Aglutynacja -reakcja zachodząca w organizmie, mająca na celu usunięcie cząsteczek (np. bakterii, komórek) rozpoznawanych jako obce. Pod wpływem szczególnych przeciwciał (aglutynin) dochodzi do zlepiania się obcych cząstek i powstawania ich większych skupisk, przez co układ odpornościowy organizmu łatwiej może je usunąć. Zjawisko aglutynacji wykorzystywane jest w diagnostyce laboratoryjnej i w rozpoznawaniu niektórych chorób oraz przy oznaczaniu grup krwi.

aglutynacja szkiełkowa - test jakościowy, najczęściej służy do wykrywania nieznanych antygenów przy pomocy znanych przeciwciał swoistych. Stosowany jest rutynowo w identyfikacji szczepów, tzw. typowaniu serologicznym, np. Salmonella, Shigella, E. coli. Pozwala określić gatunek lub serotyp. Wykonanie: na szkiełko podstawowe daje się kroplę surowicy zawierającej swoiste przeciwciała, następnie rozprowadza ezą identyfikowany szczep bakterii. W ciągu 1 - 2 min. powstaje aglutynacja. Obowiązkowo należy zrobić kontrolę szczepu w fizjologicznym roztworze NaCl - nie powinna powstać aglutynacja (szczep gładki), jeżeli powstaje - jest to szczep szorstki, z którym nie można wykonać aglutynacji, bo daje tzw. pseudoaglutynację. W przypadku użycia krwinek (oznaczanie grup krwi) mówimy o hemaglutynacji.

Studenci wykonują aglutynację szkiełkową - typują enteropatogenne szczepy E. coli oraz krwinki barana

*aglutynacja probówkowa - służy najczęściej do wykrycia i ustalenia miana przeciwciał w surowicy przy pomocy znanych antygenów. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy w fizjologicznym roztworze NaCl, np. 1:10, 1:20, 1:40, 1:80....(rozcieńczenia ustala się w zależności od spodziewanego miana). Następnie do probówek dodaje się stałą zawiesinę antygenu, inkubuje 18 godz. w temp. 37o C i odczytuje w aglutynoskopie.

Miano przeciwciał jest to najwyższe rozcieńczenie surowicy, w której stwierdza się jeszcze aglutynację.

Klasycznym przykładem wykorzystania aglutynacji probówkowej jest odczyn Widala, stosowany w diagnostyce duru brzusznego i paradurów. Wykrywamy przeciwciała przeciwko antygenom somatycznym O (aglutynacja grudkowa) i antygenom rzęskowym H (aglutynacja obłoczkowa). Inne odczyny: Wrighta - w diagnostyce brucelozy, Wiel-Felixa - w diagnostyce duru plamistego.

1. Aglutynacja szkiełkowa

• Badanie grup krwi

• Test na Ag ściany kom („0”) Salmonella

1. Aglutynacja probówkowa

• Miano aglutynacji: największe rozcieńczenie surowicy, w którym zajdzie aglutynacja

• Odczyn lateksowy: krążki lateksowe opłaszczone Ig-anty-Streptococcus A

Aglutynacja płytkowa

• Płytka opłaszczona anty-ludzkim IgM

• Dod. Surowicę pacjenta

• Przyłączają się IgM z surowicy

• Dod. Kulki opłaszczone Ag wirusa

• Kulki przyłączają się do IgM anty-wirusowych (a jeśli ich nie ma, opadają na dno)

Miano aglutynacji: największe rozcieńczenie surowicy, w którym zajdzie aglutynacja

Miano przeciwciał w surowicy = miano surowicy surowicy w której zachodzi jeszcze aglutunacja.

Przebieg aglutynacji zależy od następujących czynników:

• pH

• temperatura (aglutyniny "zimne" to przeciwciała klasy IgM, które najlepiej wiążą aglutynogen w zakresie 4-22 stopni Celsjusza, aglutyniny "ciepłe" natomiast są przeciwciałami IgG i wiążą one najlepiej antygeny w temperaturze zbliżonej do naturalnej ciepłoty ciała)

• czas (zwykle zawiera się w przedziale 15-60 minut). Jest on również uzależniony od działania czynników zewnętrznych jak np. wstrząsanie, mieszanie, wirowanie, przy czym użycie tych działań zmniejsza czas zlepiania.

