3893820138

Analiza Zmian na Poziomie Chromati Cyklu Komórkowym 17

Masy cząsteczkowe histonów

Histon	Masa (kDa]
HI	19; 29
H2a	14,0
H2b	13,8
H3	15,3

Barwienie białek w żelu

Spośród wielu metod barwienia białek po SDS-PAGE wybrano najpowszechniej stosowaną metodę barwienia Coomassie Brillant Blue. Histony są białkami wysoce zasadowymi. W związku z tym ich migracja w żelu SDS jest zaburzona - tzn. położenie prążków nie odzwierciedla prawdziwej wielkości białek.

Należy pamiętać o tym, że jakość rozdziału w SDS-PAGE zależy od poprawnego i solidnego wykonania szeregu prostych czynności. Dlatego też, mimo iż technika nie jest skomplikowana, może zajmować sporo czasu, kilkakrotnie więcej niż elektroforeza w żelach agarozowych służąca do rozdziału preparatów DNA.

Przed przejściem do kolejnych etapów doświadczenia, ilość białek we wszystkich analizowanych próbach powinna być taka sama -wystandaryzowana.

Uwaga: jeśli planujemy wykonanie transferu białek warto przygotować żel na poprzednich zajęciach

Wykonanie

1. Po zakończeniu elektroforezy należy rozmontować aparat i delikatnie rozdzielić szyby.

2. Żel umieścić w roztworze utrwalającym i zostawić na kołysce laboratoryjnej na 15 - 30 minut.

3. Następnie usunąć utrwalacz i zalać roztworem barwiącym. Barwić do uzyskania wyraźnych prążków - pozostawienie żelu na dłużej w roztworze utrwalającym (np. na noc) przyspiesza barwienie białek.

Po zabarwieniu żel inkubować w roztworze odbarwiającym do uzyskania prawie przezroczystego tła i wyraźnych prążków białek - od kilku do kilkudziesięciu minut. Żel po odbarwieniu może być długo przechowywany w 10% metanolu. _kDa

Oszacować względne ilości “ z białka w poszczególnych

próbach. Ilości można__₇₀

oszacować „na oko”, Z ^

co bywa zawodne lub--40

zeskanować wybarwiony __ _

żel białkowy i oszacować ---₂₅

ilości za pomocą programu

komputerowego np. ImageJ--,_b

(densytometry cznie).

Podczas kolejnej

elektroforezy nakładać R_ys 5. Standard zbliżone ilości badanego wielkości-PageRuler białka do każdej studzienki Protein Molecular żelu. Weight Marker