MAKROCZĄSTECZKA W ROZTWORZE

LABORATORIUM

Ćwiczenie 6

Wyznaczanie parametrów makrocząsteczki za pomocą chromatografii żelowej

Data wykonania ćwiczenia: 11.05.2010

CEL ĆWICZENIA

Celem ćwiczenia było zapoznanie z układem do pomiarów z zastosowaniem chromatografii żelowej oraz ponanie możliwości jakie niesie stosowanie tej metody analitycznej.

WSTĘP TEORETYCZNY

Chromatografia żelowa zwana również filtracją żelową stosowana jest do rozdziału makrocząsteczek różniących się masą cząsteczkową lub do oddzielania ich od składników niskocząsteczkowych np. sole (odsalanie) lub związki używane do znakowania białek.

Kolumna chromatograficzna wypełnia się złożem w postaci ziarenek o średnicy około 0,1 mm o zdefiniowanej wielkości porów zbudowanych z nierozpuszczalnego polimeru (typu: dekstran, agaroza) lub poliakrylamidu. Po nałożeniu na żel mieszaniny, cząsteczki o małych rozmiarach wnikają do wnętrza ziaren duże natomiast nie mogą. Droga do momentu wycieku z kolumny, którą musi pokonać każdy ze składników próbki jest więc nierówna. Cząsteczki o najmniejszym ciężarze cząsteczkowym mają do pokonania najdłuższą drogę i dlatego wypływają najpóźniej z kolumny. Cząsteczki o dużej masie cząsteczkowej i o efektywnej średnicy większej niż pory ziaren złoża mają do pokonania krótszą drogę w żelu i wędrują najszybciej. Pojawiają się zatem jako pierwsze u wylotu kolumny.

Warunki rozdziału

Do filtracji żelowej najczęściej stosuje się kolumny o długości 50-90 cm, wraz ze wzrostem długości kolumny zmniejsza się szybkość rozdziału białek. Objętość nakładanej próby nie powinna przekraczać 5% całkowitej objętości kolumny. Skład buforu elucyjnego nie wpływa bezpośrednio na rozdział białek, ale w celu zmniejszenia oddziaływań jonowych pomiędzy złożem a rozdzielanymi związkami nie stosuje się buforów o sile jonowej słabszej niż 0,02M.

WYKONANIE ĆWICZENIA I OPRACOWANIE WYNIKÓW

1. Przygotowanie roztworów standardów oraz próbek wybranego polimeru - poliakryloamidu.

2. Włączenie układu do chromatografii żelowej.

3. Sprawdzenie poprawności linii podstawowej.

4. Ustawienie parametrów pomiaru (czas zbierania danych, temperatura, itd.)

5. Nastrzyknięcie próbki mieszaniny standardów.

6. Wyznaczenie czasu retencji i sporządzenie z otrzymanego chromatogramu metody obliczeniowej dla kolejnych próbek.

7. Nastrzyknięcie próbki badanego polimeru.

8. Wyznaczenie czasu retencji dla badanego polimeru.

9. Wyznaczenie ciężaru cząsteczkowego i innych parametrów badanego polimeru na podstawie otrzymanych metod obliczeniowych.

10. Wyznaczenie ciężaru cząsteczkowego badanego polimeru na podstawie jego czasu retencji i czasów retencji standardów.

WYNIKI DOŚWIADCZENIA

Badana próbka		Ciężar cząsteczkowy [kD]	Czas retencji [min]
Mieszanina standardów	Standard I	20,3	52,32
		Standard II	78,45	47,77
		Standard III	219,3	45,2
Badany polimer		X	24,71

KRZYWA KALIBRACYJNA

WYZNACZENIE MASY CZĄSTECZKOWEJ BADANEGO POLIMERU

Na podstawie krzywej kalibracyjnej:

WNIOSKI

Udało nam się zrealizować cel ćwiczenia, jakim było wyznaczenie ciężaru cząsteczkowego badanego polimeru. Na podstawie naszego doświadczenia wartość ta wynosi 845,75 kD, co jest wartością mało prawdopodobną, gdyż nie da się zauważyć analogii pomiędzy punktami pomiarowymi.

---