Laboratorium z Biotechnologii Ogólnej

Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Grupa IV

Ćwiczenie Nr 2

Temat: Biosynteza α - amylazy w hodowli wstrząsanej.

Data Wykonania Ćwiczenia: 13.10.2009r.

Data Oddania Sprawozdania: 20.10.2009r.

Skład Grupy:

Imię I Nazwisko	Numer Albumu
Tomasz Pietrzak	144576
Waldemar Guzek
Michał Orzechowski

1.WSTĘP:

Produkcja enzymów pochodzenia mikrobiologicznego jest typowym procesem biotechnologicznym. Pierwszym enzymem wyprodukowanym w ten sposób była Takadiastaza (mieszanina enzymów proteolitycznych i amylolitycznych) z hodowli Aspergillus oryzae. Jednak produkcję enzymów bakteryjnych rozpoczęto dopiero w 1913 roku, gdy stwierdzono, że szczep Bacillus subtilis wytwarza ciepłostałą α-amylazę. Obecnie enzym ten zajmuje 2 miejsce w produkcji preparatów enzymatycznych w świecie. Wynika to z bardzo szerokiego zastosowania tego enzymu w różnych gałęziach przemysłu.

Tradycyjnie preparaty te były wytwarzane metodą powierzchniową, obecnie jednak stosuje się metody hodowli wgłębnych z uwagi na: lepsze napowietrzanie, mniejsze ryzyko infekcji, większą wydajność oraz możliwość stosowania nowoczesnych technik automatyzacji.

Procesy biosyntezy α-amylazy bakteryjnej prowadzi się najczęściej w temperaturze 30-40°C w pH bliskim neutralnego i regulowanym najczęściej przez rosnącą populację. Stopień napowietrzania procesu określa się zazwyczaj skrótem vvm, oznaczającym objętość doprowadzonego powietrza na objętość cieczy w ciągu minuty, zaś szybkość mieszania skrótem rpm, czyli obroty mieszadła na minutę. Napowietrzanie obejmuje dwa ważne procesy: natlenianie i przewietrzanie. Przewietrzanie służy głównie do usuwania gazowych produktów metabolizmu bakterii, zaś natlenianie służy do dostarczenia odpowiedniej ilości tlenu niezbędnego do prawidłowego wzrostu kolonii. Napowietrzanie więc oraz mieszanie to dwa podstawowe parametry, które w łatwy sposób pozwalają nam na regulację procesu.

2. Cel Ćwiczenia:

Celem ćwiczenia jest poznanie podstawowych operacji przygotowania i prowadzenia procesu biosyntezy enzymu w hodowli wgłębnej (wstrząsanej) drobnoustrojów oraz ocena wpływu stężenia laktozy w pożywce na wydajność procesu.

Modelem będzie biosynteza α - amylazy w hodowli wstrząsanej bakterii z rodzaju Bacillus.

3. Metodyka.

3.1. Wykonanie hodowli.

3.1.1. Uaktywnienie Szczepu.

Szczep przechowywany na skosach agarowych w temp. 4°C uaktywniono przez przeniesienie na świeże skosy i inkubację w temp. 39°C przez 20±24 godziny. Uaktywniony szczep stanowi inokulum dla hodowli wstrząsanej.

3.1.2. Przygotowanie pożywki hodowlanej.

8 kolb (500cm³) wypełnionych pożywką hodowlaną o podanym niżej składzie według schematu:

2 kolby - wypełnienie 10% laktozą (50cm³)

2 kolby - wypełnienie 20% laktozą (100cm³)

2 kolby - wypełnienie 30% laktozą (150cm³)

2 kolby - wypełnienie 40% laktozą (200cm³)

Skład podłoża hodowlanego:

laktoza techniczna - jak powyżej

aminobak - 1,25%

namok kukurydziany - 0,35%

CaCl₂ - 0,0125%

NaCl - 0,20%

(NH₄)HPO₄ - 0,30%

(uzupełnione wodą do 100%)

Napełnione oraz oznaczone kolby (prawidłowo zamknięte korkami z waty) poddano procesowi sterylizacji. Sterylizację prowadzono w autoklawie przez 25 minut
przy temperaturze 121°C (1atm.). Po sterylizacji kolby wystudzono do temperatury
zbliżonej do temperatury przyszłej hodowli - 39°C.

