29.03.2010r.

Temat: Zasady pracy w laboratorium mikrobiologicznym. Badanie czystości mikrobiologicznej środowiska pracy (ocena czystości rąk, odzieży oraz powietrza i wody)

Mikroflora rąk:
człowiek: rezerwuar różnej mikroflory:
-oponkowce
- mikrokoki
- paciorkowce
- laseczki tlenowe Bacillus
- pałeczki Lactobacillus, Klabsielia, Enterobacter
- drożdże
- mikoplazmy
- liczne wirusy
Może być źródłem zanieczyszczenia mikrobiologicznego pacjentów (środowisko szpitalne), wytworzonej żywności (przemysł spożywczy), wytworzonych leków (przemysł farmaceutyczny).

Drobnoustroje:
- zasiedlają skórę, włosy, błony śluzowe, jamę nosowo-gardłową oraz przewód pokarmowy
- tworzą mikroflorę stałą (tworzy selektywną barierę przed inwazją drobnoustrojów chorobotwórczych)
- mikroflora chorobotwórcza pochodzi z zakażeń lub nosicielstwa

Nosicielstwo Staphylococcus aureus (Gronkowiec złocisty)
- jama nosowo-gardłowa, błony śluzowe zdrowego worka spojówkowego oka
- przeciętnie stwierdzone u 30-60% osób, a u 1/3 nosicieli występują szczepy zdolne do wytwarzania enterotoksyn (mogą one zostać przenoszone na pacjenta poprzez leki, bądź środek spożywczy, namnażać się i wytworzyć enterotoksynę)
Badania w kierunku nosicielstwa Staphylococcus ureus
- materiał do badań: wymazy z przedsionka nosa (z obu przedsionków!)
- metody pobrania: wymaz z obydwu przedsionków należy pobrać wymazówką zwilżoną w jałowej soli fizjologicznej
- posiać na podłoże agar z krwią lub Chapmana
- po identyfikacji wyrosłych drobnoustrojów dla szczepów S. aureus należy ocenić wrażliwość na oksacyline i mupirocynę.

Rodzaje enterobacteriaceae:
- endogenne bakterie przewodu pokarmowego człowieka (pałeczki Salmonella spp)

Mechanizmy chroniące skórę przed zakażeniem:
- substancje antybakteryjne wytwarzane przez florę naturalną
- lipidy skóry ograniczające wzrost np. Streptococcus spp
- suchość skóry ograniczająca kolonizacje Gramm ujemnych pałeczek i grzybów z rodzaju Conaida (częściej na skórze spotykamy Gramm dodatnie)

Mikroflora skóry (od 4-400 tys drobnoustrojów/ cm²)
Flora stała:
to drobnoustroje namnażające się w skórze tj:
- bakterie Gramm dodatnie Straphylococcus spp., Corynebacterium spp., Propieniabacterium ureus- w gruczołach łojowych
- pałeczki Gramm ujemne Acinetobacter spp
- w miejscach wilgotnych

Flora przejściowa
to drobnoustroje kolonizujące powierzchnie skóry bez namnażania się
- ich rodzaj i liczba zależy od zanieczyszczenia środowiska, z którym kontaktują się ręce od ewentualnych uszkodzeń skóry, zwiększonej potliwości rąk

Mycie i dezynfekcja rąk:
Mycie: mechanizm usuwania zabrudzenia, eliminuje większość drobnoustrojów należących do flory przejściowej
- użycie mydła i wody
Dezynfekcja: eliminuje w pełni florę przejściową i redukuje florę stałą
- użycie mydła, wody oraz alkoholu

Obszary dłoni najczęściej pomijane podczas zabiegu dezynfekcji i mycia rąk:
- palce
- kciuki
- 2,3 palec pomiędzy palcami-strona grzbietowa
- strona brzuszna-zagłębienie

Kategorie mycia rąk:
Zwykłe mycie rąk:
-eliminuje florę przejściową
- przy użyciu wody (… i mydła przez 10-15 sekund)

Higieniczne mycie rąk:
-eliminuje florę przejściową i częściowo florę stałą
- mycie zwykłe oraz dezynfekcja rąk przez 20-30 sekund przy użyciu płynu dezynfekcyjnego (zwykle mieszaniny alkoholu), w przypadku braku widocznego zabrudzenia rąk- można tylko dezynfekcję

Chirurgiczne mycie rąk:
- eliminuje florę przejściową i w znacznym stopniu stałą
-czas 3,5 minuty z nadgarstkami, przedramionami i czyszczenie paznokci, osuszenie sterylnym ręcznikiem, dwukrotna dezynfekcja

Technika mycia rąk według AYLIFFE
- z dozownika ściennego nanieść odpowiednia porcję mydła i myć ręce według schematu- każdy etap to 5 ruchów „tam i z powrotem”
a) pocieranie dłoni o dłoń
b) pocieranie dłoni miedzy palcami
c) dłoń na dłoń (palce splecione), mycie wewnętrznej strony palców: między palcami
d) pocieranie grzbietowej powierzchni zgiętej dłoni palców
e) kciuki- ujęty w drugą dłoń, ruchy obrotowe
f) obrotowe pocieranie opuszkami palców po wewnętrznej powierzchni dłoni- zagłębienia

