Diagnostyka molekularna w medycynie
Anna Wawrocka
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej
1. Izolacja DNA
Źródła DNA:
- krew obwodowa (limfocyty)
- komórki płynu owodniowego (AFC)
- komórki kosmówki (CVS)
- hodowle fibroblastów
- komórki epitelialne
- cebulki włosów
- plamy krwi, nasienia
- fragmenty tkanek
- szpik kostny
Metody izolacji DNA
:
1
1
.
.
I
I
z
z
o
o
l
l
a
a
c
c
j
j
a
a
D
D
N
N
A
A
z
z
z
z
a
a
s
s
t
t
o
o
s
s
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
e
e
m
m
f
f
e
e
n
n
o
o
l
l
u
u
i
i
c
c
h
h
l
l
o
o
r
r
o
o
f
f
o
o
r
r
m
m
u
u
c
c
e
e
l
l
e
e
m
m
o
o
d
d
b
b
i
i
a
a
ł
ł
c
c
z
z
e
e
n
n
i
i
a
a
p
p
r
r
e
e
p
p
a
a
r
r
a
a
t
t
ó
ó
w
w
2
2
.
.
I
I
z
z
o
o
l
l
a
a
c
c
j
j
a
a
D
D
N
N
A
A
p
p
r
r
z
z
e
e
b
b
i
i
e
e
g
g
a
a
j
j
ą
ą
c
c
a
a
p
p
r
r
z
z
e
e
z
z
w
w
y
y
s
s
o
o
l
l
e
e
n
n
i
i
e
e
b
b
i
i
a
a
ł
ł
e
e
k
k
z
z
l
l
i
i
z
z
a
a
t
t
ó
ó
w
w
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
e
e
k
k
3
3
.
.
I
I
z
z
o
o
l
l
a
a
c
c
j
j
a
a
D
D
N
N
A
A
p
p
o
o
p
p
r
r
z
z
e
e
z
z
z
z
w
w
i
i
ą
ą
z
z
a
a
n
n
i
i
e
e
z
z
n
n
o
o
ś
ś
n
n
i
i
k
k
i
i
e
e
m
m
,
,
o
o
d
d
m
m
y
y
c
c
i
i
e
e
z
z
a
a
n
n
i
i
e
e
c
c
z
z
y
y
s
s
z
z
c
c
z
z
e
e
ń
ń
i
i
u
u
w
w
o
o
l
l
n
n
i
i
e
e
n
n
i
i
e
e
D
D
N
N
A
A
I
I
z
z
o
o
l
l
a
a
c
c
j
j
a
a
D
D
N
N
A
A
z
z
k
k
r
r
w
w
i
i
o
o
b
b
w
w
o
o
d
d
o
o
w
w
e
e
j
j
–
–
m
m
e
e
t
t
o
o
d
d
ą
ą
w
w
y
y
s
s
a
a
l
l
a
a
n
n
i
i
a
a
b
b
i
i
a
a
ł
ł
e
e
k
k
I
I
z
z
o
o
l
l
a
a
c
c
j
j
a
a
D
D
N
N
A
A
z
z
k
k
r
r
w
w
i
i
o
o
b
b
w
w
o
o
d
d
o
o
w
w
e
e
j
j
o
o
b
b
e
e
j
j
m
m
u
u
j
j
e
e
k
k
i
i
l
l
k
k
a
a
e
e
t
t
a
a
p
p
ó
ó
w
w
:
:
1
1
.
.
L
L
i
i
z
z
a
a
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
e
e
k
k
b
b
e
e
z
z
j
j
ą
ą
d
d
r
r
z
z
a
a
s
s
t
t
y
y
c
c
h
h
2
2
.
.
L
L
i
i
z
z
a
a
l
l
e
e
u
u
k
k
o
o
c
c
y
y
t
t
ó
ó
w
w.
3
3
.
.
O
O
d
d
b
b
i
i
a
a
ł
ł
c
c
z
z
a
a
n
n
i
i
e
e
p
p
o
o
p
p
r
r
z
z
e
e
z
z
i
i
n
n
k
k
u
u
b
b
a
a
c
c
j
j
e
e
z
z
p
p
r
r
o
o
t
t
e
e
i
i
n
n
a
a
z
z
ą
ą
K
K
.
.
4
4
.
.
W
W
y
y
t
t
r
r
ą
ą
c
c
a
a
n
n
i
i
e
e
D
D
N
N
A
A
alkoholem
Główne kierunki analizy DNA
Genomowy DNA
Hybrydyzacja
molekularna
Southern Blot
Northern Blot
DNA Fingerprinting
FISH (zastosowanie w cytogenetyce)
Amplifikacja DNA
Klonowanie
Amplifikacja in-vitro
PCR
Klonowanie DNA
w
wektorach
2. Hybrydyzacja (renaturacja) –
Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z
różnych źródeł. Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do
utworzenia hybrydu (dupleksu) o dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).
