W3

ABZYMY (dodatkowo seminarium)

Są to katalityczne przeciwciała występujące w naturze.

• mleko kobiet karmiących- abzymy o aktywności kinazy białkowej, rybonukleazy, deoksyrybonukleazy, α-amylazy.

• mikrozymy

• masy molowe niższe niż 10 kDa

• najmniejszy opisany enzym to mikroesteraza z Bacillus stearothermophilus

(problemy z procedurą izolacji i oczyszczania)

• mikroesteraza z Candida lipolytica (5,7 kDa)

• mikroproteaza z termofilnego szczepu Actinomyces sp.

• mikrozym z archeabakterii Sulfolubus sulfataricus

• metaloproteinaza z Grant Kurthia spirofornie (alkalofilna, termostabilna)

• mikroesterazy z termofilnych grzybów (1530-5257 kDa)

Mikrozymy są alternatywą dla rybozymów i abzymów.

Jaka jest różnica między ekstermofilami a ekstremozymami? (EGZAMIN)

EKSTREMOZYMY

Enzymy pochodzące z mikroorganizmów ekstremofilnych.

Termofile : T_opt > 45°C

• hipertermofile : T_opt > 85°C

• psychrofile : T_min < 0°C

• acidofile : pH < 2

• alkalofile : pH > 10

• barofile : p > 1 atm

• halofile : NaCl 4-5 M

• metalofile : odpowiednie metale ciężkie

• mikroaerofile : O₂ < 21%

• enetektofile : mikroorganizmy żyjące w eutektycznej warstwie lodu (lód typu 4)

Badania zaawansowane prowadzone są na termozymach.

Komercyjny sukces: fag polimerazy z Thermus agnaticus (Pyrococcus furiosus):

termofilne amylazy, ksylanazy, proteazy (produkcja glukozy i fruktozy ze skrobi, bielenie mas papierniczych, browarnictwo, detergenty piorące).

Etap wdrażania:

• pullulanaza z Thermococcus aggregans

• hydrataza nitrylowa z Bacillus pallidens

W3

• termoacydofilna esteraza z Bacillus acidocaldavirus

• termostabilne lipazy z Bacillus thermocatemulants

Badane psychrofile:

• lipaza z Candida autarctica

• antarktyczna mletylizyna z TA41 (muteina 3G7-3 cykle ukierunkowanej ewolucji

in vitro, wymiana 7 aminokwasów, 500-krotny wzrost termostabilności w 60°C, przesunięcie T_top)- detergenty piorące

• psychrofilne oksydorektuazy- biosensory, bioremedacja skażonych ropopochodnymi związkami środowisk

• lipazy i esterazy w środowiskach niewodnych (gęstość cząsteczki)

• glikozydaza - w niskotemperaturowych roztworach hydrolizy (hydroliza laktozy w mleku i ściekach o dużej zawartości serwatki

Enzymy eutektofili- badanie metagenomu („środowiskowe DNA”).

Ukierunkowana ewolucja enzymów in vitro

• opiera się na wykreowaniu dużej liczby wariantów wyjściowego białka katalitycznego i znalezienie wśród nich docelowego ulepszonego enzymu;

• stworzenie biblioteki wariantów genu enzymów (10⁸ - 10¹² wariantów) i sprawdzenie czy każdy wariant ulega ekspresji;

1. Tworzenie biblioteki genów:

• metody nierekombinacyjne

• Ep-PCR (error-prone PCR)

• mutacje chemiczne wyjściowego DNA

• techniki inżynierii białkowej (ukierunkowane punktowe mutacje, mutacje poprzez nasycenie punktowe)

• pasaże genów przez mutatorowe szczepy Escherichia coli

• metody rekombinacyjne

• „tasowanie genów” (DNA shuffling)

• STEP (Stagered Extention Process)

• RACHITT (Random Chimera Genesis On Transient Template)

• Wiązanie genotypu z fenotypem:

• ekspozycja na fagu (białko fuzyjne z białkiem płaszcza wirusa)

• ekspozycja na powierzchni komórki drożdżowej (2002 r.)

