Diagnostyka molekularna w medycynie

Anna Wawrocka

Katedra i Zakład Genetyki Medycznej

1. Izolacja DNA

Źródła DNA:

- krew obwodowa (limfocyty)

- komórki płynu owodniowego (AFC)

- komórki kosmówki (CVS)

- hodowle fibroblastów

- komórki epitelialne

- cebulki włosów

- plamy krwi, nasienia

- fragmenty tkanek

- szpik kostny

Metody izolacji DNA:

1.Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów

2.Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek

3.Izolacja DNA poprzez związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA

Izolacja DNA z krwi obwodowej - metodą wysalania białek

Izolacja DNA z krwi

obwodowej obejmuje kilka

etapów:

1.Liza komórek

bezjądrzastych

2. Liza leukocytów.

3. Odbiałczanie poprzez inkubacje z proteinazą K.

4. Wytrącanie DNA alkoholem

Główne kierunki analizy DNA

2. Hybrydyzacja (renaturacja) -

Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z różnych źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze.

Metody hybrydyzacji molekularnej:

-Southern Blotting,

-DNA fingerprinting,

-Northern blotting,

-In situ hybridization (FISH).

Sondą molekularną mogą być:

-syntetyczne oligomery

-syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty

-cDNA

-fragmenty chromosomów

-całe genomy bakteryjne

Sonda molekularna musi być zdenaturowana (jednoniciowa).

Łaczenie sondy molekularnej z docelowym fragmentem kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad.

Sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.

Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) -

Stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród mieszaniny fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:

- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz

-mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu, stosowanego do trawienia DNA

Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization) -

Stosowana w celu badania ekspresji genów

DNA Fingerprinting

W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable number of tandem repeats) - zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny

Zastosowanie:

-ustalanie ojcostwa

-badania medyczno-sądowe

3. Klonowanie DNA:

1. Klonowanie DNA w wektorach

2. Klonowanie DNA in-vitro PCR

Ad.1 Etapy klonowania DNA w mikroorganizmach:

-Cięcie enzymem restrykcyjnym DNA

-Łączenie fragmentów DNA z wektorem

-Wprowadzenie wektorów do komórek

-Powielanie DNA w komórkach

Stosowane wektory:

• Plazmidy, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, zawierające niewiele genów

• Bakteriofagi, wirusy atakujące komórki bakteryjne

Ad.2

Amplifikacja DNA metodą PCR (łańcuchowej reakcji polimerazy) -

Reakcja ta odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie powielenie wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji).

Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA.

Startery te są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA, w cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

- denaturacja dwuniciowej matrycy - 90-95°C,

- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,

- synteza nici komplementarnej 68-72°C

Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich szybkość zależy od wielkości cząsteczki - im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem UV.

Na schemacie przedstawiono etapy reakcji PCR

PCR-RFLP (analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych)

Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym.

Zastosowanie:

- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny

Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia

PCR-Multipleks

- Jednorazowo można amplifikować ok.10 markerów

- Można badać DNA zmieszany i zdegradowany

- Zastosowanie: Duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje

Przykład: Dystrofia mięśniowa Duchenne'a DMD

Hybrydyzacja ASO

Hybrydyzacja z sondą specyficzną dla produktu PCR. Sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany.

Zastosowanie:

- wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych

Przykład:

Mukowiscydoza (cystic fibrosis)

PCR-SSCP

Analiza konformacji jednoniciowych DNA, polega na porównaniu konformacji badanych jednoniciowych fragmentów kwasów nukleinowych. Zdenaturowane produkty PCR, rozdziela się w natywnym żelu poliakrylamidowym. Jednoniciowe fragmenty DNA w warunkach elektroforezy tworzą wewnętrzne sparowania i przyjmują określoną konformację przestrzenną zależną od sekwencji nukleotydów. Fragmenty o takiej samej sekwencji nukleotydów, przyjmują taką samą konformację przestrzenną i migrują w żelu z taką samą prędkością.

Zastosowanie:

- Umożliwia wykrywanie punktowych zmian w DNA.

Przykład: zespół Marfana (Marfan syndrome)

Sekwencjonowanie DNA

Metoda polega na enzymatycznej replikacji jednoniciowej (denaturowanej) matrycy DNA, rozpoczynającej się od jednego startera, a kończącej wbudowaniem dideoksynukleotydu (zmodyfikowanego nukleotydu) do nowopowstałego łańcucha DNA.

Terapia genowa

Terapia genowa-procedury zmierzające do wprowadzenia do komórek pacjenta zdrowych odpowiedników wadliwie działających genów.

Terapia genowa:

• komórek somatycznych

• komórek germinalych

Terapia komórek germinalych - modyfikacja gamet, zygoty lub embrionu we wczesnej fazie rozwoju. W wielu krajach zabroniono stosowania terapii kom. rozrodczych z powodów etycznych

Terapia komórek somatycznych - Modyfikacja specyficznych komórek i tkanek pacjenta.

