Biotechnologia 5
SZTUCZNE NASIONA
Istnieją dwie podstawowe technologie produkcji sztucznych nasion, różniące się stopniem uwodnienia materiału roślinnego:
pierwsza wykorzystuje materiał uwodniony, natomiast druga wymaga dehydratacji materiału roślinnego. Odwodniony materiał jest otoczkowany w hydrożelach lub zatapiany w płynnym żelu syntetycznym.
z kolei odwodniony materiał może być pokrywany syntetycznym polioksyetylenem i suszony strumieniem powietrza lub bez udziału żelu bezpośrednio suszony o eksykatorze
CO ROZUMIEMY PRZEZ POJĘCIE SZTUCZNE NSIONA?
Obecnie termin ten oznacza szersze niż tylko zarodki somatyczne i obejmuje układ składający się z zaczątka rośliny (pąk wierzchołkowy lub włośnikowy, grudki kalusa embriogennego) umieszczonego w osłonce ochraniająco-odżywczej, zdolnego do regeneracji roślin na skalę komercyjną. System produkcji sztucznych nasion gwarantuje zachowanie genetycznej jednolitości potomstwa i zapewnia uzyskanie w porównaniu z mikrorozmnażaniem niezwykle dużego współczynnika rozmnażania.
Sztuczne nasiona:
pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia (odwodnienie)
otoczkowanie zarodki podczas desykacji (odwodnienie)
uwodnione zarodki (merystemy wierzchołkowe) otoczkowane kapsułą z żelu !!!
otoczkowane zarodki zanurzone w płynnym żelu
Potencjalne znaczenie:
Znaczenie takich nasion w ogrodnictwie, rolnictwie i leśnictwie jest ogromne i wynika z właściwości jakimi charakteryzuje się dobry materiał siewny wolny od patogenów, nadający się do długotrwałego przechowywania, łatwy w transporcie. Za pomocą tej techniki można namnażać materiał elitarny roślin mieszańcowych lub roślin, których namnażanie w sposób tradycyjny jest niemożliwe lub utrudnione. Mogą to być rośliny transgeniczne, odmiany segregujące.
Otoczkowanie nasion:
unieruchomienie fragmentu tkanki
zminimalizowanie funkcji życiowych
ochrona przed niekorzystnymi czynnikami środowiska
ochrona przed utlenianiem i destylacją
ochrona przed uszkodzeniami mechanicznymi podczas transportu i siewu
możliwość wprowadzenia regulatorów i mikroflory, pestycydów
Pochodzenie hydrożeli:
polisacharydowe (najczęściej stosowane)
organiczne żele (poliakrylamidowe)
żele białkowe (żelatyna, polimer glutaraldehydowy lub formaldehydowy)
Pochodzenie chemiczne wiązań żeli funkcjonujących:
żele powstają przez krzyżowe wiązania jonowe odpowiednio naladowanych polimerów (alginian, chizotan, karaginian)
żele powstają dorgą zmiennej lub gorącej polimeryzacji (agar, agarowa, karaginian)
żele powstają droga chemicznej reakcji (poliakrylamidy, formaldehydy)
Agar - polisacharyd ekstrahowany z różnych gatunków dużych czerwonych wodorostów
Otoczki alginianowe:
alginiany otrzymywane są z ogromnych brązowych alg morskich Macrocytis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową dają alginian sodu.
Kiedy jiny Na+ zastąpimy jonai dwuwartościowymi, np. Ca2+, Ba2+, Sr2+, Zn2+, Al3+ tworzy się siec polimerowa pomiędzy jonami. Powstają wiązania krzyżowe miedzy grupami karboksylowymi a molekułami polisacharydowymi. Proces jest termoniezależny i bardzo dobrze w strukturę żelu dopasowuje się wapń.
Procedura postępowania:
Suspensje komórek miesza się w temperaturze pokojowej ze sterylnym roztworem alginianu sodu 2-3%
Nastepnie mieszaninę wkrapla się do roztworu chlorku wapnia (50-300 mM CaCl2)
Perełki o określonej średnicy (0,5-5mm) utwardza się przez kilkanaście minut do kilku godzin
Powleka się je dodatkowo warstwą hydrofobową
Na etapie kiełkowania otoczki rozpuszcza się w EDTA lub buforze cytrynianowym (fosforanowym)
Kiełkowanie i konwersja
Kiełkowanie - oznacza zdolność do formowania korzonka zarodkowego
Konwersja - to róznoczesty rozwój korzonka zarodkowego i merystemu pędu z wytworzeniem rośliny o fenotypie właściwym dla danego garunku
Otoczki karaginianowe
Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigatrina
Procedura pozyskiwania:
25% roztworu karaginianu podgrzewa się do temperatury 450C, a po schłodzeniu miesza się w/w roztwór z suspensja komórek
Następnie wkrapla się zawieszone w karaginianie komórki do roztworu KCl (kąpiel utwardzająca)
Perełki 2-4mm utrzymuje się w KCl przez 1-5h
Inne otoczki:
Celuloza i jej pochodne
Chitozan !!!
