Bezpośrednie (mikroskopowe) metody pomiaru liczby drobnoustrojów:

• Liczenie drob przy użyciu komór

Komory do liczenia drob pod mikroskopem maja postać szklanych płytek z wyciętym wgłębieniem podzielonym na kwadraty lub prostokąty o znanej powierzchni. Używane są komory THOMA(hemocytometr),HOWARDA i inne.Różnią się one wymiarami powierzchni, na których liczy się drob. Dane dotyczące powierzchni i głębokości podane są na komorach. W komorach można liczyć tylko wieksze komórki drob, takie jak drożdże, zarodniki i strzępki grzybów. Ograniczenia te wynikają stąd, że grubość i głębokość komory nie pozwalają na użycie obiektywów o dużej sile powiększenia, a więc tym samym o małej odległości roboczej i przy dużej głębokości komory (100μm=0,1mm) małe drob, np. bakterie o śred 5μm mogą układać się w wielu płaszczyznach i przy użyciu silniejszych obiektywów o małej głębi ostrości część komórek położona nad i pod płaszczyzną pola widzenia będzie niewidoczna. Komora Thoma jest to grube szkiełko przedmiotowe z wyciętymi wgłębieniami o głęb 0,1mm, wgłębienia są widoczne gołym okiem po obu stronach środkowego kanalika jako równoramienne krzyże, powstałe z przecięcia linii wyznaczających regularne, kwadratowe powierzchnie. Bok małego kwadratu wynosi 1/20mm (50μm) powierzchnia kwadracika jest równa 1/400mm² (0,0025mm²=2500μm²) w każdej siatce znajduje się 256 kwadracików. Ozn liczby drob przy użyciu tej komory wykonuje się następująco. Zawiesinę kom drożdży mających tendencję do zlepiania się rozcieńczamy biorąc 5 objętości zawiesiny i 1 objętość kw siarkowego rozcieńczonego z wodą w stos 1:10 wytrząsa się kilka minut, przenosi do komory przykrywa szkiełkiem przykrywkowym i liczymy. Po ustawieniu oświetlenia należy znaleźć siatkę komory najpierw przy obiektywie 10x a potem przy obiektywie 40x. Jeśli stwierdzi się zbyt duże zagęszczenie drob to należy próbę rozcieńczyć ilościowo np. 10-krotnie i powtorzyć ozn. Oblicza się średnią ilość drob z ok. 40 kwadracików, w sumie należy policzyć ok. 700 kom by błąd nie przekraczał 10%. Kom rozmieszczone są nierównomiernie. Przy liczbie kom w jednym kwadraciku(a) i rozcień(n), zawartość kom(L) w 1cm³ wynosi: L=4*10⁶*a*n

• Liczenie drobnoustrojów metodą mikroskopową w preparacie przyżyciowym

Polega na wykonaniu preparatu bezpośredniego tj. naniesieniu kropli zawiesiny drob na powierzchnię szkiełka przedmiotowego i przykrycia szkiełkiem nakrywkowym. Pod mikroskopem liczy się średnią liczbę kom z 20-50 pól widzenia. Procedura ozn kom metodą mikroskopową(1)przygotować preparat i wyznaczyć średnią liczbę kom z 20 pól widzenia(2)obliczyć powierzchnie pola widzenia mikroskopu πr²(3)wyznaczyć objętość cieczy zawartej w preparacie πr²h zakładając, że grubośc preparatu wynosi 0,01mm(4)wyznaczyć mnożnik mikroskopu Mn=1000/πr²h na podstawie którego można określić ile razy objętość cieczy zawarta w preparacie mieści się w objętości 1cm³ Liczbę kom w 1cm³ hodowli (L) wyznacza się ze wzoru: L=Mn*a

Pośrednie (hodowlane) metody pomiaru liczby drobnoustrojów (metoda płytkowa i rozcieńczeń)