S
S
o
o
n
n
d
d
ą
ą
m
m
o
o
l
l
e
e
k
k
u
u
l
l
a
a
r
r
n
n
ą
ą
m
m
o
o
g
g
ą
ą
b
b
y
y
ć
ć
:
:
-
-
s
s
y
y
n
n
t
t
e
e
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
e
e
o
o
l
l
i
i
g
g
o
o
m
m
e
e
r
r
y
y
-
-
s
s
y
y
n
n
t
t
e
e
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
e
e
b
b
ą
ą
d
d
ź
ź
n
n
a
a
t
t
u
u
r
r
a
a
l
l
n
n
e
e
g
g
e
e
n
n
y
y
l
l
u
u
b
b
i
i
c
c
h
h
f
f
r
r
a
a
g
g
m
m
e
e
n
n
t
t
y
y
-
-
c
c
D
D
N
N
A
A
-
-
f
f
r
r
a
a
g
g
m
m
e
e
n
n
t
t
y
y
c
c
h
h
r
r
o
o
m
m
o
o
s
s
o
o
m
m
ó
ó
w
w
-
-
c
c
a
a
ł
ł
e
e
g
g
e
e
n
n
o
o
m
m
y
y
b
b
a
a
k
k
t
t
e
e
r
r
y
y
j
j
n
n
e
e
S
S
o
o
n
n
d
d
a
a
m
m
o
o
l
l
e
e
k
k
u
u
l
l
a
a
r
r
n
n
a
a
m
m
u
u
s
s
i
i
b
b
y
y
ć
ć
z
z
d
d
e
e
n
n
a
a
t
t
u
u
r
r
o
o
w
w
a
a
n
n
a
a
(
(
j
j
e
e
d
d
n
n
o
o
n
n
i
i
c
c
i
i
o
o
w
w
a
a
)
)
.
.
Ł
Ł
a
a
c
c
z
z
e
e
n
n
i
i
e
e
s
s
o
o
n
n
d
d
y
y
m
m
o
o
l
l
e
e
k
k
u
u
l
l
a
a
r
r
n
n
e
e
j
j
z
z
d
d
o
o
c
c
e
e
l
l
o
o
w
w
y
y
m
m
f
f
r
r
a
a
g
g
m
m
e
e
n
n
t
t
e
e
m
m
k
k
w
w
a
a
s
s
u
u
n
n
u
u
k
k
l
l
e
e
i
i
n
n
o
o
w
w
e
e
g
g
o
o
z
z
a
a
c
c
h
h
o
o
d
d
z
z
i
i
z
z
g
g
o
o
d
d
n
n
i
i
e
e
z
z
k
k
o
o
m
m
p
p
l
l
e
e
m
m
e
e
n
n
t
t
a
a
r
r
n
n
o
o
ś
ś
c
c
i
i
ą
ą
z
z
a
a
s
s
a
a
d
d
.
.
S
S
o
o
n
n
d
d
a
a
j
j
e
e
s
s
t
t
w
w
y
y
z
z
n
n
a
a
k
k
o
o
w
w
a
a
n
n
a
a
r
r
a
a
d
d
i
i
o
o
a
a
k
k
t
t
y
y
w
w
n
n
i
i
e
e
l
l
u
u
b
b
n
n
i
i
e
e
r
r
a
a
d
d
i
i
o
o
a
a
k
k
t
t
y
y
w
w
n
n
i
i
e
e
n
n
p
p
.
.
f
f
l
l
u
u
o
o
r
r
e
e
s
s
c
c
e
e
n
n
c
c
y
y
j
j
n
n
i
i
e
e
.
.
Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) –
Stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA
spośród mieszaniny fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:
- rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz
-mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu,
stosowanego do trawienia DNA
Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization) –
Stosowana w celu badania ekspresji genów
D
D
N
N
A
A
F
F
i
i
n
n
g
g
e
e
r
r
p
p
r
r
i
i
n
n
t
t
i
i
n
n
g
g
W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR
(variable number of tandem repeats) – zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku
hybrydyzacji VNTR z sondami molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje
się dla każdego osobnika charakterystyczny obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk
genetyczny
Zastosowanie:
-ustalanie ojcostwa
-badania medyczno-sądowe
3. Klonowanie DNA:
1. Klonowanie DNA w wektorach
2. Klonowanie DNA in-vitro PCR
Ad.1
E
E
t
t
a
a
p
p
y
y
k
k
l
l
o
o
n
n
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
a
a
D
D
N
N
A
A
w
w
m
m
i
i
k
k
r
r
o
o
o
o
r
r
g
g
a
a
n
n
i
i
z
z
m
m
a
a
c
c
h
h
:
:
-
-
C
C
i
i
ę
ę
c
c
i
i
e
e
e
e
n
n
z
z
y
y
m
m
e
e
m
m
r
r
e
e
s
s
t
t
r
r
y
y
k
k
c
c
y
y
j
j
n
n
y
y
m
m
D
D
N
N
A
A
-
-
Ł
Ł
ą
ą
c
c
z
z
e
e
n
n
i
i
e
e
f
f
r
r
a
a
g
g
m
m
e
e
n
n
t
t
ó
ó
w
w
D
D
N
N
A
A
z
z
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
e
e
m
m
-
-
W
W
p
p
r
r
o
o
w
w
a
a
d
d
z
z
e
e
n
n
i
i
e
e
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
ó
ó
w
w
d
d
o
o
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
e
e
k
k
-
-
P
P
o
o
w
w
i
i
e
e
l
l
a
a
n
n
i
i
e
e
D
D
N
N
A
A
w
w
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
a
a
c
c
h
h
Stosowane wektory:
-
Plazmidy, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA, zawierające niewiele genów
-
Bakteriofagi, wirusy atakujące komórki bakteryjne
Ad.2
A
A
m
m
p
p
l
l
i
i
f
f
i
i
k
k
a
a
c
c
j
j
a
a
D
D
N
N
A
A
m
m
e
e
t
t
o
o
d
d
ą
ą
P
P
C
C
R
R
(
(
ł
ł
a
a
ń
ń
c
c
u
u
c
c
h
h
o
o
w
w
e
e
j
j
r
r
e
e
a
a
k
k
c
c
j
j
i
i
p
p
o
o
l
l
i
i
m
m
e
e
r
r