Badanie mikrobiologicznej czystości rąk:
- Metoda odcisków: przy użyciu płytek z meniskiem wypukłym. Powierzchnię podłoża agarowego przyłożyć możliwie dużej wewnętrznej powierzchni, zamknąć płytkę, inkubować przez 72h w 30oC, a następnie wyrosłe kolonie zliczyć i zidentyfikować
-Metoda wymazów przy użyciu jałowych tamponów: Odciśniętym z płynu fizjologicznego tamponem zetrzeć wewnętrzne powierzchnie dłoni, tampon umieścić w 10ml płynu fizjologicznego, wstrząsać (5min) i wykonać posiew w kierunku:
- ogólnej liczy bakterii mezofilnych (agar odżywczy)
- obecności bakterii z grupy Gramm ujemnych coli (Mc Conkey'a)
- obecność gronkowców (Chapmana)

Mikrobiologiczna czystość rąk oraz wpływ mycia
- ręce czyste, jeśli na całej powierzchni badanej < 100 bakterii mezofilnych oraz brak gronkowców i bakterii z grupy coli
- ręce dostatecznie czyste, jeśli <1000 bakterii mezofilnych, a brak gronkowców i bakterii z grupy coli

Mikroflora powietrza:
- nieodpowiednie warunki dla rozwoju drobnoustrojów
- przenośnik drobnoustrojów
- stopień mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza zależy od:
jego ruchu
wilgotności
zapylenia
temperatury
nasłonecznienia
- liczba drobnoustrojów w pomieszczeniach jest większa niż w powietrzu w miejscach odkrytych zależy od :
ilości ludzi i sprzętów
stanu sanitarnego pomieszczeń
nasłonecznienia, wilgotności i wietrzenia pomieszczeń
zdrowotności i higieny osobistej ludzi w tym pomieszczeniu (personelu)
W powietrzu:

Micrococcus spp
Sorcina spp
Achromobacter spp
Bacillus spp
zarodniki grzybów
drożdże (Rhoddorula spp, Torulopsis spp)
pleśnie (Penicilium, Aspergilius)
mucom spp., Rhizopus spp, Cladosporium spp.

Występowanie drobnoustrojów w powietrzu zależy od:
- wrażliwości na wysychanie: odporne na wysychanie są: Mycobacterium tubercilosis, Bacillus Antharcis (laseczki wąglika), Pseudomonas ererginora, Staphylococcus spp
wrażliwe: Neisseria meningitidis
- wrażliwości na promieniowanie UV (barwniki karotenowe wytwarzane przez niektóre bakterie i drożdże, chronią ich komórki przed promieniowaniem UV, skuteczność działania promieniowania na drobnoustroje jest odwrotnie proporcjonalna do zapylenia powietrza

Ocena mikrobiologicznej czystości powietrza:
Metoda sedymentacyjna Kocha:
ustawienie w badanym pomieszczeniu otwartych na kilka minut płytek Petriego z podłożem dla bakterii i dla grzybów. W czasie tym drobnoustroje z powietrza osadzają się na powierzchni pożywki. Posiane płytki inkubuje się 24-48h w temperaturze 25-30^oC i liczy wyrosłe kolonie

Badania Omeliańskiego wykazały, że na płytce o powierzchni 100cm² osiada się po 5(6?) minutach tyle drobnoustrojów, ile znajduje się w 10dm³ powietrza!

Metoda filtrów membranowych:
określoną objętość powietrza filtruje się przez specjalne filtry przeznaczone do analizy powietrza wraz cząst. stałymi filtry zatrzymują mikroorganizmy. Liczbę mikroorganizmów na filtrze można określić metodą hodowlaną względnie mikroskopową

Metoda zatrzymywania mikroorganizmów w płynnej pożywce: specjalne skonstruowane urządzenia służą do przepuszczania powietrza przez odpowiedni roztwór sorbujący zanieczyszczenia stałe powietrza wraz z mikroorganizmami. Do tego celu stosuje się sól fizjologiczną, bulion lub inne roztwory. Jednostkę objętości roztworu z zatrzymanymi mikroorganizmami np. 1 cm3 posiewa się na stałe podłoże hodowlane i po inkubacji określa się liczbą jednostek tworzących kolonie. Liczbę mikroorganizmów (A) zawartą w 1cm3 oblicza się ze wzoru:

A=cl*v/V

cl-średnia liczba jednostek tworzących kolonie w 1cm3
v-objętość płynu sorbującego w cm3
V- objętość filtrowanego powietrza w m3

