Obraz5

Schemat niżej ilustruje sposób wiązania się polipeptydu na nośniku z immobilizo-- wanym jonem metalu:

R

NH

\

/

(

C=0

II

O

o=c

NH

NT A

Polipeptyd

Rys. 2. Zasada chromatografii IMAĆ - wiązanie się polipeptydu na nośniku z immobilizowanym jonem niklu (II)

Wymienione ligandy tworzą trój - lub czterokleszczowe chelaty z jonami niklu lub kobaltu, zatem możliwe jest utworzenie trzech (IDA) lub dwu (NTA) wiązań koordynacyjnych z białkiem - to determinuje siłę wiązania białko-metal, a tym samym -stężenie imidazolu konieczne do elucji tego białka. Ponieważ imidazol w wysokich stężeniach może niekorzystnie oddziaływać na białko, projektuje się inne ligandy ( pięcio-- kleszczowe) silniej wiążące metal, a słabiej białko.

Cel ćwiczenia :

Poznanie techniki chromatografii IMAĆ w zastosowaniu do oczyszczania rekombinowanego 6xHis-GFP i porównanie rozdziałów na IDA (Ni²^) Sepharose oraz Talon (Co²⁺)

2. Część eksperymentalna

2.1.    Aparatura i sprzęt

Spektrofotometr UV/VIS Kolektor frakcji (opcja)

Spektrofluorymetr (opcja)

Kolumny chromatograficzne 1,5 x 10 cm (np. Econo column, Sigma lub Kontes)

Pipety automatyczne, zmienno pojemnościowe

2.2.    Odczynniki

A)    Nośniki do chromatografii IDA (Ni²^) i Talon (Co²^) w buforze startowym

B)    Bufor startowy - 25 mM Tris-HCl, 0,3 M NaCl, pH 7,4

C)    Bufor startowy jw. z 10 mM imidazolem

D)    Bufor startowy j.w z 50 mM imidazolem

E)    Bufor startowy j.w z 125 mM imidazolem

F)    Bufor startowy j.w z 200 mM imidazolem

G)    Odwirowany lizat bakteryjny zawierający 6xHis-GFP w buforze startowym

H)    Około 50 mM roztwór EDTA.2Na

I)    Około 50 mM roztwór CoCF

2