a
a
z
z
y
y
)
)
–
–
R
R
e
e
a
a
k
k
c
c
j
j
a
a
t
t
a
a
o
o
d
d
z
z
w
w
i
i
e
e
r
r
c
c
i
i
e
e
d
d
l
l
a
a
n
n
a
a
t
t
u
u
r
r
a
a
l
l
n
n
y
y
p
p
r
r
o
o
c
c
e
e
s
s
r
r
e
e
p
p
l
l
i
i
k
k
a
a
c
c
j
j
i
i
i
i
u
u
m
m
o
o
ż
ż
l
l
i
i
w
w
i
i
a
a
w
w
w
w
a
a
r
r
u
u
n
n
k
k
a
a
c
c
h
h
i
i
n
n
v
v
i
i
t
t
r
r
o
o
s
s
z
z
y
y
b
b
k
k
i
i
e
e
p
p
o
o
w
w
i
i
e
e
l
l
e
e
n
n
i
i
e
e
w
w
y
y
b
b
r
r
a
a
n
n
y
y
c
c
h
h
o
o
d
d
c
c
i
i
n
n
k
k
ó
ó
w
w
D
D
N
N
A
A
l
l
u
u
b
b
R
R
N
N
A
A
(
(
p
p
r
r
z
z
e
e
p
p
i
i
s
s
a
a
n
n
e
e
g
g
o
o
n
n
a
a
c
c
D
D
N
N
A
A
p
p
r
r
z
z
y
y
u
u
ż
ż
y
y
c
c
i
i
u
u
r
r
e
e
a
a
k
k
c
c
j
j
i
i
o
o
d
d
w
w
r
r
o
o
t
t
n
n
e
e
j
j
t
t
r
r
a
a
n
n
s
s
k
k
r
r
y
y
p
p
c
c
j
j
i
i
)
)
.
.
Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których
każdy jest komplementarny do jednego końca sekwencji docelowej DNA.
Startery te są wydłużane w kierunku przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA, w cyklu
który obejmuje trzy podstawowe etapy:
- denaturacja dwuniciowej matrycy – 90-95°C,
- wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,
- synteza nici komplementarnej 68-72°C
Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA
umieszczone w żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich
szybkość zależy od wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu.
Wybarwione bromkiem etydyny (mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem
UV.
Na schemacie przedstawiono etapy reakcji PCR
PCR-RFLP (
analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych)
Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie którego występuje marker RFLP (fragment DNA
zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego trawieniu odpowiednim enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
- identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny
Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia
Denaturacja
Wiązanie starterów
Synteza nici
komplementarne
j
PCR-Multipleks
-
-
J
J
e
e
d
d
n
n
o
o
r
r
a
a
z
z
o
o
w
w
o
o
m
m
o
o
ż
ż
n
n
a
a
a
a
m
m
p
p
l
l
i
i
f
f
i
i
k
k
o
o
w
w
a
a
ć
ć
o
o
k
k
.
.
1
1
0
0
m
m
a
a
r
r
k
k
e
e
r
r
ó
ó
w
w
-
-
M
M
o
o
ż
ż
n
n
a
a
b
b
a
a
d
d
a
a
ć
ć
D
D
N
N
A
A
z
z
m
m
i
i
e
e
s
s
z
z
a
a
n
n
y
y
i
i
z
z
d
d
e
e
g
g
r
r
a
a
d
d
o
o
w
w
a
a
n
n
y
y
-
-
Z
Z
a
a
s
s
t
t
o
o
s
s
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
e
e
:
:
D
D
u
u
ż
ż
e
e
m
m
u
u
t
t
a
a
c
c
j
j
e
e
g
g
e
e
n
n
o
o
w
w
e
e
:
:
d
d
e
e
l
l
e
e
c
c
j
j
e
e
,
,
d
d
u
u
p
p
l
l
i
i
k
k
a
a
c
c
j
j
e
e
,
,
i
i
n
n
s
s
e
e
r
r
c
c
j
j
e
e
P
P
r
r
z
z
y
y
k
k
ł
ł
a
a
d
d
:
:
D
D
y
y
s
s
t
t
r
r
o
o
f
f
i
i
a
a
m
m
i
i
ę
ę
ś
ś
n
n
i
i
o
o
w
w
a
a
D
D
u
u
c
c
h
h
e
e
n
n
n
n
e
e
’
’
a
a
D
D
M
M
D
D
H
H
y
y
b
b
r
r
y
y
d
d
y
y
z
z
a
a
c
c
j
j
a
a
A
A
S
S
O
O
Hybrydyzacja z sondą specyficzną dla produktu PCR. Sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub
zmutowany.
Zastosowanie:
- wykrywanie mutacji punktowych, które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych
Przykład:
Mukowiscydoza (cystic fibrosis)
P
P
C
C
R
R
-
-
S
S
S
S
C
C
P
P
Analiza konformacji jednoniciowych DNA, polega na porównaniu konformacji badanych
jednoniciowych fragmentów kwasów nukleinowych. Zdenaturowane produkty PCR, rozdziela się w
natywnym żelu poliakrylamidowym. Jednoniciowe fragmenty DNA w warunkach elektroforezy tworzą
wewnętrzne sparowania i przyjmują określoną konformację przestrzenną zależną od sekwencji
nukleotydów. Fragmenty o takiej samej sekwencji nukleotydów, przyjmują taką samą konformację
przestrzenną i migrują w żelu z taką samą prędkością.
Zastosowanie:
- Umożliwia wykrywanie punktowych zmian w DNA.