• Metoda płytkowa, wprowadzona przez Kocha ma szerokie zastosowanie m.in. do oceny stopnia zanieczyszczenia mikrobiologicznego środowiska, izolowania czystych kultur i ober morfologicznych. Polega na odpowiednim rozcień (w jałowym roztw soli fizjologicznej lub płynie Singera) badanej próbki i wysiewie na ostudzoną do 45ºC pożywkę YPG z agarem, inkubacji w tem 28ºC przez 48h (odwrócone pożywką do góry-zapobiega rozmywaniu kolonii przez wodę kondensacyjną) i policzeniu wyrosłych kolonii. Zakłada się, że kom występują pojedynczo a kolonie powstają z pojedynczych kom. Należy w tym celu przygotować odpowiednie rozcieńczenie. Współczynnik rozcień materiału, który należy ustalić na podstawie preparatu mikroskopowegopowienien zapewnić optymalną (30-300) liczbę kolonii wyrastających na sterylnej płytce Petriego. Liczbę drobnoustrojów znajdujących się w 1 cm³ lub 1g badanej próbki podaje się jako jednostki zdolne do tworzenia kolonii, czyli jako jtk/cm³

• Metoda rozcieńczeń stosowana do ozn najbardziej prawdopodobnej liczby drob (NPL) z zastosowaniem metody statystycznej.Przygotowuje się kolejne 10-krotne rozcień badanej próbki do pożywki płynnej YPG(w co najmniej 2 powtórzeniach) w takim zakresie, aby przynajmniej jeden wynik był negatywny.Po inkubacji dokonuje się charakterystyki liczbowej wzrostu. Wynik negatywny we wszystkich powtórzeniach tego samego rozcień ozn się jako 0, jedną próbę pozytywną jako 1 dwie jako 2. Na podstawie tych wyników odczytuje się ze specjalnej tablicy Mc Credyego najbardziej prawdopodobną liczbę drob w 1cm³.

Modyfikacje metod hodowlanych pomiaru liczby drobnoustrojów

• Płytki Petrifilm, wykonanie ozn wyjąć płytkę z torebki, podnieść górną folię, nanieść pipetą na środek płytki 1cm³ rozcień hodowli drob, przykryć folią i równomiernie przycisnąć płytką dociskową, płytki inkubujemy w termostacie 30ºC przez 48h, po inkubacji liczymy kolonie wyrosłe na płytkach Ptrifilm, wynik podajemy w jkt/cm³ po uwzględnieniu rozcień.

• Zestawy łopatkowe, otworzyć tubkę i wyjąć łopatkę, przyłożyć łopatkę jedną stroną do badanej powierzchni, przytrzymać przez 10s, przyłożyć łopatkę drugą stroną i ponownie przytrzymać 10s, umieścić łopatkę w tubce i inkubować w termostacie 30ºC przez 48h, po inkubacji policzyć kolonie wyrosłe na obu stronach łopatki wynik podać w jkt/cm² badanej powierzchni.

• Filtracja membranowa, pincetę zanurzyć w denaturacie i opalić w płomieniu, jałowy filter membranowy przenieść pincetą na porowatą płytkę jałowego preparatu filtracyjnego, zamocować lejek na aparacie filtracyjnym, wlać do lejka określoną objętość próby, włączyć pompę próżniową, przesączyć badaną próbę i spłukać ścianki lejka jałowym roztworem soli fizjologicznej, zdjąć lejek i wyjałowioną pincetą przenieść filtr na płytkę z odpowiednią pożywką hodowlaną, płytkę inkubować w termostacie 30ºC przez 48h, policzyć kolonie wyrosłe na powierzchni filtru, liczbę drob (L) w 1cm³ badanej próby obliczyć wg wzoru L=A/V

Pomiar ilości biomasy drobnoustrojów

• Metoda wagowa, odwirować 5g hodowli drożdży, potem biomasę przemyć 2-krotnie wodą destylowaną. Po przemyciu biomasę zawiesić w 2cm³ wody destylowanej, i przenieść do naczyńka wagowego o stałej znanej masie. Naczyńko z biomasą wysuszyć do stałej masy, na podstawie różnicy mas naczyńka z biomasą i pustego określamy ilość biomasy drożdży w g.s.s/100cm³ hodowli.

