3110399262

Ćwiczenie 10. Metody izolacji i rozdziału kwasów nukleinowych.

(związki rozpuszczalne w kwasach oraz lipidy) mogą zostać wykorzystane do przeprowadzenia analiz wybranymi metodami specyficznymi względem danego składnika. Dalsze etapy wspomnianych metod izolacji komórkowego/tkankowego materiału genetycznego, mające na celu frakcjonowanie RNA, fosfoprotein i wreszcie DNA różnią się w zależności od zastosowanej metody.

Tabela 10.1. Wydzielanie kwasów nukleinowych metodą Schmidta iThannhausera [1].

frakcja	wykonanie	związki fosforowe występujące w otrzymanej frakcji
materiał wyjściowy (tkanka)	homogenizacja tkanki świeżej lub zamrożonej
FI	3-krotna ekstrakcja homogenatu tkankowego schłodzonym (4 °C) 5 -10 % CCI3COOH	rozpuszczalne w kwasach związki fosforowe
F2	ekstrakcja homogenatu 80 % etanolem (25 °C) lub mieszaniną etanokchloroform = 3:1 (50 - 60 °C) lub mieszaniną etanoketer = 1:1 (25 °C)	fosfolipidy
F3	zasadowa hydroliza homogenatu 1 M NaOH lub 1 M KOH (1 ml na 100 mg tkanki) w 37 °C przez 8 h (lub 1 noc)	rybonukleotydy, DNA, fosfor nienukleotydowy (z fosfoprotein)
F4	dodanie 6 M HCI (zobojętnienie NaOH lub KOH) i następnie CCI3COOH (do uzyskania stężenia 5-10 %); odwirowanie (0 °C) otrzymanego osadu i następnie 2-krotne przemycie 5 % CCI3COOH	supernatant: rybonukleotydy, fosfor nienukleotydowy (z fosfoprotein); osad: DNA, proteiny i fosfoproteiny (białka komórkowe)
F5	kwasowa hydroliza otrzymanego osadu 5% CCI3COOH w 90 °C przez 15 min.	supernatant: deoksyrybonukleotydy, fosforany; osad: proteiny

W metodyce przyjętej przez Schmidta i Thannhausera kwasy rybonukleinowe (tabela 10.1) oddziela się od DNA i frakcji protein komórkowych stosując długotrwałą hydrolizę (w zależności od wariantu: 8 h lub pozostawiając homogenat na jedną noc) 1 M roztworem wodorotlenku sodu lub potasu w temperaturze 37 °C. W tych warunkach cząsteczki RNA hydrolizują do nukleotydów natomiast DNA pozostaje w postaci natywnej (niezhydrolizowanej). Uzyskaną mieszaninę rybonukleotydów oraz DNA i protein rozdziela się poprzez obniżenie odczynu pH zasadowego hydrolizatu z wykorzystaniem kwasów chlorowodorowego a następnie trichlorooctowego. Zakwaszenie hydrolizatu powoduje wytworzenie się osadu zawierającego DNA i proteiny, który na drodze wirowania oddziela się od ciekłej frakcji rybonukleotydów rozpuszczalnych w zastosowanych kwasach. DNA uzyskuje się poddając osad hydrolizie 5 % roztworem kwasu trichlorooctowego w temperaturze 95 °C przez 15 minut. Znane są liczne modyfikacje metody Schmidta i Thannhausera, których celem jest zwiększenie czułości metody. W przypadku wydzielania DNA z materiału biologicznego zawierającego niewielką jego ilość stosuje się dodatek 1 % roztworu albuminy jaja kurzego by zwiększyć wydajność precypitacji frakcji DNA i protein. W przypadku wykorzystywania technik spektrofotometrycznych do analizy składników frakcji, zamiast kwasu trichlorooctowego używa się roztworów kwasu nadchlorowego (wariant Tsaneva i Markova, 1960 r.), które charakteryzują się niewielkim pochłanianiem światła z zakresu 257-270 nm a więc takiego, jaki stosowany jest podczas spektrofotometrycznych metod ilościowego oznaczania zawartości RNA, DNA i białek. Niekiedy pożądana okazuje się zmiana kolejności odlipidowania i trawienia kwasów rybonukleinowych skutkująca rozdziałem rybonukleotydów oraz frakcji DNA i protein (wariant Nimierki, 1953 r.) pozwalająca na otrzymanie materiału zawierającego frakcje RNA oraz deoksyrybonukleidowo-proteinową natomiast pozbawionego frakcji lipidowej. Dodatkowo

www.ichip.pw.edu.pl/pilarek/biochemia