Przykład: zespół Marfana (Marfan syndrome)
Sekwencjonowanie DNA
M
M
e
e
t
t
o
o
d
d
a
a
p
p
o
o
l
l
e
e
g
g
a
a
n
n
a
a
e
e
n
n
z
z
y
y
m
m
a
a
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
e
e
j
j
r
r
e
e
p
p
l
l
i
i
k
k
a
a
c
c
j
j
i
i
j
j
e
e
d
d
n
n
o
o
n
n
i
i
c
c
i
i
o
o
w
w
e
e
j
j
(
(
d
d
e
e
n
n
a
a
t
t
u
u
r
r
o
o
w
w
a
a
n
n
e
e
j
j
)
)
m
m
a
a
t
t
r
r
y
y
c
c
y
y
D
D
N
N
A
A
,
,
r
r
o
o
z
z
p
p
o
o
c
c
z
z
y
y
n
n
a
a
j
j
ą
ą
c
c
e
e
j
j
s
s
i
i
ę
ę
o
o
d
d
j
j
e
e
d
d
n
n
e
e
g
g
o
o
s
s
t
t
a
a
r
r
t
t
e
e
r
r
a
a
,
,
a
a
k
k
o
o
ń
ń
c
c
z
z
ą
ą
c
c
e
e
j
j
w
w
b
b
u
u
d
d
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
e
e
m
m
d
d
i
i
d
d
e
e
o
o
k
k
s
s
y
y
n
n
u
u
k
k
l
l
e
e
o
o
t
t
y
y
d
d
u
u
(
(
z
z
m
m
o
o
d
d
y
y
f
f
i
i
k
k
o
o
w
w
a
a
n
n
e
e
g
g
o
o
n
n
u
u
k
k
l
l
e
e
o
o
t
t
y
y
d
d
u
u
)
)
d
d
o
o
n
n
o
o
w
w
o
o
p
p
o
o
w
w
s
s
t
t
a
a
ł
ł
e
e
g
g
o
o
ł
ł
a
a
ń
ń
c
c
u
u
c
c
h
h
a
a
D
D
N
N
A
A
.
.
Poszukiwanie mutacji
Mutacje znane
Mutacje nieznane
Metody przesiewowe
PCR-SSCP
PCR-HD
Sekwencjonowanie
DNA
Mutacje punktowe
Rearanżacje
genowe
PCR-
RFLP
PCR-ASO
PCR-Multipleks
Southern Blot
Terapia genowa
Terapia genowa-procedury zmierzające do wprowadzenia do komórek pacjenta zdrowych
odpowiedników wadliwie działających genów.
Terapia genowa:
- komórek
somatycznych
- komórek
germinalych
Terapia komórek germinalych
- modyfikacja gamet, zygoty lub embrionu we wczesnej fazie
rozwoju. W wielu krajach zabroniono stosowania terapii kom. rozrodczych z powodów etycznych
Terapia komórek somatycznych
- Modyfikacja specyficznych komórek i tkanek pacjenta.
Komórki mogą być modyfikowane w różny sposób:
1.Dostarczenie funkcjonalnej kopii zmutowanego genu
2.Zastąpienie genu – ambitne: zastąpienie zmutowanego genu przez prawidłowo funkcjonującą jego
kopię
3.Hamowanie ekspresji konkretnych genów
4.Celowane niszczenie specyficznych komórek– może mieć szczególne znaczenie w leczeniu
nowotworów
Metody dostarczania terapeutycznego genu:
Terapia genowa in-vivo
-Gen jest dostarczany za pomocą wektora (wewnątrz) do komórek pacjenta
-Proces wymaga mniej manipulacji
Terapia genowa Ex-vivo
-Gen jest dostarczany do komórek hodowanych in-vitro
-Transfekowane komórki są selekcjonowane a nastepnie dostarczane do pacjenta za pomocą wektora
I
I
d
d
e
e
a
a
l
l
n
n
y
y
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
n
n
i
i
e
e
i
i
s
s
t
t
n
n
i
i
e
e
j
j
e
e
,
,
n
n
a
a
j
j
c
c
z
z
ę
ę
ś
ś
c
c
i
i
e
e
j
j
s
s
t
t
o
o
s
s
u
u
j
j
e
e
s
s
i
i
ę
ę
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
y
y
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
o
o
w
w
e
e
W
W
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
y
y
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
o
o
w
w
e
e
:
:
-
-
R
R
e
e
t
t
r
r
o
o
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
-
-
A
A
d
d
e
e
n
n
o
o
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
-
-
L
L
e
e
n
n
t
t
i
i
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
W
W
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
y
y
n
n
i
i
e
e
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
o
o
w
w
e
e
:
:
-
-
L
L
i
i
p
p
o
o
s
s
o
o
m
m
y
y
-
-
„
„
N
N
a
a
g
g
a
a
”
”
c
c
z
z
ą
ą
s
s
t
t
e
e
c
c
z
z
k
k
a
a
D
D
N
N
A
A
K
K
a
a
ż
ż
d
d
y
y
z
z
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
ó
ó
w
w
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
o
o
w
w
y
y
c
c
h
h
m
m
a
a
w
w
a
a
d
d
y
y
,
,
k
k
t
t
ó
ó
r
r
e
e
o
o
g
g
r
r
a
a
n
n
i
i
c
c
z
z
a
a
j
j
ą
ą
j
j
e
e
g
g
o
o
s
s
t
t
o
o
s
s
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
e
e
i
i
g
g
r
r
o
o
ż
ż
ą
ą
s
s
k
k
u
u
t
t
k
k
a
a
m
m
i
i
u
u
b
b
o
o
c
c
z
z
n
n
y
y
m
m
i
i
.