Żelifikujące gumy
Pektyny
Podwójne otoczkowanie (np. alginiany, pektyniany)
Najnowsze otoczki hydrofobowe
Tulanox®
Cab-o-sil®
Elwax® 426, 310, 410 (kolipolimer etyleno-winylooctowy)
Biokapsuły!!!! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego , imitujące osłonkę nasienną z kutikulą)
Efektywność maszyny do otoczkowanie
500 000 sztucznych nasion o średnicy 80nl dziennie
Maszyna otoczkuje zarodki somatyczne pomidorów, bawełny, petunii i ogórka, sałaty, papryki, tytoniu
Masowe nasadzenie kultur in vitro
Pinus radiata - Nowa Zelandia
Sequoia sempervirens - Francja
Daglezja - Kanada, USA
Abies alba - Dania
Morwy
Drzewa sandałowe
Uratowano wiele roślin reliktowych , np. tysiącletnie okazy cyprysów (Upressus dupreziana, rzadkie eukaliptusy, sekwoje)
Rodzaje nasion:
Ortodoks - genotypy, które można poddać wysuszeniu
Rekalcitrant - genotypy bardzo wrażliwe (nie tolerują wysuszenia
W fazie dojrzewania zarodki somatyczne poddawane są działaniu ABA
Etapy wytwarzania sztucznych nasion:
Uzyskanie i namnażanie materiału wyjściowego
Dojrzewanie i hartowanie (przygotowanie materiału do suszenie i otoczkowanie). GA3 i ABA zapewniają prawidłowy wzrost zarodka , odporność na dehydratację oraz zapobiegają przedwczesnemu kiełkowaniu. Hartowanie polega na osuszeniu lekkim schłodzeniu.
Odwadnianie - eksykator lub glikol polietylenowy
Otoczkowanie - otoczka pełni funkcję „sztucznego bielma”, a dodatkowo osłonka hydrofobowa „okrywę nasienną”
Wysiew - w zależności od typu sztucznych nasion, przenosi się je do warunków in vitro w celu dalszego przechowywania lub wysiewu do gruntu in vitro
Etapy wytwarzania sztucznych nasion
Roślina macierzysta
↓
Eksplantat
↓
Indukcja i proliferacja kalusa embriogennego
↓
Namnażanie komórek w zawiesinie embriogennej
↓
Synchronizacja stadiów embriogenezy i hartowanie zarodków somatycznych
↓
Filtrowanie
↓
Suszenie
↓
Otoczkowanie
↓
Wysiew sztucznych nasion in vivo lub in vitro
Koszty produkcji:
Cena 1 nasiona lucerny:
Bioreaktor (pełna automatyzacja) - 0,00026$
Ręczne otoczkowanie - 0,068$
Kawa:
Interesująca cena 100 razy wyższa
Produkcja roczna za 12 bilionów$ (60 mln worków) głównie C. arabica i C. canephora
Kawa należy do roślin ortodoks
Problemy technologii sztucznych nasion:
Indukcja zarodków somatycznych( dodatek różnych substancji m.in. aminokwasów)
Faza dojrzewania zarodków i konwersji → podstawa ABA
Problem O2
Wysychanie otoczek
Stopniowe uwodnienie nasion !!!
Koszty produkcji
Próby wytworzenia Bio-kapsuł
Ze względu na fazę wdrożeniową na dzien dzisiejszy namnaża się przez sztuczne nasiona : hybrydy ryżu, geranium, europejskie odmiany ogórka, gerberę, kawę, lucernę.
Potencjalne korzyści:
Szybkie namnażanie pożądanej linii
Gwarancja genetycznej jednolitości roślin
Bezpośrednie transplantowanie tkanki do gleby
Dostarczanie i namnażanie zmiennych (niestałych) genotypów takich jak rośliny transgeniczne o wysokiej niestabilności genetycznej
Dostarczanie sterylnych linii
Redukcja kosztów związanych z wegetatywnycm rozmnażaniem linii elitarnych
Możliwość masowej produkcji tkanki embriogennej z Komorek poddanych inżynierii genetycznej
Szybkie potwierdzenie transformacji genetycznej w regenerowanych roślinach
Możliwość wykorzystanie embrionów do kriokonserwacji w ciekłym azocie najlepszych linii produkcyjnych lub jako materiał do banku genów
BANKI GENÓW
Przechowywanie materiału roślinnego:
Krótkoterminowe - przechowywanie materiału roślinnego w niskiej temperaturze (ok. 40C) przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach
Długoterminowo:
W temperaturze - 700C zamrożenie przemian metabolicznych chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utlenienia tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach
W temperaturze -1960C (temperatura ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności
Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów
Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy:
wzrost wstępny
krioprotekcja (krioprezerwacja)
zamrażanie
przechowywanie właściwe (-1960C)
odmrażanie
przywrócenie właściwego tępa wzrostu komórką
Krioprezerwacja zapewnia zachowanie stabilności genetycznej materiału na bardzo długi okres czasu stąd z powodzeniem stosowana jest do przechowywanie tkanek roślinnych , sztucznych nasion, roślin transgenicznych, ginących gatunków, itp.
Wzrost wstępny
Kultury prowadzi się na pozywka o obniżonym potencjale chemicznym wody (sacharoza, glukoza) oraz przy niskiej zawartości azotu (komórki są małe i słabo zwakuolizowane)
Krioprotekcja
Przed zamrożeniem usuwa się nadmiar wody z komórek i przestrzeni międzykomórkowych. Uzyskuje się ten efekt nasączając tkanki roztworami gliceryny, sacharozy, dwumetylosulfomianem DMSO, aminokwasem proliną lub glikolem polietylenowym. Możliwe jest łączenie krioprotektantów w formie 2 lub 3 składników.
Zamrażanie
zamrażanie metoda konwencjonalną:
zamrażanie wstępne (od 0 do -400C). Optymalne tępo schładzania 0,5-20C/min. zależy od stopnia odwodnienia struktury i krystalizacji wody w karioprotektancie
zamrażanie właściwe
Metoda odwodnienia:
Struktury roślinne ulegają odwodnieniu (dehydratacji) w temperaturze pokojowej
Zamrożenie w ciekłym azocie
Metoda wutryfikacji:
Umieszczenie tkanki w silnie tężonych roztworach krioprotektantów (odciąganie wody od przestrzeni międzykomórkowych i do roztworu)
Zamrażanie w ciekłym azocie
Odmrażanie:
Odmrażanie przeprowadza się przez gwałtowne przeniesienie do temperatury 400C żeby zapobiec ponownemu powstaniu kryształków lodu (w zależności od procedury 20-400C)
Przezywalność zakonserwowanego materiału zależy od:
Tolerancji na dehydratację i działanie skoncentrowanych roztworów odwadniających
Odpornośc na zamrażanie protoplasu (cecha uwarunkowana genetycznie)
Stopnia uwodnienia i wielkości zamrozonej struktury.
Banki genów
Świat
Holandia, Francja, Anglia, Belgia
Polska
Leśny Bank Genów w Kostrzycy
Ochrona różnorodności biologicznej:
Konwencja o Biologicznej Różnorodności (szczyt Ziemi w Rio de Janeiro 1992)
Zakłada ochronę zasobów genowych (bioróżnorodności) występujących na kili ziemskiej na 3 poziomach
Ex situ (poza naturalnym środowiskiem)
In situ (w naturalnym ekosystemie)
In vitro (w szkle)
Zasoby genowe podlegają ciągłym fluktuacjom:
Zmniejszaniu się (erozja genetyczna)
Powiększaniu się o nowe genotypy (rośliny transgeniczne, mieszańcowe, haploidy)
Strategia ochrony zasobów genowych roślin, zwierząt i innych organizmów żywych
Ochrona różnorodności biologicznej
Ex situ:
Banki genów (banki roślinnych kultur in vitro)
Kolekcje polowe
Ogrody botaniczne i arboreta
Rozmnażanie
Reintrodukcja i introdukcja
In situ
Rezerwaty przyrody
Parki narodowe
Parki krajobrazowe
Ogrody przyrodnicze
Gospodarstwa rolne i leśne
Zachowanie zasobów genetycznych in vitro:
Techniki kultur in vitro umożliwiają mikrorozmnażanie i średnio lub długoterminowe przechowywanie materiału roślinnego w bankach genów roślinnych
Izolowane komórki, tkanki zmodyfikowane genetycznie, haploidy, rośliny użytkowe, rzadkie lub ginące gatunki, kolekcje ogrodów botanicznych lub arboretów, roślin transgenicznych przechowuje się w :
W warunkach powolnego wzrostu
Warunkach kriogenicznych
W postaci sztucznych nasion