Próbniki powietrza: specjalnie skonstruowane aparaty do kontroli jakości mikrobiologicznej powietrza, wykorzystujące standardowe płytki Petriego oraz specjalne przygotowane płytki z podłożem. Wyposażone są w czynniki przepływu powietrza, co gwarantuje pobór określonej ilości powietrza i powtarzalność wyników.
W innej metodzie określona objętość powietrza pobiera się za pomocą aspirometru, przepuszcza się przez płuczki i uzyskuje się zawiesinę drobnoustrojów, którą posiewa się na odpowiednie podłoże

Metoda Della-Vaka
specjalnym przyrządem osadza się drobnoustroje z przepuszczonego powietrza bezpośrednio na powierzchnię płytki

Klasy czystości pomieszczeń szpitalnych:
-pomieszczenia I klasy czystości: do 70 kom/m³ powietrza; sale operacyjne wysokoaseptyczne, sale łóżkowe specjalne, pracownie rozp.. cytostatyków, centralna sterylizacja- część czysta
- pomieszczenia II klasy czystości: do 300 kom/m³ powietrza; bloki operacyjne, oddziały OIT, oddziały noworodków i wcześniaków, gabinety zabiegowe
- pomieszczenia III klasy czystości: do 700 kom/m³ powietrza; sale chorych, centralna sterylizatornia- część brudna

Mikroflora wody:
-naturalne środowisko, w którym drobnoustroje mogą nie tylko przetrwać, lecz także się rozwijać
- liczebność drobnoustrojów zależy od ilości pożywienia organicznego
- jest proporcjonalna do tzw. utlenialności wody, którą określa się na podstawie KMnO_4, jaką trzeba użyć do utlenienia zawartej w wodzie substancji organicznej. W zbiornikach wodnych dominują glony, sinice i bakterie. Wśród bakterii liczne są w wodzie organizmy psychrofilne.
Drobnoustroje w wodzie
drobnoustroje allochtoniczne - naniesione, do których zalicza się drobnoustroje pochodzące z powietrza i gleby, drobnoustroje przewodu pokarmowego ludzi i zwierząt, drobnoustroje pochodzące ze scieków przemysłowych
drobnoustroje autochtoniczne - tubylcze, dla których woda jest….

Podział drobnoustrojów w wodzie ze względu na zdrowie i gospodarzy człowieka:

saprofity
patogenne: chorobotwórcze - dostają się do wody z przewodu pokarmowego
szkodliwe w określonych gałęziach przemysłu

Drogą wodna przenoszone są:
- cholera wywołana przez Vibrio cholerae w wodach powierzchniowych przeżywają do kilku tygodni , a wodociągowych do kliku dni
-dur brzuszny, Salmonella Typhi, czerwonka Singella flexneri i Singella sonnei, tularemia Pastarella

Ocena mikrobiologicznej czystości wody:
Wykrywanie zanieczyszczeń kałowych prowadzi się pośrednio przez badanie obecności bakterii występujących w dużych ilościach w przewodzie pokarmowym, łatwych w hodowli i przeważnie nieszkodliwych w stosunku dla ludzi.
Bakterie te należą do grupy pałeczek okrężnicy, których najważniejsze gatunki to Escherichia coli, Enterobacter aeropenes. Zawartość bakterii z grupy coli powyżej normy świadczy o feralnym zanieczyszczeniu wody, a tym samym o możliwości występowania bakterii chorobotwórczych.

Ilościowo obecność bakterii z grupy coli określa się tzw. mianem coli
Miano coli to najmniejsza ilość badanej próby (w ml lub g), w której stwierdza się jeszcze obecność pałeczek z grupy coli.
Miano coli- gdy miano coli wynosi np. 10 znaczy to, że w 10cm³ lub 10g jest co najmniej 1 komórka z grupy pałeczek okrężnicy.
Zanieczyszczenie wody można także określić indeksem coli.

Indeks coli - jest to liczba pałeczek okrężnicy w 1dm³ wody
Miedzy mianem coli a indeksem coli istnieje zależność:

miano coli=1000/indeks coli

Woda pitna: powinna charakteryzować się następującymi parametrami:

-Miano coli nie mniejsze niż 100
-liczba bakterii na agarze odżywczym po 24h inkubowanych w temperaturze 37^oC nie większa niż 20
-liczba bakterii na agarze odżywczym po 72h inkubowanych w temperaturze 20^oC nie większa niż 100
Woda produkcyjna:
Stan sanitarny ma duże znaczenie w technologii żywności. Woda produkcyjna powinna odpowiadać pod względem stanu sanitarnego wodzie pitnej.
Jakość mikrobiologiczna wody ma szczególne znaczenie tam, gdzie woda jest jednym z głównych surowców, np. w winiarstwie, piwowarstwie
Zakażenie wniesione z wody mogą poważnie zakłócić prawidłowość procesów fermentacyjnych. Również woda używana do mycia urządzeń, opakowań i produktów, przewodów, nie powinna zakażać powierzchni z którymi się styka.

6

---