.
K
K
a
a
ż
ż
d
d
y
y
z
z
n
n
i
i
c
c
h
h
m
m
a
a
t
t
e
e
ż
ż
c
c
e
e
c
c
h
h
y
y
b
b
a
a
r
r
d
d
z
z
o
o
p
p
o
o
ż
ż
ą
ą
d
d
a
a
n
n
e
e
w
w
t
t
e
e
r
r
a
a
p
p
i
i
i
i
g
g
e
e
n
n
o
o
w
w
e
e
j
j
.
.
R
R
e
e
t
t
r
r
o
o
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
-
-
W
W
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
R
R
N
N
A
A
,
,
-
-
f
f
u
u
n
n
k
k
c
c
j
j
a
a
o
o
d
d
w
w
r
r
o
o
t
t
n
n
e
e
j
j
t
t
r
r
a
a
n
n
s
s
k
k
r
r
y
y
p
p
c
c
j
j
i
i
-
-
B
B
i
i
a
a
ł
ł
k
k
a
a
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
a
a
p
p
r
r
o
o
d
d
u
u
k
k
o
o
w
w
a
a
n
n
e
e
s
s
ą
ą
p
p
r
r
z
z
e
e
z
z
d
d
ł
ł
u
u
ż
ż
s
s
z
z
y
y
c
c
z
z
a
a
s
s
•
•
Z
Z
a
a
l
l
e
e
t
t
a
a
:
:
-
-
N
N
i
i
e
e
w
w
y
y
w
w
o
o
ł
ł
u
u
j
j
ą
ą
s
s
i
i
l
l
n
n
e
e
j
j
r
r
e
e
a
a
k
k
c
c
j
j
i
i
i
i
m
m
m
m
u
u
n
n
o
o
l
l
o
o
g
g
i
i
c
c
z
z
n
n
e
e
j
j
W
W
a
a
d
d
a
a
-
-
I
I
n
n
f
f
e
e
k
k
u
u
j
j
ą
ą
t
t
y
y
l
l
k
k
o
o
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
i
i
d
d
z
z
i
i
e
e
l
l
ą
ą
c
c
e
e
s
s
i
i
ę
ę
A
A
d
d
e
e
n
n
o
o
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
-
-
W
W
i
i
r
r
u
u
s
s
D
D
N
N
A
A
-
-
P
P
o
o
w
w
n
n
i
i
k
k
n
n
i
i
ę
ę
c
c
i
i
u
u
d
d
o
o
j
j
ą
ą
d
d
r
r
a
a
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
o
o
w
w
e
e
g
g
o
o
n
n
i
i
e
e
w
w
b
b
u
u
d
d
o
o
w
w
u
u
j
j
e
e
s
s
i
i
ę
ę
w
w
c
c
h
h
r
r
o
o
m
m
o
o
s
s
o
o
m
m
y
y
g
g
o
o
s
s
p
p
o
o
d
d
a
a
r
r
z
z
a
a
•
•
Z
Z
a
a
l
l
e
e
t
t
y
y
:
:
-
-
I
I
n
n
f
f
e
e
k
k
u
u
j
j
e
e
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
i
i
d
d
z
z
i
i
e
e
l
l
ą
ą
c
c
e
e
i
i
n
n
i
i
e
e
d
d
z
z
i
i
e
e
l
l
ą
ą
c
c
e
e
s
s
i
i
ę
ę
-
-
W
W
y
y
s
s
o
o
k
k
i
i
p
p
o
o
z
z
i
i
o
o
m
m
e
e
k
k
s
s
p
p
r
r
e
e
s
s
j
j
i
i
b
b
i
i
a
a
ł
ł
k
k
a
a
W
W
a
a
d
d
y
y
:
:
-
-
W
W
y
y
w
w
o
o
ł
ł
u
u
j
j
e
e
s
s
z
z
y
y
b
b
k
k
ą
ą
o
o
d
d
p
p
o
o
w
w
i
i
e
e
d
d
ź
ź
i
i
m
m
m
m
u
u
n
n
o
o
l
l
o
o
g
g
i
i
c
c
z
z
n
n
ą
ą
-
-
K
K
r
r
ó
ó
t
t
k
k
i
i
c
c
z
z
a
a
s
s
e
e
k
k
s
s
p
p
r
r
e
e
s
s
j
j
i
i
L
L
e
e
n
n
t
t
i
i
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
y
y
N
N
a
a
l
l
e
e
ż
ż
ą
ą
d
d
o
o
r
r
e
e
t
t
r
r
o
o
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
ó
ó
w
w
W
W
a
a
d
d
a
a
:
:
-
-
i
i
n
n
f
f
e
e
k
k
u
u
j
j
ą
ą
n
n
i
i
e
e
d
d
z
z
i
i
e
e
l
l
ą
ą
c
c
e
e
s
s
i
i
ę
ę
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
i
i
-
-
I
I
n
n
t
t
e
e
g
g
r
r
u
u
j
j
ą
ą
s
s
i
i
ę
ę
z
z
c
c
h
h
r
r
o
o
m
m
o
o
s
s
o
o
m
m
a
a
m
m
i
i
g
g
o
o
s
s
p
p
o
o
d
d
a
a
r
r
z
z
a
a
Z
Z
a
a
l
l
e
e
t
t
a
a
:
:
-
-
D
D
ł
ł
u
u
g
g
i
i
c
c
z
z
a