• siła jonowa (zazwyczaj im mniejsza siła jonowa, tym lepiej aglutyniny łączą się z aglutynogenami)

PERCYPITACJA

Precypitacja antygenu to jeden z podstawowych procesów łączenia się antygenu ze swoistym względem niego przeciwciałem w warunkach in vitro. W odpowiednich warunkach tak powstałe kompleksy (antygen-przeciwciało) wypadają z roztworu w postaci osadu (zmętnienia).

WARUNKI DO ZAJSCIA PERCYPTACJI:

- Stężenie reagentów reakcji:

W celu wytrącenia osadu konieczne jest stosunkowo duże stężenie obu reagentów. Dodatkowo stężenie immunoglobulin jak i antygenów powinno być ze sobą w równowadze. W przypadku, gdy mamy zbyt duże stężenie immunoglobulin lub antygenów w środowisku reakcji, ulegają one niepełnej precypitacji powodując powstawanie kompleksów rozpuszczalnych (nadwyżka któregokolwiek z reagentów powoduje powstawanie kompleksu rozpuszczalnego, zatem osad nie wytrąca się). Gdy stężenia znajdują się we względnej równowadze, na obszarze w którym ta równowaga występuje (tzw. obszarze ekwiwalentnym) tworzy się osad precypitatu.

Gdy dana reakcja charakteryzowana jest przez bardzo wąski zakres stężeń przy którym zachodzi precypitacja (reakcja o małym zakresie ekwiwalencji) powstały precypitant przyjmuje postać osadu kłaczków, a reakcja ta będąca odmianą reakcji precypitacji przyjmuje miano flokulacji, a przeciwciała biorące udział w takiej reakcji nazywane są przeciwciałami flokulującymi.

- Stężenie elektrolitu indukującego precypitację:
Za optymalny elektrolit często uważa się roztwór NaCl. Jednak zależnie od przeprowadzanej reakcji należy dobrać jego optymalne stężenie. Nie może być ono zbyt duże, gdyż tworzenie precypitatu w takich warunkach może być utrudnione - antygeny będą przyłączały mniej przeciwciał.

- pH środowiska reakcji:
Za optymalne uważa się pH mieszczące się w zakresie 6,4 - 8,5.

- Czas reakcji:
Sama reakcja powstawania kompleksu antygen-przeciwciało przebiega stosunkowo szybko. Jednak wytworzenie precypitatu (jego sieci) potrzebuje znacznie dłuższego czasu inkubacji (do kilku godzin).

- Temperatura:
Zależnie od rodzaju badanego kompleksu optimum temperaturowe może przyjąć inną wartość. Dla surowic ludzkich optimum takim jest 37 st.C

- Obecność białek układu dopełniacza:
Obecność białek tych może powodować zwiększenie rozpuszczalności precypitatu, zatem badaną surowicę przed badaniem powinno poddać się inaktywacji.

PODZIAL reakcji percypitacji:

Reakcje precypitacji można podzielić zależnie od przyjętej metody na odczyny ilościowe jak i jakościowe, a także ze względu na charakter środowiska, w którym przeprowadzana jest reakcja na odczyny w środowisku płynnym oraz stałym (immunodyfuzja).

Odczyny precypitacyjne w środowisku płynnym:

- precypitacja pierścieniowa: odczyn jakościowy, wykorzystywany w mikrobiologii w celu klasyfikacji bakterii. Mechanizm jego polega na wykrywaniu antygenów bakteryjnych w ekstraktach z tkanek. Metoda może wykorzystywana być również w celu wykrycia swoistych przeciwciał. Oba reagenty nawarstwia się na siebie (np. w probówce), poczym sprawdza się czy na granicy faz obu roztworów pojawia się zmętnienie w postaci pierścienia. Jeśli odczyn jest dodatni (pojawia się pierścień precypitacyjny), świadczy to o obecności w środowisku reakcji przeciwciała swoistego względem określonego antygenu, lub odwrotnie, w zależności od tego, jakiego reagentu obecność chcieliśmy zdiagnozować.