Komórki mogą być modyfikowane w różny sposób:

1.Dostarczenie funkcjonalnej kopii zmutowanego genu

2.Zastąpienie genu - ambitne: zastąpienie zmutowanego genu przez prawidłowo funkcjonującą jego kopię

3.Hamowanie ekspresji konkretnych genów

4.Celowane niszczenie specyficznych komórek- może mieć szczególne znaczenie w leczeniu nowotworów

Metody dostarczania terapeutycznego genu:

Terapia genowa in-vivo

-Gen jest dostarczany za pomocą wektora (wewnątrz) do komórek pacjenta

-Proces wymaga mniej manipulacji

Terapia genowa Ex-vivo

-Gen jest dostarczany do komórek hodowanych in-vitro

-Transfekowane komórki są selekcjonowane a nastepnie dostarczane do pacjenta za pomocą wektora

Idealny wektor nie istnieje, najczęściej stosuje się wektory wirusowe

Wektory wirusowe:

-Retrowirusy

-Adenowirusy

-Lentiwirusy

Wektory niewirusowe:

-Liposomy

-„Naga” cząsteczka DNA

Każdy z wektorów wirusowych ma wady, które ograniczają jego stosowanie i grożą skutkami ubocznymi.

Każdy z nich ma też cechy bardzo pożądane w terapii genowej.

Retrowirusy

-Wirusy RNA,

-funkcja odwrotnej transkrypcji

-Białka wirusa produkowane są przez dłuższy czas

•

Zaleta:

-Nie wywołują silnej reakcji immunologicznej

Wada

- Infekują tylko komórki dzielące się

Adenowirusy

-Wirus DNA

-Po wniknięciu do jądra komórkowego nie wbudowuje się w chromosomy gospodarza

•Zalety:

-Infekuje komórki dzielące i nie dzielące się

-Wysoki poziom ekspresji białka

Wady:

-Wywołuje szybką odpowiedź immunologiczną

-Krótki czas ekspresji

Lentiwirusy

Należą do retrowirusów

Wada:

-infekują nie dzielące się komórki

-Integrują się z chromosomami gospodarza

Zaleta:

- Długi czas ekspresji

Liposomy

•Syntetyczne wektory

•Zalety:

-Nie ma ograniczeń co do wielkości DNA wbudowanego do wektora

-DNA nie integruje z chromosomami gospodarza

Wady:

-Niska wydajność transferu

Naga cząsteczka DNA

Kolista czasteczka DNA niosąca lecznicze geny, mogą być miejscowo podane np. do mięśni (DMD) Wady:

-Niska wydajność

-Nie jest stabilny w komórce

Sztuczny ludzki chromosom

-Dodatkowy minichromosom w pełni podlega replikacji informacji genetycznej

-Jest przekazywany z kolejnymi podziałami z komórki do komórki

-Eliminuje zjawisko bariery immunologicznej

-Zapewnia stabilną i długotrwałą ekspresję inf. genetycznej

Badania prowadzone w Polsce:

1.Terapia genowa czerniaka

2.Terapia raka jelita grubego

3.Terapia wątrobiaka

4.Terapia glejaka i oponiaka

W Polsce od 5 lat prowadzone są jedne z pierwszych i najbardziej zaawansowanych w świecie badań nad genetycznie modyfikowaną szczepionką przeciw czerniakowi.

Zastosowanie komórek macierzystych

Zarodkowe komórki macierzyste (Embryonic stem cells) mogą dać początek wszystkim tkankom naszego organizmu.

Interferencja RNA w medycynie

Interferencja umożliwia badanie funkcji genów praktycznie wszystkich organizmów eukariotycznych, spełnia również ważna rolę w fizjologicznej regulacji działanie genów

- Interferencja RNA to zdolność dwuniciowego RNA do silnego i swoistego wyciszenia ekspresji danego genu

-

Dwuniciowe RNA (dsRNA) to połączenie antysensowego RNA z sensowym RNA (sekw. identyczna z mRNA)

-

Takie dsRNA potrafi zahamować ekspresję genu ponad 10-krotnie skuteczniej niż każda pojedyncza nić z osobna

Zastosowanie siRNA w terapii chorób człowieka

- W badaniach in vitro, przeprowadzanych na komórkach ludzkich, a także in vivo na modelach zwierzęcych, udało się zahamować replikację wirusa HIV, poliomyelitis, grypy, RSV, wirusów zapalenia wątroby typu B i C (HBV, HCV) i coronawirusa związanego z SARS

- W I fazę badań klinicznych weszły testy aerozolu zawierającego przeciwwirusowe siRNA, skierowane przeciwko wirusowi RSV

- Opisanych zostało wiele skutecznych prób zmierzających do zahamowania proliferacji komórek nowotworowych przy użyciu siRNA. Badania prowadzono na hodowlach komórkowych in vitro

- Wdrożenie siRNA do leczenia zwiazanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej (AMD)

Analiza sekwencji DNA

Klonowanie DNA w

wektorach

Amplifikacja in-vitro

PCR

Amplifikacja DNA

Klonowanie

PCR-Multipleks

Southern Blot

PCR-RFLP

PCR-ASO

Rearanżacje genowe

Mutacje punktowe

Synteza nici

komplementarnej

Wiązanie starterów

Denaturacja

Sekwencjonowanie DNA

PCR-SSCP

PCR-HD

Metody przesiewowe

Mutacje nieznane

Mutacje znane

Poszukiwanie mutacji

Southern Blot

Northern Blot

DNA Fingerprinting

FISH (zastosowanie w cytogenetyce)

Hybrydyzacja molekularna

Genomowy DNA

---