• Matoda spektrofotometryczna, pobrać 1cm³ hodowli, rozcień 20-krotnie wodą destylowaną. Zmierzyć absorbancję rozcień próby na spektrofotometrze przy dł fali λ=540nm. Z krzywej wzorcowej E=f(s.s) odczytać zawartość biomasy w rozcień próbie i po uwzględnieniu rozcień obliczyć ilość biomasy w 100cm³ hodowli, wynik podać w g.s.s/100cm³

Wpływ wysokich temp na przeżywalność drobnoustrojów i ciepłoodporność drobnoustrojów

Metody utrwalania żywności:

1. Pasteryzacja to technika konserwacji przy pomocy odpowiednio dobranego podgrzewania produktów spożywczych, tak aby zniszczyć lub zahamować wzrost drobnoustrojów chorobotwórczych lub enzymów przy jednoczesnym zachowaniu smaku produktów i uniknięciu obniżenia ich wartości odżywczych. Głównym zadaniem pasteryzacji jest przedłużenie trwałości produktów poprzez unieszkodliwienie form wegetatywnych mikroorganizmów. Proces ten nie niszczy jednak form przetrwalnikowych ani większości wirusów giną jedynie formy wegetatywne. Klasyczna metoda pasteryzacji polega na ogrzewaniu produktu do temperatury powyżej 60 °C, jednak nie większej niż 100°C. niska(63-65°C 20-30min dł czas) momentalna(85-90°C krótki czas, potem schładzamy) wysoka(85-100°C 15sek) Do utrwalania mleka, wina, piwa przetw. Owocowo-warzywnych, które maja pH poniżej 4,5 przetrwalniki tracą zdolność do kiełkowania.

2. Tyndalizacja - metoda konserw Specyficzną metodą pasteryzacji acji żywności, która polega na trzykrotnej pasteryzacji przeprowadzanej co 24 godziny. Mechanizm działania: pierwsza pasteryzacja zabija głównie formy wegetatywne, nie jest w stanie zabić niektórych form przetrwalnych;po upływie doby, pod wpływem impulsu termicznego z przetrwalników rozwijają się kolejne formy wegetatywne bakterii, które giną po drugiej pasteryzacji;trzecia pasteryzacja działa podobnie jak druga, zabijając ewentualne opóźnione bakterie.

3. Sterylizacja, wyjaławianie - jednostkowy proces technologiczny polegający na zniszczeniu wszystkich, zarówno wegetatywnych, jak i przetrwalnikowych form mikroorganizmów. Sterylizacji można dokonać mechanicznie, fizycznie, bądź chemicznie, najczęściej używa się metod fizycznych. Okresowa(120°C ) Ciągła (140°C 2-3min) UHT ultra wysoka temp(135-150°C) HTST(krótki czas temp wysoka w lab 117-121°C)

Ciepłooporność drobnoustrojów

• Każdy mikroorg różni się ciepłoopornością związane jest to z ich fizjologią

• Szczególnie oporne na wysokie temp są przetrwalniki bakterii, spowodowane to jest obkurczaniem i rozprężaniem(pęcznieniem) się warstwy korowej wówczas reguluje się zawartość wody w protoplaście

• Znacznie mniejszą ciepłooporność wykazują formy wegetatywne, czas decymalnej redukcji w temp 65°C dla większości tych form wynosi ok. 1min

• Komórki drożdży i strzępki pleśni także wykazują oporność cieplną podobną do form wegetatywnych, drożdże są zwykle mniej oporne od grzybów strzępkowych i ich komórki ulegają uszkodzeniu już w temp powyżej 40°C

• Konidia i spory grzybów są bardziej ciepłoodporne

Czynniki wpływające na ciepłoodporność: stan fizjologiczny bakterii(młodsze są wrażliwsze na temp), w środowiskach o bogatszym składzie chemicznym (formy wegetatywne i przetrwalniki są bardziej oporne), optymalne stężenie jonów wapnia i magnezu oraz obecność fosforanów, temp hodowli, korórki o dużej zawartości wody wykazują niższą oporność niż te które utraciły część wody przez przesuszenie.