- precypitacja szkiełkowa:odczyn jakościowy, wykorzystywany w bakteriologii w celu identyfikacji szczepów bakteryjnych. W celu przeprowadzenia próby na szkiełko nakrapia się roztwór antygenu i surowicy zawierającej przeciwciała. Jeśli odczyn jest dodatni, na dnie kropli pojawia się precypitant.

- odczyn flokulujący (test kłaczkujący): odczyn jakościowo-ilościowy, stosowany w diagnostyce kiły. Próba polega na przeprowadzeniu reakcji surowicy chorego z antygenem kardioliponowym. Jeśli odczyn reakcji jest dodatni, tzn. pojawia się osad luźnych kłaczków, to świadczy to obecności w surowicy pacjenta przeciwciał skierowanych przeciw antygenom kiły.

Odczyny precypitacyjne w środowisku stałym (immunodyfuzja):

- pojedyncza immunodyfuzja probówkowa: odczyn jakościowy stosowany w celu wykrywania określonych antygenów lub swoistych przeciwciał. Jeden z reagentów - przeciwciało - unieruchomiony jest w żelu, w głąb którego dyfunduje antygen. W strefach ekwiwalencji, jeśli odczyn reakcji będzie dodatni, pojawią się pierścienie precypitacyjne.

- podwójna immunodyfuzja probówkowa: odczyn jakościowy stosowany w celach podobnych jak powyższa metoda. Przeciwciała zatopione są w żelu. Od roztworu antygenu warstwa ta oddzielona jest dodatkową, obojętną warstwą żelu. Oba reagenty - przeciwciała jak i antygeny - dyfundują w głąb warstwy obojętnej. W strefach ekwiwalencji, jeśli odczyn reakcji jest dodatni, powstaną pierścienie precypitacyjne.

- pojedyncza immunodyfuzja płytkowa: odczyn ilościowy, stosowany w celu określenia stężeń interesujących nas białek zawartych w surowicy. Przeciwciała związane są w żelu, a ich stężenie w każdym punkcie płytki jest stałe. W otworach wydrążonych w podłożu umieszcza się roztwory badanego białka (antygenu), które podczas inkubacji swobodnie dyfundują w głąb żelu. W strefie przyzbiornikowej stężenie antygenu jest duże, a wraz z trwającą dyfuzją będzie malało, wskutek wiązania cząsteczek antygenu przez przeciwciała znajdujące się w podłożu. W strefie ekwiwalencji powstaną pierścienie precypitacyjne, których kwadrat promienia jest wprost proporcjonalny do stężenia danego antygenu.

- podwójna immunodyfuzja płytkowa: metoda stosowana w celu określenia stopnia podobieństwa antygenowego badanych białek. Próba przeprowadzana jest w żelu, w którym umiejscawia się roztwór antygenu i surowicy (po przeciwległych stronach). W zależności od potrzeb badania można badać różne surowice i jeden antygen, lub różne antygeny z jedną surowicą. Oba reagenty mogą swobodnie dyfundować w głąb żelu. W strefach ekwiwalencji reagentów pojawią się charakterystyczne łuki precypitacyjne, których kształt pozwala na interpretacje podobieństwa antygenowego badanych białek. Jeżeli linie precypitacyjne łączą się łukowato to białka są identyczne antygenowo, jeżeli krzyżują się to są one całkowicie różne.

1. Podwójna dyfuzja według Ouchterlony'ego

Zarówno antygeny, jak i przeciwciała mają zdolność swobodnej dyfuzji w żelu agarozowym lub agarowym. Po naniesieniu ich do oddzielnych, okrągłych otworków o identycznej średnicy, położonych w standardowej odległości 1 cm, będą się rozchodzić w żelu promieniście we wszystkich kierunkach. W miejscu spotkania antygenu i specyficznego względem niego przeciwciała, gdy ich proporcje są optymalne, tworzą kompleksy antygen-przeciwciało, które następnie ulegają precypitacji i są widoczne w postaci białych, lekko opalizujących linii precypitacyjnych (łuków precypitacyjnych).

Test Ouchterlony'ego pozwala stwierdzić:

• czy przeciwciało jest swoiste w stosunku do analizowanego antygenu

• czy w roztworze znajduje się antygen zdolny do rekcji z przeciwciałem znanej specyficzności

• stopień podobieństwa antygenowego na podstawie położenia powstałych łuków precypitacyjnych

Aglutynacja

---