3.1.3. Szczepienie Pożywki W Kolbach.

Przygotowane jak w p. 2.1.2. kolby zaszczepiono przez sterylne przeniesienie do każdej
z kolb określonej ilości inokulum (p. 2.1.1.). Można to wykonać dwiema metodami:

• przez przeniesienie do każdej kolby szczepu ze skosów w ilości „1 eza” na 50ml pożywki,

• przez zmycie uaktywnionych szczepów ze skosów (sterylną wodą) i dozowanie powstałej zawiesiny do każdej kolby w ilości 1ml przy pomocy sterylnej pipety.

3.1.4. Hodowla Wstrząsana - Biosynteza Enzymu.

Kolby z zaszczepionym jak w p. 3.1.3. podłożem przeniesiono na wstrząsarkę laboratoryjną, gdzie prowadzono hodowlę przy parametrach: obroty wstrząsarki - 240obr.,
amplituda - 4,5cm, temperatura - 39°C, czas procesu - ok. 40 godzin.

3.2. Metody Oznaczeń.

3.2.1.Oznaczenie aktywności α - amylazy. [A]

Do 0,5ml 1% roztworu skrobi rozpuszczalnej dodano 0,5ml roztworu enzymu
i po inkubacji w temperaturze 25°C w ciągu 3 minut wprowadzono 1ml DNS.
Następnie mieszaninę umieszczono w łaźni wrzącej na 5 minut. Po schłodzeniu dodano 8ml wody destylowanej. Równolegle wykonano próbę kontrolną, w której zamiast enzymu dodano 0,5ml wody destylowanej. Kolejnym etapem doświadczenia było oznaczenie gęstości optycznej badanego roztworu. Gęstość optyczną badanego roztworu oznaczono
na spektrofotometrze przy długości fali 540nm wobec próby kontrolnej.

Wykonano próby z kolb zawierających różne stężenia laktozy w podłożu (sposób wykonania rozcieńczeń):

1. Probówka 1 → 0,5ml roztworu [0,5% laktozy, rozc.. 200x]

Etap I: [rozcieńczenie 20-krotne]

0,5ml r-ru [0,5% laktozy w podłożu] + 9,5ml wody destylowanej

Etap II: [rozcieńczenie 200-krotne]

0,5ml r-ru [ rozc. 10-krotne] + 4,5ml wody destylowanej,

2. Probówka 2 → 0,5ml roztwotu [1% laktozy, rozc.. 200x]

Etap I: [rozcieńczenie 20-krotne]

0,5ml r-ru [1% laktozy w podłożu] + 9,5ml wody destylowanej

Etap II: [rozcieńczenie 200-krotne],

0,5ml r-ru [ rozc. 10-krotne] + 4,5ml wody destylowanej

Etap III: [rozcieńczenie 400-krotne]

0,5ml r-ru [ rozc. 2-krotne] + 0,5ml wody destylowanej],

3. Probówka 3 → 0,5ml roztworu [2% laktozy, rozc.. 400x]

Etap I: [rozcieńczenie 20-krotne]

0,5ml r-ru [2% laktozy w podłożu] + 9,5ml wody destylowanej

Etap II: [rozcieńczenie 200-krotne]

0,5ml r-ru [ rozc.. 10-krotne] + 4,5ml wody destylowanej

Etap III: [rozcieńczenie 400-krotne]

0,5ml r-ru [ rozc. 2-krotne] + 0,5ml wody destylowanej,

4. Probówka 4 → 0,5ml roztworu [3% laktozy, rozc.. 500x]

Etap I: [rozcieńczenie 20-krotne]

0,5ml r-ru [3% laktozy w podłożu] + 9,5ml wody destylowanej

Etap II: [rozcieńczenie 100-krotne]

0,5ml r-ru [ rozc.. 5-krotne] + 2,5ml wody destylowanej

Etap III: [rozcieńczenie 500-krotne]

0,5ml r-ru [ rozc. 5-krotne] + 2,5ml wody destylowanej,

5. Probówka 5 (próba kontrolna) → 0,5ml wody destylowanej.

Jednostka aktywności α - amylazy: przyjmuje się taką ilość enzymu, która w ciągu 3 minut
w temperaturze 25°C hydrolizuje skrobię (1% r-r) uwalniając taką ilość cukrów redukujących, która odpowiada 1mg maltozy.

3.2.2. Oznaczenie wzrostu biomasy. [B]

Do oznaczenia przygotowano 20-krotnie rozcieńczoną biomasę. Zmętnienie badanego roztworu oznaczono na spektrofotometrze przy długości fali 535nm wobec próby kontrolnej (woda destylowana).

