3893820134

Analiza Zmian na Poziomie Chromati Cyklu Komórkowym 13

Membran PVDF można używać kilkakrotnie - po ich wywołaniu, można odplukać przeciwciała I i II-rzędowe, a następnie powtórnie zablokować w mleku i powtórzyć inkubację z innymi przeciwciałami I-, a następnie II-rzędowymi.

Blokowanie membran

Po transferze wolne miejsca wiązania białek na membranie są blokowane, aby zapobiec niespecyficznej adsorpcji przeciwciał. Do blokowania membran najczęściej używa się odtłuszczonego mleka lub albuminy z surowicy cielęcej.

Wiązanie przeciwciał

Antygeny będące przedmiotem badań identyfikuje się przy użyciu wyznakowanych przeciwciał, bądź przeciwciał niewyznakowanych a identyfikowanych poprzez wyznakowane przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla pierwszorzędowych. W końcu następuje detekcja, której sposób zależy od rodzaju użytych przeciwciał.

Detekcja

Metoda detekcji białek w technice western biot zależy od rodzaju znacznika, jaki dołączony jest do przeciwciał. Najczęściej stosowane są alkaliczna fosfataza lub peroksydaza chrzanowa. Wizualizacja tych enzymatycznych znaczników może być przeprowadzona kolorymetrycznie (alkaliczna fosfataza, w miejscu związania przeciwciał do białka na membranie powstaje barwny produkt) lub chemiluminescencyjnie (peroksydaza, enzym przeprowadza reakcję z wytworzeniem światła, które naświetla kliszę fotograficzną).

ECL

W trakcie ćwiczeń wykorzystujemy metodę chemiluminescencyjną (ECL - ehanced chemiluminescence). Chemiluminescencja polega na wydzieleniu energii powstałej w wyniku reakcji chemicznej w postaci światła. Peroksydaza (sprzężona z przeciwciałami II-rzędowymi) w obecności naddenku wodoru utlenia luminol, a produktem tej reakcji jest związek o niższym stanie energetycznym. Nadmiar energii uwalniany jest w postaci fotonów światła.

Cel doświadczenia

Celem ćwiczenia jest porównanie poziomu fosforylacji histonu H3 w dzielących się komórkach tytoniu (BY-2) i komórkach zatrzymanych w fazie G₀ cyklu komórkowego.

Przejście zawiesiny do G„ uzyskuje się w przypadku komórek TBY-2 poprzez 30-krotne obniżenie zawartości sacharozy w pożywce.

Schemat doświadczenia:

-    Izolacja białek histonowych z komórek tytoniu (BY-2).

-    Ocena ilości wyizolowanych białek za pomocą SDS-PAGE.

-    Rozdział elektroforetyczny wyizolowanych białek i transfer na membranę PVDF metodą pół-suchą.

-    Detekcja fosforylowanego histonu H3 za pomocą specyficznych przeciwciał.

-    Uwidocznienie związanych przeciwciał metodą ECL

-    Analiza densytometryczna ilości wykrytego białka