• ekspozycja na rybosomie (rybosom - m-RNA - białko = kompleks)

• ekspozycja na m-RNA

• kompertmentacja in vitro (jeden gen w kropelce wody; inertny)

3. Sortowanie biblioteki wariantów zmutowanego genu fizycznie związanego z enzymem jako produktem jego ekspresji

• selekcja (ważna)

• skrining wysokorpzepustowy

• QUEST (obecny polimeryczne aktywator transkrypcji)

• FAS (pomiar fluorescencji klonów zawierających różne warianty genów enzymu)

• Dotychczasowe osiągnięcia DE:

• zmieniona peroksydaza cytochromowu C

W3

• Escherichia coli β- galaktozydaza → β- glukozydaza

• lipaza Staphylococcus aureus → fosfolipaza

• dehydrogenaza 3-izopropylojabłczan (zwiększenie aktywności)

• fragment DNA (biblioteka genów hipertemofilnego Pyrococcus furiosus)

• aktywność β-laktamazy

• inżynierowanie szlakami metabolicznymi (biosynteza karotenoidów)

• modyfikacje DE (3-indolo-glicerol)

• izomeraza fosforybozylo antranilanu

Nowe postacie preparatów enzymów

• biokatalityczny plastik złoża do bioreaktorów

• enzymy zamykane w hybrydowych kompozytach organiczno- nieorganicznych

• biokatalizator zamykany w sieci polimeru wraz z cząsteczkami magnetytu (złoża do reaktorów fluidalnych)

• sieciowanie kryształów enzymów (CLESs)

• usieciowane agregaty białek enzymatycznych (CLEAs)

Inżynierowanie środowiskiem reakcji

• ciecze jonowe- sole występujące w temperaturze otoczenia w stanie ciekłym (ciekłe w temperaturze T>300°C, rozpuszczają się w nich różne związki, organiczne i nieorganiczne polimery; wysoka polarność, znikome ciśnienie par, doskonała kwasowość Lewisa Bronsteda, recykling) stosowane w laboratorium w procesach transestryfikacji, alkoholizy, amonolizy, rozdziale racematów P-chiralnych hydroksymetanofosfonatów, syntezie aspartamu (przy udziale termolizyny)

• rozpuszczalniki nadfluoranowe

Biokataliza i biosynteza kombinatoryjna

• biokataliza kombinatoryjna jest techniką stosowaną w celu stworzenia bibliotek produktów naturalnych lub syntetycznych

• lipaza z Candida antarctica (biblioteka 24 estrów; 4 alkohole + 6 estrów)

• biosynteza kombinatoryjna to przetwarzanie lub inżynierowanie naturalnymi szlakami metabolicznymi aby otrzymać analogi produktów naturalnych

• nowe makrolidy- manipulacje na poziomie syntezy poliketydylowej

• karotenoidy

ANTYBIOTYKI

1928 r. - początek ery antybiotyków

1942 r. - definicje antybiotyków S.A.Waksman „... antybiotyki są to substancje chemiczne wytwarzane przez mikroorganizmy i mające w dużych rozcieńczeniach zdolność zabijania lub hamowania wzrostu innych drobnoustrojów...”

W3

DEFINICJA WSPÓŁCZESNA

Makrocząsteczkowe substancje naturalne, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich półsyntetyczne modyfikacje albo syntetyczne analogi, które w małym stężeniu działają wybiórczo na struktury i procesy biologiczne hamujące wzrost lub rozmnażanie komórek.

PODZIAŁ ZE WZGLĘDU NA BUDOWĘ CHEMICZNĄ

• pochodne aminokwasów, np.:

• β-laktamy

• antybiotyki polipeptydowe

• antybiotyki glikopeptydowe

• antybiotyki lipopeptydowe

• pochodne cukrów, np.:

• aminoglikozydy

• glikolipidy

• antybiotyki makrocykliczne

• chinony i ich pochodne, np.:

• antracykliny

• inne (pochodne cykloalkanów, nukleozydy, polietery aromatyczne, fosfoniany, steroidy)

PODZIAŁ ZE WZGLĘDU NA WŁAŚCIWOŚCI BAKTERIOBÓJCZE I BAKTERIOSTATYCZNE

Antybiotyki β-laktamowe - penicyliny

TYP PENICYLINY	ŁAŃCUCH BOCZNY	PREKURSOR
benzylowa (penicylina G)		kwas fenylooctowy
hydroksybenzylowa (X)		kwas hydroksyfenylooctowy
pentylowa (F)		kwas 3-heksynowy
fenoksymetylowa (V)		kwas fenoksyoctowy
n-heptylowa (K)		kwas karpylowy

Penicylina G - pierwszy naturalny antybiotyk β-laktamowy o bardzo dobrej aktywności wobec ziarenkowców, Gram (+), wywiera działanie bakteriobójcze; nie jest stabilna w roztworach wodnych, więc nie może być podawana doustnie.

W3

Penicylina V- podobne spectrum aktywności- nieaktywna w stosunku do gronkowców; podawana doustnie.

AKTYWNOŚĆ:

Penicylina G	1667 mg^-1
Penicylina V	1595 mg^-1

Penicyliny degradowane są przez β-laktamazy.

Inhibitory β-laktamaz: kwas klawulanowy, sublaktam, tiazolaktam.

JAK DZIAŁA PENICYLINA?

