Konspekt wykładu 1 z Mikrobiologii

- Mikroorganizmy: bakterie, archeony, grzyby (z wyjątkiem grzybów kapeluszowych), protisty. Tab. 1.

- Wspólne cechy: 1) małe rozmiary, więc są niewidoczne dla oka ludzkiego; 2) budowa w postaci jednej komórki lub skupiska komórek; 3) obecność we wszystkich środowiskach i ich duży wpływ na żywe i nieożywione elementy tego środowiska.

- Rozmiary bakterii i archeonów mierzymy w mikrometrach (1 m=10^-3 mm). Zdolność rozdzielcza oka ludzkiego - 100 m. Typowe bakterie - od 1 do kilku mikrometrów długości bądź średnicy. np. Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) - 1 x 3 μm, Bacillus megaterium, (laseczka olbrzymia) - 1,5 x 4 m. Najmniejsze bakterie - rodzaj Mycoplasma (~ 0,3 m średnicy). Nanobakterie (0,05-0,20 μm) to być może artefakty. Bakterie-giganty: Epulopiscium fishelsoni (80 x 600 m) żyjąca w jelicie ryby cyrulika i Thiomargarita namibiensis, widoczna bez mikroskopu (100 do 750 m średnicy).

- Wielkość wirusów mierzymy w nanometrach (1 nm=10^-6 mm). Mają one od kilkudziesięciu do kilkuset nanometrów średnicy bądź długości. Zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego -to 0,2 m, więc wirusy oglądamy w mikroskopie elektronowym.

- Kształty prokariotów: kula, walec, skręcony walec. Ziarniak (coccus). Układy ziarniaków: dwoinki (Streptococcus pneumoniae), łańcuszki (Lactococcus lactis), tetrady i pakiety (Micococcus luteus), grona (Staphylococcus aureus). Te charakterystyczne układy komórek są bardzo ważne przy identyfikacji bakterii. Pałeczki (np. Escherichia coli) i laseczki (np. Bacillus megaterium). W literaturze anglojęzycznej nie ma takiego rozróżnienia. Wszystkie bakterie o kształcie walca - „rod”. Bakterie o kształcie skręconego walca - przecinkowce (Vibrio cholerae), śrubowce (Magnetospirillum magnetotacticum), krętki (np. Treponema pallidum, krętek blady). Kształty mniej regularne: Caulobacter sp. ma łodyżki (ang. stalk), Hyphomicrobium ma wyrostki (ang. prostheca). Bakterie pleomorficzne nie mają jednego, ściśle określonego kształtu, np. maczugowce (Corynebacterium sp.), choć większość ich komórek ma, jak ich nazwa wskazuje, kształt maczugi; np. mikoplazmy (Mycoplasma sp.). Promieniowce tworzą rozgałęzione filamenty, zwane strzępkami, a niektóre sinice, np. Oscillatoria sp. - nici złożone z wielu komórek (ang. trichome) (średnica jednej komórki ~7 m).

- Budowa komórki prokariotycznej i eukariotycznej.

- Pojęcia „prokariotyczny” i eukariotyczny” - Edouard Chatton (1937).

- Klasyfikacja organizmów żywych wg R.H. Whitakera (1969) - 5 królestw (Plantae, Protista, Animalia, Fungi i Monera).

- Carl Woese z Uniwersytetu Illinois - wykorzystując sekwencje 16S rRNA i 18S rRNA jako zegara molekularnego stworzył trzy nadrzędne taksony o randze powyżej królestwa - domeny (ang. domain): Bacteria, Archaea i Eukarya, wywodzące się od wspólnego przodka (ang. universal ancestor). Uproszczona forma drzewa filogenetycznego organizmów żywych przedstawiona przez Woesego (Rys. 1).

- Budowa rybosomów. Sposób badania sekwencji 16S rRNA i jej wykorzystanie do celów taksonomicznych. Rys. 2

- Cechy charakterystyczne dla domen: Bacteria, Archaea i Eukarya. (Tabela 2a i 2b)

- Nazewnictwo bakterii i archeonów. System binominalny nomenklatury stworzony w XVIII wieku przez Linneusza. Tabela 3. Nadawanie nazw nowym bakteriom. Rys. 3.

- Taksonomia bakterii i archeonów staje się filogenetyczna. Takson - jednostka systematyczna dowolnego stopnia (gatunek, rodzaj, rodzina, rząd, klasa, typ, domena). Pojęcie gatunku u prokariotów. Gatunek to zbiór szczepów:

1. które mają podobną zawartość par GC;

2. których DNA charakteryzuje ponad 70% homologia (zbadana na podstawie hybrydyzacji);

3. których sekwencja rRNA jest w ponad 97% identyczna;

4. które fenotypowo odróżniają się od innych, podobnych gatunków.

Szczep to populacja komórek pochodzących od jednej komórki wyjściowej, która odróżnia się od innych populacji tego samego gatunku.

- Nie ma obecnie oficjalnej klasyfikacji wszystkich bakterii i archeonów.

- Drzewo filogenetyczne domeny Bacteria. Rys. 4.