a
s
s
e
e
k
k
s
s
p
p
r
r
e
e
s
s
j
j
i
i
L
L
i
i
p
p
o
o
s
s
o
o
m
m
y
y
•
•
S
S
y
y
n
n
t
t
e
e
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
e
e
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
y
y
•
•
Z
Z
a
a
l
l
e
e
t
t
y
y
:
:
-
-
N
N
i
i
e
e
m
m
a
a
o
o
g
g
r
r
a
a
n
n
i
i
c
c
z
z
e
e
ń
ń
c
c
o
o
d
d
o
o
w
w
i
i
e
e
l
l
k
k
o
o
ś
ś
c
c
i
i
D
D
N
N
A
A
w
w
b
b
u
u
d
d
o
o
w
w
a
a
n
n
e
e
g
g
o
o
d
d
o
o
w
w
e
e
k
k
t
t
o
o
r
r
a
a
-
-
D
D
N
N
A
A
n
n
i
i
e
e
i
i
n
n
t
t
e
e
g
g
r
r
u
u
j
j
e
e
z
z
c
c
h
h
r
r
o
o
m
m
o
o
s
s
o
o
m
m
a
a
m
m
i
i
g
g
o
o
s
s
p
p
o
o
d
d
a
a
r
r
z
z
a
a
W
W
a
a
d
d
y
y
:
:
-
-
N
N
i
i
s
s
k
k
a
a
w
w
y
y
d
d
a
a
j
j
n
n
o
o
ś
ś
ć
ć
t
t
r
r
a
a
n
n
s
s
f
f
e
e
r
r
u
u
N
N
a
a
g
g
a
a
c
c
z
z
ą
ą
s
s
t
t
e
e
c
c
z
z
k
k
a
a
D
D
N
N
A
A
K
K
o
o
l
l
i
i
s
s
t
t
a
a
c
c
z
z
a
a
s
s
t
t
e
e
c
c
z
z
k
k
a
a
D
D
N
N
A
A
n
n
i
i
o
o
s
s
ą
ą
c
c
a
a
l
l
e
e
c
c
z
z
n
n
i
i
c
c
z
z
e
e
g
g
e
e
n
n
y
y
,
,
m
m
o
o
g
g
ą
ą
b
b
y
y
ć
ć
m
m
i
i
e
e
j
j
s
s
c
c
o
o
w
w
o
o
p
p
o
o
d
d
a
a
n
n
e
e
n
n
p
p
.
.
d
d
o
o
m
m
i
i
ę
ę
ś
ś
n
n
i
i
(
(
D
D
M
M
D
D
)
)
W
W
a
a
d
d
y
y
:
:
-
-
N
N
i
i
s
s
k
k
a
a
w
w
y
y
d
d
a
a
j
j
n
n
o
o
ś
ś
ć
ć
-
-
N
N
i
i
e
e
j
j
e
e
s
s
t
t
s
s
t
t
a
a
b
b
i
i
l
l
n
n
y
y
w
w
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
c
c
e
e
S
S
z
z
t
t
u
u
c
c
z
z
n
n
y
y
l
l
u
u
d
d
z
z
k
k
i
i
c
c
h
h
r
r
o
o
m
m
o
o
s
s
o
o
m
m
-
-
D
D
o
o
d
d
a
a
t
t
k
k
o
o
w
w
y
y
m
m
i
i
n
n
i
i
c
c
h
h
r
r
o
o
m
m
o
o
s
s
o
o
m
m
w
w
p
p
e
e
ł
ł
n
n
i
i
p
p
o
o
d
d
l
l
e
e
g
g
a
a
r
r
e
e
p
p
l
l
i
i
k
k
a
a
c
c
j
j
i
i
i
i
n
n
f
f
o
o
r
r
m
m
a
a
c
c
j
j
i
i
g
g
e
e
n
n
e
e
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
e
e
j
j
-
-
J
J
e
e
s
s
t
t
p
p
r
r
z
z
e
e
k
k
a
a
z
z
y
y
w
w
a
a
n
n
y
y
z
z
k
k
o
o
l
l
e
e
j
j
n
n
y
y
m
m
i
i
p
p
o
o
d
d
z
z
i
i
a
a
ł
ł
a
a
m
m
i
i
z
z
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
i
i
d
d
o
o
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
i
i
-
-
E
E
l
l
i
i
m
m
i
i
n
n
u
u
j
j
e
e
z
z
j
j
a
a
w
w
i
i
s
s
k
k
o
o
b
b
a
a
r
r
i
i
e
e
r
r
y
y
i
i
m
m
m
m
u
u
n
n
o
o
l
l
o
o
g
g
i
i
c
c
z
z
n
n
e
e
j
j
-
-
Z
Z
a
a
p
p
e
e
w
w
n
n
i
i
a
a
s
s
t
t
a
a
b
b
i
i
l
l
n
n
ą
ą
i
i
d
d
ł
ł
u
u
g
g
o
o
t
t
r
r
w
w
a
a
ł
ł
ą
ą
e
e
k
k
s
s
p
p
r
r
e
e
s
s
j
j
ę
ę
i
i
n
n
f
f
.
.
g
g
e
e
n
n
e
e
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
e
e
j
j
B
B
a
a
d
d
a
a
n
n
i
i
a
a
p
p
r
r
o
o
w
w
a
a
d
d
z
z
o
o
n
n
e
e
w
w
P
P
o
o
l
l
s
s
c
c
e
e
:
:
1
1
.
.
T
T
e
e
r
r
a
a
p
p
i
i
a
a
g
g
e
e
n
n
o
o
w
w
a
a
c
c
z
z
e
e
r
r
n
n
i
i
a
a
k
k
a
a
2
2
.