Krzywa przeżycia drobnoustrojów, wyznaczanie czasu 10-krotnej redukcji D

Na układzie współrzędnych nanosimy zależność między czasem ogrzewania t a liczbą przeżywających komórek N, uzyskujemy wówczas krzywą przeżycia badanej populacji. Przyjmując, że drob giną w porządku logarytmicznym wprowadzono termin czas decymalnej redukcji oznaczany jako D. Wartość D jest miarą ciepłoodporności drob i wyznacza czas potrzebny do redukcji żywych komórek populacji o 90% w danej temp. Im wyższa wartość D tym bardziej ciepłoodporny jest dany gatunek drob. Klasyczna krzywa przeżycia ma przebieg prostoliniowy przy założeniu, że każda komórka w populacji jest jednakowo wrażliwa na działanie wysokich temp.

Krzywa czasu śmierci cieplnej TDT

Letalne działanie wysokiej temp na drob jest zależna nie tylko od czasu ogrzewania, ale też od wysokości temp. Nanosząc na układ współrzędnych zależność między temp ogrzewania drob a czasem 10-krotnej redukcji uzyskuje się krzywą czasu śmierci cieplnej, z której można odczytać wartość czasu decymalnej redukcji dla różnych temp. Do określenia wpływu temp na czas niszczenia komórek wprowadzono współczynnik ciepłooporności oznaczamy symbolem z. Wartość ta określa wzrost temp, który jest potrzebny do skrócenia czasu decymalnej redukcji o 90%. Wartość z można odczytać z krzywej TDT lub obliczyć ze wzoru: z=T₁-T₂ / logD₂-logD₁ gdzie T₁ T₂ temp ogrzewania, D₁ D₂ czas decymalnej redukcji w temp T₁iT₂ Im wyższa jest wartość z tym bardziej ciepłooporna jest badana populacja drob.

Pojęcie antybiotyku, drobnoustroje wytwarzające antybiotyki

Antybiotyki (z greki anti - przeciw, bios - życie) - małocząsteczkowe sub naturalne, wtórne produkty metabolizmu drobnoustrojów, które działając wybiórczo w niskich stężeniach wpływają na struktury komórkowe lub procesy metaboliczne innych drobnoustrojów hamując ich wzrost i rozmnażanie komórek. Antybiotyki są lekami stosowanymi w leczeniu wszelkiego rodzaju zakażeń bakteryjnych. Antybiotyki mogą mieć szkodliwe, bądź wąskie spektrum działania. Niszczą naturalną mikroflorę, nie działa na gospodarza ale na drobnoustroje, dlatego możę występować złe samopoczucie po zażyciu. Wówczas stosuje się probiotyki podczas kuracji antybiotykiem.

Główne mechanizmy działania antybiotyków to:

• Zakłócanie syntezy ściany komórkowej bakterii np. penicylina

• Upośledzenie przepuszczalności błony komórkowej bakterii. np. Gramicydyna

• Zakłócanie syntezy kwasów nukleinowych

• Zakłócanie syntezy białek np. Streptomycyna

Podział - budowa chemiczna

1. Pochodne aminokwasów β-laktamy: penicyliny, cefalosporyny,

polipeptydy: polimyksyny, bacytracyna,

glikopeptydy: wankomycyna,

lipopeptydy: daptomycyna

2. Pochodne cukrów aminoglikozydy: streptomycyna, gentamycyna

glikolipidy:

3. Antybiotyki makrocykliczne makrolidy: erytromycyna, klarytromycyna

makropolienowe: nystatyna

4. Chinony i ich pochodne antracykliny

tetracykliny: doksycyklina

benzochinony

5. Inne antybiotyki pochodne cykloalkanów, zw aromatyczne, zw steroidowe, nukleozydy, zw fosforoorganiczne.

Nystatyna-lek z grupy polienowych o działaniu przeciwgrzybiczym, wyodrębnionym z hodowli promieniowców Streptomyces nursei. Nystatyna działa przez wiązanie się z błonami komórkowymi, zwiększa się przepuszczalność między innymi dla K⁺, co prowadzi do zaburzeń metabolicznych w komórkach grzybów i ich śmierci. Nystatyna jest stosowana w leczeniu zakażeń grzybiczych wrażliwymi na ten antybiotyk grzybami, zwłaszcza kandydozy jamy ustnej, przewodu pokarmowego, układu moczowo-płciowego, skóry, gałek ocznych, paznokci, a także w profilaktyce zakażeń grzybiczych po leczeniu antybiotykami o szerokim spektrum działania oraz u chorych na nowotwory złośliwe (np. białaczki), przygotowywanych do zabiegów operacyjnych. Może powodować nudności, wymioty, a w większych dawkach biegunkę.