Tabela 1 Mikroorganizmy

Mikroorganizmy	Budowa	Przynależność taksonomiczna (domena)
grzyby protisty	eukariotyczna	Eukarya
bakterie	prokariotyczna	Bacteria
archeony	prokariotyczna	Archaea

Tabela 2b Ogólna charakterystyka Bacteria, Archaea i Eukarya*

Cechy badane (fizjologiczne)	Bacteria	Archaea	Eukarya
1. dysymilacyjna redukcja S^olub        SO4^2- do H2S lub Fe^3+ do Fe^2+	tak	tak	nie
2. metanogeneza	nie	tak	nie
3. denitryfikacja	tak	tak	nie
4. chemolitotrofia z wykorzys-       taniem Fe, S i H2	tak	tak	nie
5. nitryfikacja	tak	nie	nie
6. wiązanie azotu	tak	tak	nie
7. fotosynteza na bazie chlorofilu        lub bakteriochlorofilu	tak	nie	tak (chloroplasty)
8. metabolizm energetyczny        związany z rodopsyną	tak	tak	nie
9. synteza granul zapasowych z        nasyconych, nierozgałęzionych        kwasów poli--hydroksy-       karboksylowych	tak	tak	nie
10. wzrost w temp. powyżej 80 ^oC	tak	tak	nie

Nie każdy członek danej domeny ma wszystkie opisywane cechy; niekiedy dana
cecha występuje tylko u nielicznych przedstawicieli.

Tabela 3. Nomenklatura prokariotów

Polska nazwa taksonu	Angielska nazwa taksonu	Końcówka nazwy taksonu	Przykład
domena	domain		Bacteria
typ	phylum		Proteobacteria
klasa	class		γ-Proteobacteria
rząd	order	-ales	Enterobacteriales
podrząd	suborder	-ineae
rodzina	family	-aceae	Enterobacteriaceae
rodzaj	genus		Salmonella
gatunek	species (sp.)		enterica
podgatunek	subspecies (subsp.)

W obrębie gatunków lub podgatunków wyróżnia się odmiany (ang. variety; var.), które nie mają oficjalnej pozycji w nomenklaturze. Biovars (biotype) - to szczepy różniące się cechami biochemicznymi lub fizjologicznymi; morphovars (biotype) - morfologicznymi; serovars (sv.) (serotype) - właściwościami antygenowymi; phagovars (fagotype) - wrażliwe na lizę specyficznymi fagami; pathovars (pv.) (pathotype) - - wykazujące patogenność dla specyficznego gospodarza. Mamy więc na przykład:

Salmonella enterica sv. Typhimurium

Rys. 2. Sposób badania sekwencji 16S rRNA i jej wykorzystanie do celów taksonomicznychn (nieobowiązkowe)

1. Namnaża się bakterie w odpowiedniej ilości,

2. izoluje się z nich całkowity DNA;

3. wyizolowany DNA (zawierający gen 16S rRNA) wykorzystuje się jako matrycę do    powielenia genu kodującego 16S rRNA z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy    (PCR, ang. polymerase chain reaction):

1. przygotowuje się mieszaninę reakcyjną, zawierającą: wyizolowany DNA, specyficzne startery (które są komplementarne do sekwencji genu 16S rRNA), termostabilną polimerazę DNA, wszystkie cztery deoksyrybonukleozydotrifosforany i odpowiedni bufor;

2. mieszanina zostaje ogrzana do temp. 95^oC, w której obie nici DNA ulegają rozdzieleniu (denaturacja);

3. mieszaninę schładza się do 45-60^oC, startery (dodane w nadmiarze) przyłączają się w miejscu homologicznym, a polimeraza, syntezuje nici komplementarne; z jednej cząsteczki DNA uzyskuje się więc dwie kopie genu rRNA, który chcemy powielić;

4. postępowanie to powtarza się wielokrotnie (temperatury są zmieniane automatycznie w odpowiednio zaprogramowanym urządzeniu), dzięki czemu uzyskuje się wiele kopii genu rRNA, bowiem każdy cykl podwaja ilość DNA (w praktyce 20-30 cykli daje 10⁶-10⁹-krotny wzrost liczby kopii sekwencji amplifikowanej.

4. Powielony (zamplifikowany) rDNA (DNA kodujący 16S rRNA) jest odzyskiwany z    mieszaniny reakcyjnej z zastosowaniem elektroforezy w żelu agarozowym) i    odpowiednio oczyszczany;

5. Czysty rDNA poddaje się automatycznemu sekwencjonowaniu w specjalnym aparacie,    dzięki czemu poznaje się sekwencję zasad w badanym rDNA, a więc kolejność ich    ułożenia;

6. Uzyskana sekwencja rDNA zostaje przyrównana do innych, znanych sekwencji z    wykorzystaniem odpowiedniego programu komputerowego, a następnie stosując inne    programy uzyskuje się drzewa filogenetyczne.

W bazie danych (ang. databases) sekwencji rRNA, zwanej Ribosomal Database Project (RDP), pod koniec roku 2002 znajdowało się około 16 000 sekwencji 16S rRNA, a w dniu 6.10.2003 było już ich 78 215. (http://rdp.cme.msu.edu/html/).

---