3893820136

Analiza Zmian na Poziomie Cmromati Cyklu Komórkowym 15

_rX«ł

11. Osad wysuszyć strumieniem zimnego powietrza trzymając probówkę w lodzie lub próżniowo w liofilizatorze.

Uwaga: Na tym etapie można przerwać

doświadczenie, probówki z wysuszonym osadem można przechowywać w -20°C.

12. Zawiesić osad w 300 pl lx SDS loading buffer bez barwnika (uwaga: przygotowany bufor jest 5x stężony), przenieść do 1,5 ml probówek typu eppendorf i dodać po 15 pl IM DTT.

>.W celu usunięcia nierozpuszczalnego osadu żwirować w mikrowirówce przez 15 minut i przenieść do świeżych probówek. Tak uzyskane preparaty białkowe przechowywać w -20°C.

14. Zmierzyć absorbancję próbek przy długości fali 280nm przy pomocy spektrofotometru NanoDrop. Zapisać otrzymane wyniki (orientacyjne stężenie białka), które można zastosować do obliczeń. Należy pamiętać, że wyniki mogą być zawyżone ze względu na silne zanieczyszczenie prób innymi niż białka substancjami wyekstrahowanymi z roślin.

15. Do elektroforezy należy użyć równych ilości białka. Można to osiągnąć przez nałożenie na żel różnych objętości preparatów, tak aby ilości białka były takie same we wszystkich studzienkach (najlepiej po 30 pg). Przed elektroforezą dodać do próbek po 1 pl buforu 5xSDS z barwnikiem lub samego barwnika (Bromophenol Blue).

Dzień 2, 3. Elektroforeza SDS-PAGE (ok. 3 h), barwienie (przez noc)

Dla sprawdzenia wydajności i oceny jakości wyizolowanych podczas ćwiczeń białek stosujemy żel 12%. Rozdział białek w takim żelu zachodzi szybciej. Do analizy Western Biot lepszy będzie żel 15% (lepsza rozdzielczość dla białek histonowych). Przygotowanie żelu do SDS PAGE Materiały:

- 2 przekładki (spacers) grubości 1 mm

- szklana płytka

- porcelanowa płytka

- caster clamp

- caster

- 2 czarne śruby

- 2 czerwone klipsy

- grzebień o grubości 1 mm

- kalka ze wzorem studzienek

- bibuła filtracyjna

- aparat do elektroforezy

- zasilacz

Odczynniki:

- mieszanina monomerów (30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid)

- 1.5 M Tris-Cl pH 8.8

- 0.5 M Tris-Cl pH 6.8

- 10% SDS

- woda destylowana

- 10% APS £

- TEMED

- butanol nasycony wodą

- bufor SDS-PAGE (25 mM Tris, 192 mM glicyna,

0.1% SDS pH 8.3) \7

- roztwór utrwalający (7% kwas octowy, 40% metanol)

- roztwór barwiący: (0,025% Coomassie Brillant Blue G-250 w 10% kwasie octowym)

- roztwór odbarwiający (10% kwas octowy,

25% metanol)

- komercyjny ekstrakt histonów rdzeniowych

- Standard (marker) wielkości białek