.
T
T
e
e
r
r
a
a
p
p
i
i
a
a
r
r
a
a
k
k
a
a
j
j
e
e
l
l
i
i
t
t
a
a
g
g
r
r
u
u
b
b
e
e
g
g
o
o
3
3
.
.
T
T
e
e
r
r
a
a
p
p
i
i
a
a
w
w
ą
ą
t
t
r
r
o
o
b
b
i
i
a
a
k
k
a
a
4
4
.
.
T
T
e
e
r
r
a
a
p
p
i
i
a
a
g
g
l
l
e
e
j
j
a
a
k
k
a
a
i
i
o
o
p
p
o
o
n
n
i
i
a
a
k
k
a
a
W
W
P
P
o
o
l
l
s
s
c
c
e
e
o
o
d
d
5
5
l
l
a
a
t
t
p
p
r
r
o
o
w
w
a
a
d
d
z
z
o
o
n
n
e
e
s
s
ą
ą
j
j
e
e
d
d
n
n
e
e
z
z
p
p
i
i
e
e
r
r
w
w
s
s
z
z
y
y
c
c
h
h
i
i
n
n
a
a
j
j
b
b
a
a
r
r
d
d
z
z
i
i
e
e
j
j
z
z
a
a
a
a
w
w
a
a
n
n
s
s
o
o
w
w
a
a
n
n
y
y
c
c
h
h
w
w
ś
ś
w
w
i
i
e
e
c
c
i
i
e
e
b
b
a
a
d
d
a
a
ń
ń
n
n
a
a
d
d
g
g
e
e
n
n
e
e
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
i
i
e
e
m
m
o
o
d
d
y
y
f
f
i
i
k
k
o
o
w
w
a
a
n
n
ą
ą
s
s
z
z
c
c
z
z
e
e
p
p
i
i
o
o
n
n
k
k
ą
ą
p
p
r
r
z
z
e
e
c
c
i
i
w
w
c
c
z
z
e
e
r
r
n
n
i
i
a
a
k
k
o
o
w
w
i
i
.
.
Z
Z
a
a
s
s
t
t
o
o
s
s
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
e
e
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
e
e
k
k
m
m
a
a
c
c
i
i
e
e
r
r
z
z
y
y
s
s
t
t
y
y
c
c
h
h
Zarodkowe komórki macierzyste (Embryonic stem cells) mogą dać początek wszystkim tkankom
naszego organizmu.
Interferencja RNA w medycynie
I
I
n
n
t
t
e
e
r
r
f
f
e
e
r
r
e
e
n
n
c
c
j
j
a
a
u
u
m
m
o
o
ż
ż
l
l
i
i
w
w
i
i
a
a
b
b
a
a
d
d
a
a
n
n
i
i
e
e
f
f
u
u
n
n
k
k
c
c
j
j
i
i
g
g
e
e
n
n
ó
ó
w
w
p
p
r
r
a
a
k
k
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
i
i
e
e
w
w
s
s
z
z
y
y
s
s
t
t
k
k
i
i
c
c
h
h
o
o
r
r
g
g
a
a
n
n
i
i
z
z
m
m
ó
ó
w
w
e
e
u
u
k
k
a
a
r
r
i
i
o
o
t
t
y
y
c
c
z
z
n
n
y
y
c
c
h
h
,
,
s
s
p
p
e
e
ł
ł
n
n
i
i
a
a
r
r
ó
ó
w
w
n
n
i
i
e
e
ż
ż
w
w
a
a
ż
ż
n
n
a
a
r
r
o
o
l
l
ę
ę
w
w
f
f
i
i
z
z
j
j
o
o
l
l
o
o
g
g
i
i
c
c
z
z
n
n
e
e
j
j
r
r
e
e
g
g
u
u
l
l
a
a
c
c
j
j
i
i
d
d
z
z
i
i
a
a
ł
ł
a
a
n
n
i
i
e
e
g
g
e
e
n
n
ó
ó
w
w
- Interferencja RNA to zdolność dwuniciowego RNA do silnego i swoistego wyciszenia ekspresji
danego genu
- Dwuniciowe RNA (dsRNA) to połączenie antysensowego RNA z sensowym RNA (sekw. identyczna
z mRNA)
- Takie dsRNA potrafi zahamować ekspresję genu ponad 10-krotnie skuteczniej niż każda pojedyncza
nić z osobna
Zastosowanie siRNA w terapii chorób człowieka
-
-
W
W
b
b
a
a
d
d
a
a
n
n
i
i
a
a
c
c
h
h
i
i
n
n
v
v
i
i
t
t
r
r
o
o
,
,
p
p
r
r
z
z
e
e
p
p
r
r
o
o
w
w
a
a
d
d
z
z
a
a
n
n
y
y
c
c
h
h
n
n
a
a
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
a
a
c
c
h
h
l
l
u
u
d
d
z
z
k
k
i
i
c
c
h
h
,
,
a
a
t
t
a
a
k
k
ż
ż
e
e
i
i
n
n
v
v
i
i
v
v
o
o
n
n
a
a
m
m
o
o
d
d
e
e
l
l
a
a
c
c
h
h
z
z
w
w
i
i
e
e
r
r
z
z
ę
ę
c
c
y
y
c
c
h
h
,
,
u
u
d
d
a
a
ł
ł
o
o
s
s
i
i
ę
ę
z
z
a
a
h
h
a
a
m
m
o
o
w
w
a
a
ć
ć
r
r
e
e
p
p
l
l
i
i
k
k
a
a
c
c
j
j
ę
ę
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
a
a
H
H
I
I
V
V
,
,
p
p
o
o
l
l
i
i
o
o
m
m
y
y
e
e
l
l
i
i
t
t
i
i
s
s
,
,
g
g
r
r
y
y
p
p
y
y
,
,
R
R
S
S
V
V
,
,
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
ó
ó
w
w
z
z
a
a
p
p
a
a
l
l
e
e
n
n
i
i
a
a
w
w
ą
ą
t
t
r
r
o
o
b
b
y
y
t
t
y
y
p
p
u
u
B
B
i
i
C
C
(
(
H
H
B
B
V
V
,
,
H
H
C
C
V
V
)
)
i
i
c
c
o
o
r
r
o
o
n
n
a
a
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
a
a
z
z
w
w
i
i
ą
ą
z
z
a
a
n
n
e
e
g
g
o
o
z
z
S
S
A
A
R
R
S
S
-
-
W
W
I
I
f
f
a
a
z
z
ę
ę
b
b
a
a
d
d
a
a
ń
ń
k
k
l
l
i
i
n
n
i
i
c
c
z
z
n
n
y
y
c
c
h
h
w
w
e
e
s
s
z
z
ł
ł
y
y
t
t
e
e
s
s
t
t
y
y
a
a
e
e
r
r
o
o
z
z
o
o
l
l
u
u
z
z
a
a
w
w
i
i
e
e
r
r
a
a
j
j
ą
ą
c
c
e
e
g
g
o
o
p
p
r
r
z
z
e
e
c
c
i
i
w
w
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
o
o
w
w
e
e
s
s
i
i
R
R
N
N
A
A
,
,
s
s
k
k
i
i
e
e
r
r
o
o
w
w
a
a
n
n
e
e
p
p
r
r
z
z
e
e
c
c
i
i
w
w
k
k
o
o
w
w
i
i
r
r
u
u
s
s
o
o
w
w
i
i
R
R
S
S
V
V
-
-
O
O
p
p
i
i
s
s
a
a
n
n
y
y
c
c
h
h
z
z
o
o
s
s
t
t
a
a
ł
ł
o
o
w
w
i
i
e
e
l
l
e
e
s
s
k
k
u
u
t
t
e
e
c
c
z
z
n
n
y
y
c
c
h
h
p
p
r
r
ó
ó
b
b
z
z
m
m
i
i
e
e
r
r
z
z
a
a
j
j
ą
ą
c
c
y
y
c
c
h
h
d
d
o
o
z
z
a
a
h
h
a
a
m
m
o
o
w
w
a
a
n
n
i
i
a
a
p
p
r
r
o
o
l
l
i
i
f
f
e
e
r
r
a
a
c
c
j
j
i
i
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
e
e
k
k
n
n
o
o
w
w
o
o
t
t
w
w
o
o
r
r
o
o
w
w
y
y
c
c
h
h
p
p
r
r
z
z
y
y
u
u
ż
ż
y
y
c
c
i
i
u
u
s
s
i
i
R
R
N
N
A
A
.
.
B
B
a
a
d
d
a
a
n
n
i
i
a
a
p
p
r
r
o
o
w
w
a
a
d
d
z
z
o
o
n
n
o
o
n
n
a
a
h
h
o
o
d
d
o
o
w
w
l
l
a
a
c
c
h
h
k
k
o
o
m
m
ó
ó
r
r
k
k
o
o
w
w
y
y
c
c
h
h
i
i
n
n
v
v
i
i
t
t
r
r
o
o
-
-
W
W
d
d
r
r
o
o
ż
ż
e
e
n
n
i
i
e
e
s
s
i
i
R
R
N
N
A
A
d
d
o
o
l
l
e
e
c
c
z
z
e
e
n
n
i
i
a
a
z
z
w
w
i
i
a
a
z
z
a
a
n
n
e
e
g
g
o
o
z
z
w
w
i
i
e
e
k
k
i
i
e
e
m
m
z
z
w
w
y
y
r
r
o
o
d
d
n
n
i
i
e
e
n
n
i
i
a
a
p
p
l
l
a
a
m
m
k
k
i
i
ż
ż
ó
ó
ł
ł
t
t
e
e
j
j
(
(
A
A
M
M
D
D
)
)
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
diagnostyka molekularna w medycynie 2 rokWL, biologia molekularna, interferencja RNA
diagnostyka molekularna w medycynie 2 rokWL, VI rok, Genetyka, Genetyka, Egzamin
diagnostyka molekularna w medycynie 2 rokWL 01
Diagnostyka molekularna w medycynie
Diagnostyka molekularna w medycynie
Organizacja Laboratorium Usługowego1B, studia-biologia, Studia magisterskie, Mgr sem III, Diagnostyk
Metody diagnostyki nowotworow, Medycyna, Onkologia
Diagnostyka molekularna niedobo Nieznany
diagnostyka molekularna 2
Diagnoza lekarska, MEDYCYNA O, INTERNA, interna(2)
DIAGNOSTYKA HIPERKALCEMII, Medycyna, Interna, Endokrynologia (w tym diabetologia)
Diagnostyka molekularna, genetyka
diagnostyka molekularna
Organizacja Laboratorium Usługowego1A, studia-biologia, Studia magisterskie, Mgr sem III, Diagnostyk
DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA 5, Medycyna, Diagnostyka Laboratoryjna (pajro)
DIAGNOSTYKA LABORATORYJNA 7, Medycyna, Diagnostyka Laboratoryjna (pajro)
więcej podobnych podstron