3110399259

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych.

do probówki „H". Po dodaniu do prób pozostałą objętość enzymów natychmiast umieścić w temperaturze -20°C.

1.5    Po dodaniu enzymów zawartość probówek wymieszać poprzez kilkakrotne uderzenie palcem.

1.6    Inkubować każdą trawioną próbkę w 37°C przez 1 godzinę. Bezpośrednio przed naniesieniem próbek do dołków należy trawione próbki ogrzać w temperaturze 65°C przez 5 minut. Powoduje to rozerwanie wiązań wodorowych między komplementarnymi odcinkami lepkich końców powstałych po trawieniu.

1.7    Nanieść próbki (jak opisano w pkt. 5.1) do studzienek na żelu zgodnie z tabelą 10.7.

Tabela 10.7

nr studzienki	zawartość studzienki
1	standard wielkości DNA
2	nie trawiony plazmid pUC19
3	pUC19 trawiony restryktazą EcoRI
4	pUC19 trawiony restryktazą Haell
5	mieszanina pUC19 trawionych restryktazami EcoRI i Haell
6	standard wielkości DNA

3.2.4 Procedura przygotowania żelu agarozowego

1.1    Ustawić aparat do elektroforezy na wypoziomowanym statywie do wylewania żeli.

1.2    Umieścić na podium aparatu tackę przepuszczalną dla UV (tUVp). Uszczelnić tackę przez wsunięcie w odpowiednie szczeliny uszczelek i dokładnie sprawdzić szczelność układu. Umieścić grzebień we właściwych otworach podium tak, aby powstałe studzienki były możliwie najbliżej katody (oznaczonej czarnym kolorem). Podczas elektroforezy próbki kwasów nukleinowych migrują w kierunku anody (oznaczonej czerwonym kolorem).

1.3    Na podstawie wymiarów tacki tUVp odważyć odpowiednią ilość agarozy potrzebną do wylania warstwy żelu 0,5cm grubości. Stężenie agarozy w żelu podaje prowadzący ćwiczenie.

1.4    Przygotować odpowiednią ilość lx buforu elektroforetycznego TBE wystarczającą do przygotowania roztworu agarozy i napełnienia aparatu.

1.5    Do kolby Erlenmeyera przenieść ilościowo odważoną uprzednio ilość agarozy (patrz tabela 10.5) i uzupełnić do założonej objętości buforem. Wymieszać zawartość kolby celem zawieszenia proszku agarozowego w roztworze buforu.

Uwaga: Należy zaznaczyć poziom buforu w kolbie Erlenmeyera. Jeżeli w trakcie podgrzewania mieszaniny roztwór wyparuje, należy uzupełnić braki wodą dejonizowaną do początkowego poziomu.

1.6    Umieścić kolbę Erlenmeyera zawierającą mieszaninę w kuchence mikrofalowej, wybrać średnie ustawienie mocy kuchenki oraz przynajmniej 2 minutowy czas grzania. Po każdych 15 sekundach pracy należy przerwać proces podgrzewania i zamieszać zawartość kolby w celu zawieszenia nierozpuszczonych cząstek agarozy. Należy podgrzewać i co jakiś czas mieszać mieszaninę aż do

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia