Diagnostyka molekularna

Anna Wawrocka

Katedra i Zakład Genetyki Medycznej, Akademii Medycznej w Poznaniu

Metody stosowane w diagnostyce molekularnej:

•hybrydyzacja z sondami molekularnymi

•metoda PCR - łańcuchowej reakcji polimerazy

Hybrydyzacja (renaturacja) - tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z różnych źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze.

Metody hybrydyzacji molekularnej:

-Southern Blotting,

-DNA fingerprinting,

-Northern blotting,

-In situ hybridization (FISH).

•Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) - stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród mieszaniny fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:

- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz

-mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu, stosowanego do trawienia DNA

DNA Fingerprinting

W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) - zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny

Zastosowanie:

-ustalanie ojcostwa

-badania medyczno-sądowe

Amplifikacja DNA metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy) - reakcja ta

odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie

powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji).

Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA.

Startery te są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA, w cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

- denaturacja dwuniciowej matrycy - 90-95°C,

- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,

- synteza nici komplementarnej 68-72°C

Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich szybkość zależy od wielkości cząsteczki - im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem UV.

Na schemacie przedstawiono etapy reakcji PCR

PCR-Multiplex

Umożliwia jednoczesną amplifikację kilku eksonów jednocześnie.

Zastosowanie:

- Identyfikacja dużych mutacji genowych: delecje, duplikacje, insercje

Np. Dystrofia mięśniowa Duchenne'a DMD

PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych)

Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym.

Zastosowanie:

- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny

Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia

Hybrydyzacja ASO

hybrydyzacja z sondą specyficzną dla produktu PCR. Sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany.

Zastosowanie:

- wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych

Przykład:

Mukowiscydoza (cystic fibrosis)

PCR-SSCP

Analiza konformacji jednoniciowych DNA, polega na porównaniu konformacji badanych jednoniciowych fragmentów kwasów nukleinowych. Zdenaturowane produkty PCR, rozdziela się w natywnym żelu poliakrylamidowym. Jednoniciowe fragmenty DNA w warunkach elektroforezy tworzą wewnętrzne sparowania i przyjmują określoną konformację przestrzenną zależną od sekwencji nukleotydów. Fragmenty o takiej samej sekwencji nukleotydów, przyjmują taką samą konformację przestrzenną i migrują w żelu z taką samą prędkością.

Zastosowanie:

- Umożliwia wykrywanie punktowych zmian w DNA.

Przykład: zespół Marfana (Marfan syndrome)

Sekwencjonowanie

Najczęściej używaną metodą jest metoda Sangera, oparta o syntezę DNA przez polimerazę DNA in vitro. Do reakcji dodaje się niewielką ilość dideoksynukleotydów, które są wbudowywane w DNA, ale nie mogą być substratem do dalszego wydłużania nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA zakończone specyficznym nukleotydem. Produkty reakcji rozdziela się elektroforetycznie, co powoduje ich segregację pod względem wielkości produktów.

Denaturacja

Wiązanie starterów

Synteza nici

komplementarnej

PCR-RFLP

Polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych

Miejsce

restrykcyjne

Mutacja punktowa

Produkt PCR

Trawienie enz.

restrykcyjnym

Elektroforeza

Produkty PCR

---