AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW

PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

W WYBRANYCH

MIĘŚNIACH KURCZĄT

UTRZYMANYCH

W RÓŻNYCH SYSTEMACH

- metodyka badań

Promotor:

Dyplomant:

Dr inż. Małgorzata Korzeniowska

Anna

Włodarczyk

ENZYMY

PRZECIWUTLENIAJĄCE

• Są to specjalne enzymy

wykorzystywane do usuwania wolnych

rodników.

• Należą do nich między innymi:

Dysmutaza ponadtlenkowa
Peroksydaza glutationowa
Katalaza

DYSMUTAZA PONADTLENKOWA

(SOD)

• Wszystkie znane dysmutazy to

enzymy katalizujące reakcję
dysmutacji anionorodnika
ponadtlenkowego do nadtlenku
wodoru
i tlenu cząsteczkowego

O

2-·

+ O

2-·

+ 2H

+

 H

2

O

2

+ O

2

PEROKSYDAZA GLUTATIONOWA

(GPX)

• Substratem dla peroksydazy

glutationowej jest zredukowany
glutation (GSH), który zostaje
utleniony do disulfidu glutationu
(GSSG)

2GSH + H2O2 -> GSSG + 2 H2O

KATALAZA (CAT)

• Katalizuje ona reakcję

dysproporcjonowania nadtlenku
wodoru, prowadzących do powstania
tlenu cząsteczkowego i wody.

H

2

O

2

+ Fe

+3

-CAT -> 2H

2

O + O + Fe

+5

-CAT

H

2

O

2

+ O=Fe

+5

-CAT -> Fe

+3

-CAT + H

2

O +

O

2

AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW

PRZECIWUTLENIAJĄCYCH

• Mają na nią wpływ różne czynniki,

takie jak:

Stężenie enzymu
Stężenie substratu
Inhibitory
Temperatura
pH

• Enzymy przeciwutleniające rozkładają

reaktywne formy tlenu dzięki czemu
zapobiegają różnym zmianą wywołanym w
organizmie przez ten czynnik.

MATERIAŁ BADAWCZY

• Mięśnie udowe kurcząt

Charakterystyka mięśni udowych:

 mięśnie czerwone (ciemne)
 metabolizm glikolityczno-

oksydatywny
lub wyłącznie tlenowy

CEL PRACY

• Określenie aktywności enzymów

przeciwutleniających w mięśniach
udowych kurcząt.

SCHEMAT DOŚWIADCZENIA

TKANKA

MIĘŚNIOWA

DYSMUTAZA

PONADTLENKO

WA

KATALAZA

PEROKSYDAZA

GLUTATIONOW

A

HOMOGENIZAC

JA

WIROWANIE

SUPERNATANT

OZNACZENIA

OZNACZENIE DYSMUTAZY

PONADTLENKOWEJ (SOD)

• Metoda oznaczenia polega na śledzeniu

szybkości reakcji autooksydacji odczynnika
R1
katalizowanej przez SOD. Wodny roztwór
powstałego chromagenu (pH 8,8) absorbuje
światło widzialne przy λ

max

=525nm.

Interferencje związków zawierających wolne
grupy
-SH są eliminowane przez dodanie
odczynnika R2

OZNACZENIE PEROKSYDAZY

GLUTATIONOWEJ (GPx)

• Metoda polega na dodaniu próby

supernatantu do roztworu zawierającego
glutation (GSH), reduktazę glutationową
(GR)
i NADPH. Początek reakcji enzymatycznej
jest w momencie dodania wodorotlenku
tert-butylu i rejestruje się zmiany
absorbancji
przy λ

max

=340nm w czasie 3 minut.

OZNACZENIE KATALAZY

• Do oznaczenia pobierano 25 ηl próby

supernatantu, 975 ηl buforu
fostoranowego oraz 500 ηl 10mM
H

2

O

2

lub do próby ślepej bufotu

fosfotanowego.
Następnie mierzono absorbancję przy
λ

max

=240nm od razu po dodaniu

nadtlenku i następnie po minucie

OZNACZENIA:

• Oznaczenia wykonujemy w 2
powtórzeniach
przy odpowiednich rozcieńczeniach i
próbę ślepą która jest wykonywana
bez dodatku enzymu.

DZIĘKUJĘ ZA

UWAGĘ

Literatura: