,9 1,75 1,5 1,3

Do przygotowanych prób dodać po 0,2 ml odczynnika Folina i natychmiast po dodaniu energicznie

zamieszać.

3. Oznaczenie witaminy C w materiale biologicznym

Do oznaczeń pobrać 0,2-0,5 ml supernatantu. Objętość prób uzupełnić do 2 ml 10% TCA,

a następnie dodać 0,2 ml odczynnika Folina i energicznie zamieszać

Absorbancję mierzyć przy długości fali 750 nm względem próby zerowej. Obliczyć ilość witaminy C

w badanym materiale biologicznym. Obliczyć ilość materiału biologicznego, który zaspokajałby

dzienne zapotrzebowanie dorosłego człowieka na tę witaminę.

Badany materiał biologiczny

Ilość zaspokajająca dzienne zapotrzebowanie na wit. C

dorosłego człowieka [g]

3. Oznaczanie witaminy C metodą Tillmansa

Zasada oznaczenia

Metoda Tillmansa oparta jest na redukcji barwnika 2,6-dichlorofenoloindofenolu przez kwas

askorbinowy. Utleniony DCIP jest niebieski, zredukowany bezbarwny. Reakcja przebiega według

równania:

Oznaczanie kwasu askorbinowego polega na miareczkowaniu próby badanej w kwaśnym

środowisku (zapobiega to samoutlenieniu kwasu askorbinowego tlenem z powietrza oraz chroni przed

działaniem oksydaz). Barwnik jest zarazem indykatorem, po wyczerpaniu kwasu askorbinowego zabarwia

on próbę miareczkowaną na kolor różowy. Wiadomo, że większość

surowców roślinnych zawiera

barwniki antocyjanowe, które nadają

ekstraktom witaminy C różowe zabarwienie, a także mają

WF – ćw.7

7

właściwości redukujące. Ponadto w produktach, w których oznaczany witaminę

C, występują inne

związki ulegające utlenieniu podczas miareczkowania odczynnikiem Tillmansa. Należą

do nich reduktony

– związki obdarzone silnymi właściwościami redukującymi, które należy przypisywać

obecności

ugrupowania endiolowego. W przypadku oznaczania witaminy C w owocach i warzywach oraz ich

przetworach mamy do czynienia z reduktonami białkowymi (aminokwasy lub białka zawierające grupy

sulfhydrylowe, które są

utleniane przez odczynnik Tillmansa do wiązań disulfidowych) oraz cukrowymi

(pochodne cukrów, które powstają

podczas obróbki termicznej).

Wykonanie

1. Wyznaczanie miana roztworu 2,6-dichlorofenolindofenolu (2,6-DPIP)

Pobrać 25 ml wzorcowego roztworu kwasu askorbinowego (4 mg kwasu w 100 ml 2% kwasu

siarkowego) i zmiareczkować roztworem 2,6-dichlorofenolindofenolu do jasnoróżowego

zabarwienia utrzymującego się przez 30 sek.

2. Oznaczanie zawartości witaminy C w badanych próbkach

2-3 g jabłka, zhomogenizować z 20 ml 1% kwasu szczawiowego. Po homogenizacji roztwór

uzupełnić do objętości 100 ml 1% kwasem szczawiowymi przesączyć. 25 ml klarownego

przesączu miareczkować w kolbie stożkowej mianowanym roztworem 2,6-

dichlorofenoloindofenolu do uzyskania różowego zabarwienia utrzymującego się przez 30 sekund.

Z równania reakcji kwasu askorbinowego z 2,6-DPIP wynika, że 1 ml roztworu barwnika odpowiada

0,5 μmola kwasu tj, 0,088 mg. Korzystając z tej zależności oraz znając dokładne stężenie roztworu

barwnika należy wyliczyć ilość witaminy C w badanej próbce. Wynik podać w miligramach

przypadających na 100 g materiału roślinnego. Otrzymane dane porównać z wartościami literaturowymi.