Laboratorium z biotechnologii

Ćwiczenie 6

Temat:

Wyodrębnianie preparatów enzymów z cieczy pohodowlanej bakterii

Data wykonania ćwiczenia: 7.04.2009 r.

1. Cel ćwiczenia

Ćwiczenie służy poznaniu niektórych metod stosowanych w produkcji przemysłowej preparatów enzymatycznych uzyskiwanych z bakterii na przykładzie proteinaz produkowanych przez Bacillus subtilis.

2. Wykonanie

Aby porównać efektywność różnych metod oddzielania biomasy i wydzielania produktu, każda grupa stosowała inną metodę.

1. Usuwanie biomasy B. subtilis z podłoża pohodowlanego

Pobrano 20 ml (V_0­) cieczy po hodowli B. subtilis. Odmierzony płyn wstawiono do łaźni z lodem i mieszając, dodano 0,1 g KH₂PO_4­ oraz 0,8 ml 50% roztworu CaCl₂. Po 10 min pozostawania w łaźni z lodem przeniesiono do kuwety wirówkowej. Do drugiej kuwety wprowadzono odpowiednią ilość wody w celu zrównoważenia. Następnie odwirowano w wirówce laboratoryjnej przez 10 min przy prędkości 4000 rpm. Po wirowaniu zmierzono objętość supernatantu (V₁).

1. oznaczanie zmętnienia

Próbkę cieczy pohodowlanej pobraną przed oddzieleniem biomasy rozcieńczono 20-krotnie i dokonano pomiaru absorbancji na „Specolu” wobec wody destylowanej przy długości fali 660 nm. Oznaczono również zmętnienie supernatantu po oddzieleniu biomasy (w tym przypadku nie było potrzeby wykonywania rozcieńczenia).

2. oznaczanie aktywności proteolitycznej metodą Ansona

Próby właściwe:

Ciecz pohodowlaną (przed oddzieleniem biomasy) oraz supernatant rozcieńczono 10-krotnie. Do 2 probówek wprowadzono po 1 ml hemoglobiny, a następnie dodano 0,2 ml 10-krotnie rozcieńczonego enzymu pochodzącego z prób pobranych przed i po oddzieleniu biomasy. Po wymieszaniu inkubowano 10 min w temperaturze otoczenia.

Po tym czasie do każdej z prób dodano 2 ml kwasu trójchlorooctowego w celu zatrzymania reakcji enzymatycznej, wymieszano i pozostawiono na 15 min. Następnie przefiltrowano na sączku z bibuły.

Próby kontrolne:

Do 2 probówek zawierających po 1 ml hemoglobiny dodano po 2 ml kwasu trójchlorooctowego, następnie do każdej probówki dodano 0,2 ml 10-krotnie rozcieńczonego enzymu pochodzącego z prób pobranych po przed i po oddzieleniu biomasy. Po wymieszaniu pozostawiono na 20 minut, po czym przesączono przez sączek z bibuły.

Pobieramy po 1 ml filtratów i przenosimy do podpisanych probówek, następnie dodajemy po 2 ml 0,6n NaOH i 0,6 ml odczynnika Folina (1:2), natychmiast mieszamy i pozostawiamy na 10 minut. Po tym czasie mierzymy absorbancję badanych prób na „Specolu” wobec odpowiednich prób kontrolnych przy długości fali 690 nm.

1. Wydzielanie subtilizyny z filtratu po oddzieleniu biomasy

Odmierzono 30 ml (V₀) cieczy pohodowlanej otrzymanej po oddzieleniu biomasy (pH cieczy wynosi 7,4; jest to punkt izoelektryczny produktu - subtilizyny) i przeniesiono do zlewki o pojemności 100 ml umieszczonej w łaźni z lodem. W celu wysolenia białka enzymatycznego z roztworu, małymi porcjami dodano 12 g stałego (NH­_4­)₂SO₄ , mieszając na mieszadle magnetycznym. W ten sposób osiągnięto stężenie soli 40% w/v. Zaprzestano mieszania i pozostawiono roztwór na 15 min w łaźni z lodem.

Po tym czasie przeniesiono ciecz do kuwety wirnikowej. Do drugiej kuwety wprowadzono taką ilość wody, aby zrównoważyć obydwa pojemniki. Odwirowano na wirówce laboratoryjnej (10 min, 4000 rpm). Ciecz nadosadową usunięto. Ponieważ jony wapnia stabilizują białko subtilizyny, osad rozpuszczono w 15 ml 0,1% roztworu (CH₃COO)₂Ca. Zmierzono końcową objętość otrzymanego roztworu (V₁).

1. oznaczanie stężenia białka metodą Lowry'ego

Ciecz pohodowlaną po oddzieleniu biomasy rozcieńczono 20-krotnie. Uzyskany roztwór subtilizyny rozcieńczono 40-krotnie. Do podpisanych probówek wprowadzono po 2 ml odczynnika C, a następnie dodano po 0,4 ml odpowiednich badanych roztworów. Całość inkubowano 10 min w temperaturze otoczenia. Potem dodano 0,2 ml odczynnika Folina (1:1), wymieszano i umieszczono w cieplarce o temperaturze 37˚C. Równolegle wykonano próbę odczynnikową, zawierającą wodę destylowaną zamiast roztworu enzymu.

Po ok. 30 min zmierzono absorbancję prób badanych wobec próby kontrolnej na „Specolu” przy λ = 650 nm.

2. oznaczanie aktywności proteolitycznej metodą Ansona

Ciecz pohodowlaną po oddzieleniu biomasy rozcieńczono 10-krotnie. Uzyskany roztwór subtilizyny rozcieńczono 20-krotnie. Następnie wykonano oznaczenia analogicznie jak w punkcie 2.1. b)

3. Opracowanie wyników

Tabela 1. Wyniki zbiorcze - etap 1.

grupa	I ETAP - oddzielenie biomasy	objętość [ml]	OD660 = E660 · R	aktywność proteolityczna [mjA/ml]
1.	ciecz wyjściowa V0	30	14,6	2,25	66
		po wirowaniu V1	26	0,85		1,72
	2.	ciecz wyjściowa V0	20	9,4		2,5	15
		po koagulacji i wirowaniu V1	19	0,15		0,4
	3.	ciecz wyjściowa V0	20	14,8		1,8	29
		po koagulacji i filtracji V1	16	0,14		0,65
	4.	ciecz wyjściowa V0	20	10,4		1,28	29
		po filtracji V1	19	7,2		0,55

Tabela 2. Wyniki zbiorcze - etap 2.

gru-pa	II ETAP - wydzielenie białka enzymat.	objętość [ml]	aktywność proteolit. [mjA/ml]	stężenie białka C [mg/ml]	wydajność aktywności	wydajność białka	stopień oczyszcze-nia
1.	ciecz wyjściowa V0	30	2,07	6,2	28,5	26,5	1,1
		roztwór enzymatyczny (wysolone białko) V1	17	1,04				2,9
	2.	ciecz wyjściowa V0	30	2,6				5,3	100	54,5	1,8
		roztwór enzymatyczny (wysolone białko) V1	17	4,62				5,1
	3.	ciecz wyjściowa V0	20	2,0				4,2	75,5	32	2,4
		roztwór enzymatyczny (wytrącanie etanolem)V1	10	3,11				2,7
	4.	ciecz wyjściowa V0	20	2,0				8,0	41	40	1,0
		roztwór enzymatyczny (wytrącanie etanolem) V1	11	1,5				5,8

przykładowe obliczenia:

• stężenie biomasy (gęstość optyczna przy długości fali 660 nm)

OD 660 nm = E₆₆₀ · R

E₆₆₀ - absorbancja przy długości fali 660 nm

R - rozcieńczenie

OD 660 nm = 0,47 · 20 = 9,4

• aktywność proteolityczna

A_10.2 = k · E₆₉₀ · R

k - współczynnik przeliczający absorbancję na jednostki Ansona wynikający z krzywej wzorcowej, równy 0,69 μmol Tyr / (min · ml)

E₆₉₀ - absorbancja przy długości fali 690 nm

R - rozcieńczenie

A_10.2 = 0,69 · 0,36 · 10 = 2,5 [μmol Tyr / (min · ml)] = 2,5 [mjA/ml]

Jednostka Ansona oznacza taką aktywność enzymu, która powoduje uwalnianie produktów rozpuszczalnych w TCA w ilości odpowiadającej jednemu milimolowi tyrozyny (określanej za pomocą odczynnika Folina-Ciocalteau) w czasie 1 minuty w 6 ml mieszaniny reakcyjnej zawierającej 1 ml roztworu enzymu i 5 ml 2% (w/v) roztworu hemoglobiny. Warunki standardowe reakcji: 25˚C, 10 min.

• wydajność aktywności

A¹_10.2 - aktywność próby właściwej

A⁰_10.2 - aktywność próby wyjściowej

V­₁ - objętość próby właściwej

V­₀ - objętość próby wyjściowej

• stężenie białka

C = K · E₆₅₀ · R

K - współczynnik wynikający z nachylenia krzywej wzorcowej, równy 0,5 mg/ml

E₆₅₀ - absorbancja przy długości fali 650 nm

R - rozcieńczenie

C = 0,5 · 0,53 · 20 = 5,3 [mg/ml]

• wydajność białka

C₁- stężenie białka w próbie właściwej

C₀ - stężenie białka w próbie wyjściowej

V­₁ - objętość próby właściwej

V­₀ - objętość próby wyjściowej

• stopień oczyszczenia

A_w - aktywność właściwa:

4. Wnioski

Najlepsze wyniki w procesie separacji biomasy uzyskuje się, stosując koagulację i filtrację (a także koagulację i wirowanie). Te operacje pozwalają na uzyskanie najbardziej klarownego roztworu. Wstępna koagulacja biomasy bardzo poprawia efektywność procesu (bez zastosowania koagulacji separacja biomasy jest dużo gorsza). Sama filtracja daje zdecydowanie najgorsze wyniki spośród badanych metod oddzielania biomasy, dla uzyskania lepszego efektu musi być wspomagana dodatkowymi operacjami poprzedzającymi.

Wyniki uzyskane dla drugiego etapu oczyszczania (wysalanie białka i wytrącanie etanolem) wskazują, że skuteczność obu metod jest porównywalna.

1

---