Wstęp teoretyczny

Laktoza C₁₂H₂₂O₁₁, zwana również cukrem mlekowym, jest disacharydem zbudowanym
z D-galaktozy i D-glukozy, połączonych wiązaniem β-1,4-glikozydowym.

Wzór pierścieniowy laktozy	Wzór krzesełkowy laktozy

Rozkład laktoz następuje pod wpływem wody w środowisku kwaśnym lub z udziałem enzymy laktazy, według równania reakcji:

Zawartość procentowa laktozy w mleku:

• krowim – 3,5 do 4,8%

• ludzkim – 5,5 do 7,5%

W produktach takich jak zsiadłe mleko, kefir, jogurty czy sery, obecność laktozy jest znacznie ograniczona, gdyż pod wpływem bakterii mlekowych (np. Lactobacillus bulgaricus) ulega ona fermentacji z wytworzeniem kwasu mlekowego.

Wolną laktozę można wyodrębnić z serwatki odtłuszczonego zsiadłego mleka poprzez oddzielenie twarogu, zagęszczenie roztworu i krystalizację. Ma ona postać bezbarwnego lub białego, bezwonnego proszku, mniej słodkiego niż glukoza i sacharoza. Topi się w temperaturze 225°C.

Metody oznaczeń wykorzystane w ćwiczeniu

Roztwory laktozy wykazują właściwości redukujące, ponieważ glukoza w jej cząsteczkach wciąż posiada wolną jednostkę hemiacetalową. W związku z tym jej zawartość oznacza się z wykorzystaniem chemicznych metod redukcyjnych, takich jak np. metoda Bertranda oraz Schoorla-Luffa. Uprzednio należy jednak przygotować w odpowiedni sposób badane próby do oznaczeń.

Przygotowanie próby do oznaczeń

Badane rozwory zawierają z reguły wiele substancji przeszkadzających w metodach analitycznych, stąd należy je oczyścić. Substancje przeszkadzające, takie jak barwniki, białka, lipidy oraz inne substancje niesacharydowe o właściwościach redukcyjnych usuwa się przez klarowanie i odbarwianie.

W przypadku oznaczania sacharydów metodami chemicznymi jedną z najlepszych metod odbiałczania i klarowania (usuwania związków wielkocząsteczkowych: białek, pektyn, garbników) jest metoda Carreza. Stosuje się w niej dwa roztwory Carreza w jednakowych objętościach:

• I – heksacyjanożelazian (II) potasu;

• II – siarczan (VI) cynku (II);

W trakcie klarowania zachodzi następująca reakcja:

2 ZnSO₄ + K₄Fe(CN)₆ → Zn₂Fe(CN)_6↓ + 2 K₂SO₄

Powstający w reakcji koloidalny heksacyjanożelazian (II) cynku (II) opadając w formie osadu

strąca wraz ze sobą związki wielkocząsteczkowe.

Metoda Bertranda - stosowana do oznaczania sacharydów w roztworach silnie zabarwionych.

W metodzie tej stosuje się trzy roztwory Bertranda:

• I – siarczan (VI) miedzi (II);

• II – winian potasu i sodu oraz wodorotlenek sodu;

• III – siarczan (VI) żelaza (III) w stężonym kwasie siarkowym (VI).

Oznaczenie polega na ilościowej redukcji jonów Cu⁺² do Cu⁺¹ przez sacharydy zawierające w cząsteczce wolne grupy redukujące, które zachodzi w środowisku silnie alkalicznym (pH ok. 12) i w temperaturze wrzenia roztworu. Wytworzone jony miedzi (I) ulegają utlenieniu w reakcji z roztworem Bertranda do jonów Cu⁺², a jony Fe⁺³ redukcji do jonów Fe⁺². Ilość jonów Fe⁺² oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem nadmanganianiu potasu: Ilość roztworu nadmanganianiu potasu zużytego na miareczkowanie jonów Fe⁺² odpowiada stechiometrycznie ilości sacharydów redukujących zawartych w badanym roztworze.

Reakcje zachodzące w poszczególnych etapach oznaczania:

• Po dodaniu roztworu Bertranda I oraz II:

CuSO₄ + 2NaOH → Na₂SO₄ + Cu(OH)₂

Cu(OH)₂ + C₄H₄KNaO₆ → Cu(C₄H₂KNaO₆) + 2H₂O

• Podczas gotowania roztworu sacharydu z roztworami Bertranda I oraz II:

R-CHO + 2 Cu(C₄H₂KNaO₆) + 2H₂O R-COOH + 2C₄H₄KNaO₆ + Cu₂O↓

• Po dodaniu płynu Bertranda III do powstałego osadu Cu₂O:

Cu₂O + Fe₂(SO₄)₃ + H₂SO₄ 2CuSO₄ + 2FeSO₄ + H₂O

• Podczas miareczkowania roztworem nadmanganianu potasu:

2 KMnO₄ + 10FeSO₄ + 8H₂SO₄ K₂SO₄ + 5Fe₂(SO₄)₃ + 8H₂O + 2MnSO₄

Metoda Schoorla-Luffa

Oznaczenie to opiera się na reakcji redukcji jonów Cu⁺² zawartych w płynie Luffa przez sacharydy redukujące obecne w badanym roztworze. Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym (pH ok. 9,5) w temperaturze wrzenia.

