techniki 27.11.2014

RNA.RNA. Robi tupu tup bo to RNA.

PLIMERAZY RNA

• bora udzial w syntezie RNA na matrycy DNA - transkrypcji

• sa tworcze - niczego nie niszcza

• synteza zachodzi od konca 5' do 3'

• musza miec scisle zaznaczoy poczatek transkrypcji, koniec - niekoniecznie

• wymagaja obecnosci dUTP

• glowne etapy przebiegu transkrypcji:

  • niespecyficzne wiazanie z DNA

  • poszukiwanie promotora genu

  • zwiazanie z promotorem genu

  • rozplecenie DNA (transcription buble)

  • synteza RNA - na nici antysensownej

  • teminacja syntezy "naturalnie" przez utworzenie sie struktury spinki do wlosow lub pprzy pomocy faktora rho

    *nic sensowna jest odzwierciedleniem kod bialka

    - sekwencja konsensusowa - spaja wszystkie inne, jest wynikiem usrednienia tego co wystepuje we wszstkich innych niciach najczesciej - hamulec RNAz

    miejsce +1 - miejsce strartu transkrypcji

    miejsca na "-" - miejsce promotora genu, mierzone od miejsca startu transkrypcji

    POLIMERAZY RNA - procaryota

• RNA polimeraza E.coli

  • holenzym zlozony z 4 podjednostek (gwarantujacych elongacje) i 1 podjednostki niezbednej do inicjacji transkrypcji:

    • alfa - skladanie enzymu

    • beta - podjednstka katalityczna

    • beta' - wizanie DNA

    • omega - utrzymywanie aktywnosci enzymu

    • sigma - rozpoznawanie promotora

    • rho - faktor odpowiedzialny za rozpoznanie terminacji - opcjonalna

  • po rozpoznaniu promotora genu syntetyzuje singe strand RNA do sekwencji terminatorowej; wymaga Mg2+

  • w labolatorium zawsze uzywamy polimeraz prokariotycznych

• RNA polimeraza Faga SP6 9

  • produkowana przez Salmonella typhimurium LT2 zakazona fagiem SP6

  • pojedynczy polipeptyd 96kDa

  • polimeraza rozpoznaje tylko promotor SP6

  • "produkuje" osmiokrotna ilosc RNA w stosunku do DNA - ma duza moc

  • nie przerywa transkrypcji przy nacieciach matrycy

  • wymaga Mg2+

• RNA polimeraza faga T3

  • produkowana przez zrekombinowane plazmidem pCM56 E.coli zawierajace gen polimerazy T7

  • pojedynczy polipeptyd 98kDa

  • polimeraza rozpoznaje specyficznie promotor T7 (plazmidowy)

  • "produkuje" trzydziestokrotna losc RNA w stosunu do matrycy DNA

  • wymaga Mg2+

    po co takie dziwe polimerazy?

    - w specyficzny plazmid z miejscem otwartym mozemy dodac "insert", czyi gen jakiegos konkretnego bialka - chcemy zbaczyc jego RNA,

    - te polimerazy zredukowane nie sluza do zadnych naturanych procesow

    POLIMERAZY RNA - Eucaryota

• zbudowane sa z minimum 12 podjednostek

• RNA polmeraza I

  • geny kodujace rybosomalny RNA

  • strukturalne skladniki rybosomow

  • kodowane przez zespoly genow tworzacych jaderka

  • potrzebne w bardzo duzych ilosciach

• RNA polimeraza II

  • geny kodujace bialka

  • syntetyzuje RNA na matrycy genow kodujacych biaka

  • aktywnosc regulowana przez sekwencje TATA box, elementy regulacyjne i enhacery (aktywatory transkrypcj)

  • mRNA powstaje z transkryptu w wyniku dojrzewania

• RNA polimeraza III

  • geny tRNA i 5sRNA

  • promotory da tej polimerazy znajduja sie w orebie sekwencji kodujacej

• Polimeraza mtRNA

  • produkowana w j komorkowym i transportowana do mitochondriow

  • sklada sie tylko z dwoch podjenostek: sigma oraz poodjednostki indentycznej z RNA polimeraza T7