Blokuje ostatni etap biosyntezy bakteryjnej ściany komórkowej (tworzenie poprzecznych wiązań pomiędzy różnymi łańcuchami peptydoglikanu). Jej bezpośrednim celem jest transpeptydaza glikopeptydowa (mimikra molekularna).

PROCES PRODUKCJI PENICYLIN:

1. Liofilizowane spory szczepu produkcyjnego.

2. Hodowle na skosach agarowych.

3. Kultury wegetatywne w kolbach stożkowych.

4. Namnażanie biomasy.

5. Właściwy proces syntezy (dozowanie odpowiednich składników i prekursorów, izolacja, oczyszczanie).

PROCES BIOSYNTEZY PENICYLIN (II fazy):

1. trofofaza- namnażanie grzybni (30-40 h), szybka asymilacja składników podłoża, temperatura 27-24°C;

2. idiofaza- właściwa faza produkcji

WYODRĘBNIANIE PRODUKTU I OCZYSZCZANIE:

1. oddzielenie grzybni od płynu pohodowlanego, filtracja;

2. ekstrakcja rozpuszczalnikami w układzie ciecz-ciecz;

3. chromatografia kolumnowa (węgiel aktywny);

4. krystalizacja, suszenie i inne czynności prowadzące do otrzymania farmaceutyku

Penicyliny semisyntetyczne

Penicyliny półsyntetyczne zostały wprowadzone do lecznictwa pod koniec lat 50. Niektóre z nich mają wąski zakres działania, np.:

• p/gronkowcowe (Oksacylina, Kloksacylina, Metycylina, Nafcylina)

• szeroki zakres (Ampicylina, Amoksycylina, Piperacylina)

Najbardziej znanym antybiotykiem tej grupy jest Ampicylina, która jako pierwsza była wprowadzona do lecznictwa. Następcą Ampicyliny jest Amoksycylin, która wykazuje znacznie lepszą aktywność i korzystniejsze właściwości farmakokinetyczne.

W3

W ostatnich latach pojawiły się skuteczne preparaty, łączące penicylinę półsyntetyczną z inhibitorem β-laktamaz.

Połączenie to rozszerza zakres działania penicylin na bakterie wytwarzające β-laktamazy. Przykładem takich połączonych leków jest amoksycylina z kwasem klawulanowym, ampicylina z sublaktamem czy piperocylina z tazolaktamem.




6APA




Jak się otrzymuje semisyntetyczne penicyliny? (E)

NOWE ANTYBIOTYKI β-LAKTAMOWE

Thienamycyna- Streptomyces cattleya szerokie spektrum działania (Gram +, Gram -); odporny na działanie β-laktamaz.




Kwas klawulanowy- Strepotmyces sp.; inhibitor β-laktamaz.

Epithienamycyny (kwas oliwanowy) Streptomyces olivaceus; aktywne wobec Gram (-); inhibitory β-laktamaz.

W3

Nocardicyny- Nocardia sp.; monocykliczne β-laktamy, np.:

• nocardicyna A (aktywna przeciwko Gram - , nietoksyczna, stabilna w roztworach wodnych, odporna na β-laktamazy)

Cefalosporyny

Wzory strukturalne penicylin, Thienamycyny (E).

Antybiotyki aminoglikozydowe

Aminocukier + aminocyklitol

Produkty naturalne : Streptomycyna, Neomycyna, Kanamycyna, Gentamycyna

Produkty semisyntetyczne: Dibekacyna, Amikacyna

PODZIAŁ ANTYBIOTYKÓW AMINOGLIKOZYDOWYCH

• aminocyklitol jest pochodną streptaminy- streptomycyna

• aminocyklitol jest pochodną

Bardzo silne antybiotyki. Szerokie spektrum działania- działanie bakteriobójcze. Aktywne przeciw Escherichia coli, Klebsiella sp, Proteus sp, Enterobacter enterococcus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus. Nieaktywne wobec Streptococcus sp., bakterii beztlenowych, grzybów, wirusów i pierwotniaków. Odporność na te antybiotyki powstaje powoli wśród bakterii

MECHANIZM DZIAŁANIA

Działają na poziomie biosyntezy białka - rybosom 70S.

Streptomycyna- podjednostka 30S, wiązanie terminalnego RNA z rybosomami (inicjacja biosyntezy białka), błędna odczytanie m-RNA .

Gentamycyna, Neomycyna, Kanamycyna- dezorganizacja miejsca dekodowania, blokada splicingu autokatalitycznego grupy I intronów.

TOKSYCZNOŚĆ: narządy słuchu, nerki.

Oporność na antybiotyki aminoglikozydowe może być spowodowana:

• zmianami w przepuszczalności błony komórkowej

• mutacjami 30S

• enzymami modyfikującymi antybiotyki

7

---