Streptomycyna- lek należący do grupy antybiotyków aminoglikozydowych, o wąskim zakresie działania na niektóre bakterie Gram-ujemne oraz na prątka gruźlicy który jest bakterią Gram-dodatnią Po raz pierwszy streptomycyna została wyizolowana z promieniowców Streptomyces griseus 19 października 1943 r. Dawniej powszechnie stosowany, obecnie został zarezerwowany wyłącznie do leczenia gruźlicy. Jej dość rzadkie stosowanie nawet w leczeniu gruźlicy związane jest z potencjalnym silnym działaniem ototoksycznym: może wywoływać zaburzenia słuchu i równowagi; ponadto obserwowano: zapalenie nerwu wzrokowego, zaburzenia widzenia, reakcje uczuleniowe (wysypka skórna, choroba posurowicza, gorączka polekowa, nadwrażliwość na światło), zaburzenia czynności nerek i in.; po bardzo dużych dawkach może wystąpić zapalenie mięśnia sercowego i zapaść.

Tetracyklina- antybiotyk tetracyklinowy, wytwarzany przez niektóre szczepy Streptomyces o szerokim spektrum przeciwbakteryjnym. Jest stosowany głównie w leczeniu trądziku. Działanie bakteriostatyczne. Hamuje biosyntezę białka poprzez wiązanie się z podjednostką 30 S rybosomu a także wpływa na procesy fosforylacyjne w komórkach bakteryjnych. Unieczynnia bakteryjne lipazy, powodując zmniejszenie wolnych kwasów tłuszczowych w skórze. Działa przeciwzapalnie poprzez hamowanie aktywności granulocytów wielojądrzastych. Działanie nieporządane: zaburzenie żołądkowo-jelitowe, suchość błon śluzowych, zapalenie języka i jamy ustnej, skórne reakcje uczuleniowe.

Definicja i cel dezynfekcji

Dezynfekcja(oznacza odkażanie) postępowanie mające na celu maksymalne zmniejszenie liczby drobnoustrojów, niszczenie drobnoustrojów w środowisku człowieka za pomocą środków chemicznych lub metod fizycznych. Dezynfekcja niszczy formy wegetatywne mikroorganizmów, a nie zawsze usuwa formy przetrwalnikowe. Zdezynfekowany materiał nie musi być jałowy.

Siła działania preparatu przeciwdrobnoustrojowego zależy od:

• Charakteru zw chemicznego

• Czasu kontaktu

• Stężenia związku (niższe opóźniają rozwój zaś wyższe działają bójczo)

• Temperatury

• Odczynu pH środowiska

• Wilgotności

• Obecności w środowisku sub organicznych

Czynniki fizyczne używane do dezynfekcji:

• Para wodna - do dezynfekcji wcześniej oczyszczonego sprzętu, odzieży, unieszkodliwiania odpadów, używa się pary wodnej w temperaturze 100-105 °C pod zmniejszonym ciśnieniem (0,5 - 0,45 atm). Pary wodnej pod normalnym ciśnieniem używa się od odkażania m.in. wyposażenia sanitarnego.

• Promieniowanie - do odkażania używa się promieni UV o długości fali 256 nm, które niszczą drobnoustroje w powietrzu i na niezasłoniętych powierzchniach.

Środki dezynfekcyjne powinny wykazywać następujące cechy:

• skuteczność

• działanie na drobnoustroje w małym stężeniu, w krótkim czasie w temperaturze otoczenia

• nietoksyczność dla ludzi w trakcie ich stosowania jak i po dezynfekcji

• możliwość spłukania wodą

• wykazywać szerokie spektrum działania

• brak narastania oporności drobnoustrojów

• stosunkowo niska toksyczność

• brak zapachu

• duża trwałość koncentratu i roztw użytkowych

• dobrze rozp się w wodzie

• występuje tolerancja do wody twardej i sub organicznych

• brak działania korodującego

• brak przebarwień dezynfekowanych powierzchni

• brak działania drażniącego naskórek i błony śluzowe

• wysoki stopień biodegradacji

• korzystne aspekty ekonomiczne

Ważniejsze gr związków dezynfekcyjnych, mechanizm działania na drobnoustroje

Do związków chemicznych najczęściej stosowanych w dezynfekcji należą

Chlorowce i zw uwalniające chlorowce

Zw amfoteryczne

Kw organiczne

Barwniki anilinowe i akrydynowe

Tlenek etylenu

Zw utleniające - głównie związki chloru; w praktyce używa się chloraminy organiczne (S, B, T) i podchloryny (sodu lub wapnia); do dezynfekcji rąk stosuje się chloraminy w stężniu 1%, a do odkażania pomieszczeń w stężeniu 5%; podchloryny działają najlepiej w pH obojętnym lub kwaśnym i w niskich temperaturach i stosuje się je do dezynfekcji pomieszczeń; Do środków utleniających zaliczamy również: nadmanganian potasowy i 3% roztwór H₂O₂ (wodę utlenioną).

Alkohole - aktywność bójcza alkoholi wzrasta wraz z liczbą atomów węgla w ich cząsteczce (C1-C5), a najczęściej stosowanym jest etanol (70%); propanol (80%) działa silnie alergicznie dlatego nie stosuje się go do dezynfekcji osobistej; zastosowanie w dezynfekcji znajduje również alkohol benzylowy; alkohole są wykorzystywane do dezynfekcji bez konieczności płukania wodą;

Aldehydy - najsilniejsze działanie antybakteryjne wykazuje aldehyd mrówkowy i aldehyd glutarowy; formalina (mieszanina 37% aldehydu mrówkowego z 10-15% aldehydem metylowym. Aldehyd glutarowy działa ma szerokie spektrum działania (bakterie Gram+ i Gram- w tym prątki gruźlicy, wirusy i grzyby chrobotwórcze;

Związki fenolu i ich pochodne - fenol i jego pochodne działają silnie bakteriobójczo (słabo antywirusowo) w środowisku kwaśnym np. krezol, rezorcynol

Kationowe zw powierzchniowo czynne - do tej grupy zalicza się czwartorzędowe związki amoniowe, Substancje te charakteryzuje szerokie spektrum działania (bakterie Gram+ i Gram-, grzyby pleśniowe, drożdże, wirusy) i długotrwały efekt sterylizacyjny;

Sole metali ciężkich - silne działanie bakteriobójcze wykazują sole rtęci i srebra; najbardziej rozpowszechnione są organiczne związki rtęci (fenylopochodne - merkurochrom i mertiolat)

Biguanidy, np. chlorheksydyna

Fiolet krystaliczny (barwnik), mleczan etakrydyny (Rivanol)

Metody oceny działania dezynfektantów na drobnoustroje (minimalne stężenia hamujące wzrost drobnoustrojów, stężenie użytkowe)

Działanie dezynfektantów:

• uszkadzają enzymy i inne struktury białkowe

• przerywają replikację i uszkadzają kwasy nukleinowe

• prowadzą do lizy, czyli niszczą ścianę komórkową bakterii

• mogą koagulować wnętrze komórki

• powodują inhibicję procesów oddychania i innych procesów metabolicznych

• prowadzą do utraty integralności błony a przez to do utraty zdolności przedostania się do komórek ważnych substancji: kationów potasu, pentoz, nukleotydów

Oporność na antybiotyki - jest to cecha części szczepów bakteryjnych, która umożliwia im przeciwstawianie się wpływowi antybiotyku. W zależności od pochodzenia, dzieli się ją na pierwotną (naturalna struktura bakterii uniemożliwiająca działanie leku) lub nabytą - na skutek nabycia genów oporności od innych bakterii lub spontanicznych mutacji.

