UWALNIANIE PRODUKTÓW WEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH

1. Wstęp teoretyczny

Ze względu na problemy z wydzielaniem Lipaz wewnątrzkomórkowych poza komórkę, są one poznane w dużo mniejszym stopniu. Aby wydzielić je poza komórkę stosuje się liczne metody:

Mechaniczne (bezpośrednie rozrywanie komórek)

- rozcieranie biomasy

- homogenizacja biomasy

Chemiczne (czynnik chemiczny nie może działać negatywnie na nasz produkt)

- ekstrakcja detergentami

- rozpuszczalniki organiczne (np. aceton)

- antybiotyki ( w celu zahamowania syntezy ściany

komórkowej)

Fizyczne - zamrażanie i rozmrażanie

- szok osmotyczny

- sonifikacja

- ultradźwięki

Enzymatyczne - lizozymy

- peptydoglikany

- drożdże

- glukanaza

W praktyce najczęściej stosowanymi metodami uwalniania składników wewnątrzkomórkowych są: ultradźwięki ( dobrze rozrywają bakterie „gram-”, ścinanie pod wpływem drgań)

mielenie w specjalnych młynkach ( z dodatkiem materiałów ściernych)

działanie wysokich ciśnień w stanie zamrożenia, stosuje się tzw. X-prasy ( przetłaczanie zamrożonej „pasty” przez małe otwory pod ciśnieniem 1000-6000 atm i gwałtowna dekompresja, co powoduje pękanie ścian komórkowych)

enzymatyczna liza ściany komórkowej, jest to dosyć kosztowna metoda ( najstarszym sposobem jest stosowanie enzymów litycznych ze ślimaka winniczka Helix pomatia lub lizozymu z białka kurzego)

Lipazy są enzymami z klasy hydrolaz, które rozkładają wiązania estrowe w tłuszczach. Końcowym produktem ich aktywności są wolne kwasy tłuszczowe i glicerol, a produktami pośrednimi - diglicerydy i monoglicerydy. W organizmie człowieka występują: lipaza żołądkowa i trzustkowa. Lipazy występują również u roślin i drobnoustrojów.

2. Cel ćwiczenia

.

3. Materiały i metody.

1. Materiał biologiczny.

Szczep grzybów nitkowatych Mucor circinelloides z kolekcji Instytutu Biochemii Technicznej hodowano na wstrząsarce w czasie 72 godzin w temp. 30^oC na podłożu zawierającym namok kukurydziany i olej oliwkowy. Do kolby o pojemności 1000 cm³ wprowadzono 300 cm³ podłoża hodowlanego i szczepiono kulturą mateczną za pomocą ezy. Nagromadzoną w wyniku hodowli biomasę sączono na przegrodzie celulozowej i przemywano wodą destylowaną.

2. Wykonanie ćwiczenia

2.1 Wydzielanie lipazy Mucor circinelloides z komórki:

2.1.1 Metoda I

Odważyć i gram biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia i zalać 5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Inkubować w temperaturze 37^oC w czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.2 Metoda II

Odważyć i gram biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia i zalać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm3 roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.3 Metoda III

Odważyć i gram biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do moździerza, dosypać bezołowiowych kulek szklanych i zalać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Rozcierać w czasie 10 minut. Całość przenieść do naczynia szklanego, dodać 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.4 Metoda IV

Odważyć i gram biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia i zalać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0. Homogenizować w czasie 2 minut zanurzając naczynie homogenizera w łaźni lodowej. Całość przenieść do naczynia szklanego, dodać 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.5 Metoda V

Odważyć i gram biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczyńka wykonanego z folii aluminiowej, dodać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i dwukrotnie zamrozić do temperatury -20^oC i rozmrozić. Całość przenieść do naczynia szklanego, dodać 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.1.6 Metoda VI

Odważyć i gram biomasy przemytej wodą destylowaną. Osad przenieść do naczynia szklanego i zalać 5 cm³ acetonu. Mieszać w czasie 5 minut i odsączyć dobrze odciskając na przegrodzie ceramicznej. Operację przemywania acetonem powtórzyć 3 razy. Odwodnioną grzybnię rozłożyć pod wyciągiem na bibule i suszyć w czasie 15 minut. Całość przenieść do naczynie szklanego, dodać 4,5 cm³ 0,05 M buforu fosforanowego o pH 7,0 i 0,5 cm³ roztworu cholanu sodu. Inkubować w temperaturze 37^oC o czasie 15 minut. Następnie przesączyć na przegrodzie celulozowej. W przesączu oznaczyć aktywność lipazy.

2.2 Oznaczenie aktywności esterazowej lipazy

Substratem do oznaczenia aktywności jest octan p-nitrofenolu, który pod działaniem esteraz i lipaz ulega hydrolizie z wydzieleniem p-nitrofenolu. Maksimum pochłaniania światła dla tego związku występuje przy długości fali 399nm. Sam octan p-nitrofenolu nie wykazuje pochłaniania przy tej długości światła. Bezpośrednio przed użyciem substrat o stężeniu 50 μmoli/cm³ w acetonitrylu rozcieńczyć bezpośrednio przed użyciem pięciokrotnie wodą destylowaną.

2.2.1 Wykonanie oznaczenia

Do probówki wprowadzamy: 0,1 cm3 rozcieńczonego roztworu p-nitrofenoly, 0,8 cm3 buforu fosforanowego 0,05 M o pH 7,0 i 0,1 cm3 ekstraktu lipazy. Inkubujemy w temperaturze pokojowej w czasie 15 minut. Szybkość uwalniania p-nitrofenolu mierzymy za pomocą fotokolorymetru przy długości fali 399 nm. Stężenie uwolnionego p-nitrofenolu odczytać z krzywej kalibracyjnej.

4. Obliczenia

[ (μmol)/(ml*min)=U/ml]

∆A - różnica absorbancji

K - 0,076 [μmol/ml]

Vp - objętość próbki =1ml

Ve - objętość preparatu enzymatycznego = 0,1ml

t - czas inkubacji = 15 minut

5. Wyniki i ich omówienie

Tabela wyników wszystkich grup.

Wyniki naszej grupy zostały zaznaczone.

Obliczenia aktywności wykonałem dla wyników naszej grupy.

6. Wnioski

---