Skład płynu Luffa:

• siarczan(VI) miedzi(II) (CuSO₄ · 5H₂O);

• węglan sodu (Na₂CO₃ · 10H₂O);

• kwas cytrynowy (C₆H₈O₇ · H₂O).

W środowisku zasadowym sacharydy redukują siarczan (VI) miedzi (II) do tlenku miedzi (I). Wprowadzenie do roztworu jodku potasu (KI) i kwasu siarkowego (VI) powoduje wydzielenie jodu:

2 CuSO₄ + 4 KI → 2 K₂SO₄ + Cu₂I₂ + I₂

Ulega on reakcji z niezredukowanym przez sacharydy siarczanem (VI) miedzi (II) i powstaje jodek miedzi (I). Nadmiar jodu (z dodatku KI) odmiareczkowuje się tiosiarczanem (VI) sodu (Na₂S₂O₃):

I2 + 2 Na₂S₂O₃ → 2 NaI + Na₂S₄O₆

W tym oznaczeniu wykonuje się ślepą próbę, aby ustalić zużycie roztworu tiosiarczanu(VI) sodu na zmiareczkowanie jodu wydzielonego przez całkowitą ilość miedzi zawartej w płynie Luffa. Objętość tiosiarczanu (VI) sodu odpowiadająca ilości miedzi (II) podlegającej redukcji przez sacharydy oblicza się jako różnicę objętości uzyskanych z dwóch miareczkowań (próby ślepej i właściwej), a następnie z odpowiednich tablic odczytuje się zawartość sacharydów redukujących w analizowanej próbce.

Opracowanie wyników

1. Część 11a. Oznaczanie zawartości laktozy metodą Bertranda

Na podstawie średniej objętości zużytego KMnO₄ otrzymanej z miareczkowej nie różniących się więcej niż 0,2 cm³ obliczamy ilość zredukowanej miedzi korzystając ze wzoru:

M_Cu= 6,354 · a

M_Cu - ilość zredukowanej miedzi w mg

6,354 - ilość mg miedzi odpowiadająca 1 cm³ 0,02 M roztworu KMnO₄

a - średnia objętość zużytego do miareczkowania 0,02 M roztworu KMnO₄

Zestawienie otrzymanych wyników:

Objętość zużytego KMnO4 [cm^3]	Średnia objętość zużytego KMnO4 [cm^3]
26,8	26,725
26,65

M_Cu = 6,354 · 26,725 = 169,81 ≈ 170 [mg]

Z tabeli zamieszczonej w normie /PN-67/A-86430/, dotyczącej badań chemicznych mleka i przetworów mlecznych odczytujemy ilość miedzi zredukowanej i odpowiadającą jej ilość cukru:

Ilość Cu [mg]	Ilość cukru [mg]
166	93,17
167	93,82
168	94,47
169	95,12
170	96,77

Obliczamy procentową zawartość laktozy w mleku:

m_laktozy= 97,77 mg

m_mleka= 25,19 g= 2519 mg

$$\frac{\mathbf{97,77}}{\mathbf{2519}}\mathbf{}\mathbf{100}\mathbf{\% =}\mathbf{3}\mathbf{,}\mathbf{96}\mathbf{\%\ }\mathbf{\approx}\mathbf{4\%}$$

1. Część 11b. Oznaczanie zawartości laktozy metodą Schoorla-Luffa

Zestawienie wyników:

Charakterystyczna zmiana barwy roztworu z ciemno brązowego	Objętość zużytego Na2S2O3 [cm^3]
	Próba ślepa
na kremowy (piaskowy) – moment dodania skrobii	11
na szary	19

Na podstawie uzyskanych wyników z próby ślepej oraz właściwej obliczamy objętość potrzebną do odczytu ilości laktozy:

V_{do odczytu z tabeli}=V_proba slepa−V_{proba badana}

V_{do odczytu z tabeli}=19 17 = 2 [cm³]

Liczba cm^3 tiosiarczanu sodu	Ilość laktozy [mg]
1	3,6
2	7,3
3	11,0
4	14,7

Obliczamy procentową zawartość laktozy w mleku:

m_laktozy= 7,3 mg

m_mleka= 25,19 g= 2519 mg

$$\frac{\mathbf{7,3}}{\mathbf{2519}}\mathbf{}\mathbf{100}\mathbf{\% =}\mathbf{0,3}\mathbf{\%\ }$$

Wnioski

Prawidłowa zawartość laktozy w mleku krowim mieści się w przedziale 3,5-4,8 %.

Oznaczenie zawartości laktozy metodą Bertranda wykazało jej obecność w badanej próbie na poziomie 4%. Jest to wartość prawidłowa i świadczy o dobrej jakości badanego mleka. Natomiast w oznaczeniu laktozy metodą Schoorla-Luffa uzyskaliśmy skrajny wynik: 0,3%. Świadczyłoby to o niezadowalającej jakości przebadanego mleka.

Różnica wyników w dwóch przeprowadzonych oznaczeniach laktozy może wynikać z błędu np. oka ludzkiego podczas odczytywania ilości roztworów zużytych podczas miareczkowań. Może także świadczyć o niedoskonałości którejś z używanych metod.