Oporność

• może być stała lub przejściowa, która często może być adaptacyjna, może też być pseudooporność wynikająca z błędów w korzystaniu z dezynfektantu, np. użycie dezynf mającego niekorzystne spektrum działania na dane drobnoustroje, wówczas przeżywają one dalej

• stosowanie środków na „oko” zamiast zapoznać się z instrukcją dezynfektantów

• przedłużanie działania dezynfektanta może prowadzić do wytwarzania prawdziwej oporności w drobnoustrojach

• niedostateczny kontakt dezynf z powierzchnią

• niedostateczna ilość substancji aktywnych w dezynfektancie, to powoduje że mikroorg są oporne na jego działanie

Wyznaczanie stężenia użytkowego danego parametru

Stężenie użytkowe wyznacza się metodą nośnikową (z użyciem nośnika, np cylinderek z tworzywa sztucznego lub stali kwasoodpornej). Na nośnik nakłada się organizmy testowe, następnie suszy się nośnik i umieszcza w probówkach z różnymi stężeniami preparatów dezynfekujących. Po określonym czasie nośniki umieszcza się w roztworze inaktywującym dezynfektant, a potem do płynnej pożywki, inkubujemy przez 48h w optymalnej temp wzrostu dla danego szczepu wzrostowego.Stosujemy później dezynfektanty o większym stężeniu.

MIC(minimalne stężenie hamujące wzrost drobnoustrojów) jest parametrem charakteryzującym leki przeciwbakteryjne. Określa jakie stężenie leku ma aktywność bakteriostatyczną. Lek w stężeniu równym MIC hamuje rozwój i namnażanie drobnoustrojów, ale nie zabija istniejących komórek.

MIC = c_min * 0,005

Wyznaczanie MIC

• Metoda seryjnych rozcieńczeń na podłożu płynnym

Polega na przygotowaniu serii probówek z płynnym podłożem wzrostowym dla bakterii. Do probówek dodaje się badanego środka bakteriobójczego w odpowiednich, malejących stężeniach. Następnie do każdej probówki dodaje się taką samą ilość zawiesiny danego drobnoustroju z hodowli. Po 16-18 godzinnej inkubacji w temperaturze 35°C sprawdza się, w których probówkach rozwinęły się hodowle (obserwuje się zmętnienie w probówkach). W probówkach, w których stężenie leku było mniejsze od wartości MIC obserwuje się zmętnienie (wzrost bakterii). Najniższe stężenie antybiotyku, przy którym nie rozwijają się mikroorganizmy (podłoże są przejrzyste) wyznacza wartość MIC.

• Metoda seryjnych rozcieńczeń na podłożu stałym (z agarem)

Polega na przygotowaniu serii płytek ze stałym podłożem wzrostowym, z dodatkiem badanego antybiotyku, w malejących stężeniach. Na płytki posiewa sie bakterie z hodowli i po inkubacji obserwuje wzrost kolonii bakteryjnych. Wzrost na płytce więcej niż jednej kolonii bakteryjnej świadczy o tym, że stężenie antybiotyku w tej płytce było mniejsze od MIC. Najniższe stężenie antybiotyku, przy którym nie rozwija się więcej niż jedna kolonia, wyznacza wartość MIC.

Wpływ antybiotyków i barwników na drobnoustroje

Wykonanie: na środek płytki Petriego z bulionem zestalonym z agarem nanosimy 2 krople hodowli bakterii i równomiernie rozprowadzić na powierzchni pożywki sterylnym gładzikiem. Następnie wyjałowiona pincetą wyjąć sterylny krążek bibułowy i zanurzyć go w jednym z przygotowanych roztworów antybiotyków tzn penicyliny lub streptomycyny o stęż 1, 10, 100, 1000 lub 10000 j/cm³. Nasączony krążek z pomocą pincety umieszczamy na powierzchni pożywki. Na każdej płytce układamy w równych odstępach 5 krążków nasączonych roztw badanego antybiotyku. Płytki inkubujemy w temp 30ºC w czasie 24h.

Wnioski: streptomycyna ma szersze spektrum działania od penicyliny na bakterie Gram(-), penicylina hamuje natomiast wzrost bakterii Gram(+)

---