0,5ml biomasy + 9,5ml wody destylowanej [rozcieńczenie 20-krotne]

Wykonano próby dla następujących stężeń:

1. Probówka 1 → 0,5%

2. Probówka 2 → 1%

3. Probówka 3 → 2%

4. Probówka 4 → 3%

5. Probówka 5 (próba kontrolna) → woda destylowana

4. Obliczenia:

4.1. Oznaczenie aktywności α - amylazy [A] - Obliczenia.

A = E₅₄₀ x 4 x rozcieńczenie

gdzie:

A - aktywność α - amylazy

4 - współczynnik,

E₅₄₀ - ekstynkcja przy długości fali 540nm,

rozcieńczenie - wartość rozcieńczenia wlanej cieczy pohodowlanej.

Probówka 1 → E₅₄₀ = 0,21

Probówka 2 → E₅₄₀ = 0,33

Probówka 3 → E₅₄₀ = 0,25

Probówka 4 → E₅₄₀ = 0,22

A = 0,21 x 4 x 200 = 168 [F-S/cm³]

A = 0,33 x 4 x 200 = 264 [F-S/cm³]

A = 0,25 x 4 x 400 = 400 [F-S/cm³]

A = 0,22 x 4 x 500 = 440 [F-S/cm³]

4.2. Oznaczenie wzrostu biomasy. [B]

Probówka 1 → E₅₃₅ = 0,12

Probówka 2 → E₅₃₅ = 0,21

Probówka 3 → E₅₃₅ = 0,41

Probówka 4 → E₅₃₅ = 0,7

5. Wyniki, Wykresy I Wnioski:

Tabela 1. Wyniki dla grupy nr 7.

	Aktywność α-amylazy	Wzrost Biomasy	Aktywność α -amylazy	Wzrost Biomasy	Aktywność α -amylazy	Wzrost Biomasy	Aktywność α -amylazy	Wzrost Biomasy
Stężenie laktozy	0,5%		1%		2%		3%
Grupa
7	168	0,120	264	0,21	400	0,410	440	0,700

Tabela 2. Tabela zbiorcza - wyniki wszystkich grup.(A- aktywność α-amylazy [jF-S/ml])

(B- wzrost biomasy [A_533nm])

	A	B	A	B	A	B	A	B
Stężenie laktozy	0,5%		1%		2%		3%
Grupa
1	304	0,285	384	0,320	512	0,570	620	0,810
2	205	0,205	385	0,340	480	0,540	560	0,870
3	232	0,150	392	0,190	592	0,380	620	0,530
4	332	0,332	368	0,460	608	0,880	700	0,990
5	256	0,172	392	0,282	672	0,576	760	0,770
6	212	0,142	324	0,165	528	0,315	690	0,580
7	168	0,120	264	0,210	400	0,410	440	0,700
8	172	0,150	280	0,210	440	0,400	460	0,580
Średnia z wyników	235	0,195	349	0,272	529	0,509	606	0,729

A - aktywność α - amylazy λ = 540nm

B - zmętnienie λ = 535nm

Rysunek 1. Wykres zależności zmętnienia [B] od stężenia laktozy w podłożu hodowlanym.

Rysunek 2. Wykres zależności aktywności α - amylazy [A] od stężenia laktozy w podłożu hodowlanym.

6. Wnioski:

Na podstawie wyników zawartych w tabelach 1. i 2. możemy zauważyć, że:

• wraz ze wzrostem stężenia laktozy w podłożu hodowlanym rośnie stężenie biomasy,

• niedobór laktozy (główny składnik) w pożywce hodowlanej może prowadzić do obniżenia wydajności α-amylazy,

• w badanym zakresie: stężenie laktozy w podłożu hodowlanym w granicach 2-3%
  jest optymalnym stężeniem,

• aktywność α - amylazy rośnie równomiernie aż do osiągnięcia optimum, następnie zaś następuje zahamowanie przyrostu aktywności,

• wyniki poszczególnych grup różnią się między sobą, te różnice mogą świadczyć
  o niedokładności wykonania doświadczenia, a ponadto grupy wykonywały pomiary na dwóch różnych spektrofotometrach co również mogło nieznacznie wpłynąć na wyniki doświadczenia.

.

- wynik średni dla wszystkich grup

- wynik dla grupy nr 7

- wynik średni dla wszystkich grup

- wynik dla grupy nr 7

---