Ćw. 7 Metabolizm bakterii - procesy oddechowe
Oddychanie -> reakcja kataboliczna prowadząca do powstania ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej z wykorzystaniem łańcucha transportu elektronów oraz egzogennego ostatecznego akceptora elektornów (organicznego lub nieorganicznego)
Ostateczne akceptory elektronów:
Egzogenne:
tlen (oddychanie tlenowe)
związki nieorganiczne (oddychanie beztlenowe), np. azotany, które są redukowane do azotynów, tlenków azotu i N2
Egzogenne akceptory elektronów wykorzystywane są w fosforylacji oksydacyjnej (czyli podczas oddychania)
Endogenne - związki organiczne powstałe z utlenienia substratu oddechowego, np. fumaran redukowany do bursztynianu, glicyna - do octanu, tlenek trimetyloaminy - do trimetyloaminy,
Endogenne akceptory elektronów wykorzystywane są w fosforylacji substratowej, czyli np. podczas fermentacji
Mechanizmy tworzenia ATP u chemoorganoheterotrofów:
Fosforylacja oksydacyjna - jest to mechanizm tworzenia ATP związany z transportem elektronów w łańcuchu oddechowym - w wyniku transportu elektronów powstaje siła protonomotoryczna napędzająca syntetazę ATP.
Aby fosforylacja oksydacyjna mogła zajść potrzeba:
substratu, który jest donorem elektronów - musi to być związek na tyle zredukowany, żeby mógł być utleniony
łańcucha transportu elektronów znajdującego się w błonie
zewnętrznego (egzogennego) akceptora elektronów - może to być tlen (oddychanie tlenowe), związki nieorganiczne (tylko u prokariotów)
Fosforylacja substratowa - zachodzi w czasie glikolizy i fermentacji. Ostatecznym akceptorem elektronów jest endogenny związek organiczny (jest to związek powstały z utleniania substratu oddechowego)
Fosforylacja substratowa zachodzi bez udziału łańcucha oddechowego -> dużo mniejszy zysk energetyczny niż w przypadku fosforylacji oksydacyjnej.
Podział bakterii ze względu na wymagania tlenowe:
Tlenowce - wykorzystują tlen jako ostateczny akceptor elektronów
Bezwzględne - bez tlenu ich rozwój jest niemożliwy
Względne - nie wymagają tlenu, jednakże ich rozwój lepiej przebiega w środowisku tlenowym, np. Escherichia coli
Mikroaerofile - mogą wykorzystywać tlen, ale bardzo słabo rosną w stężeniu tlenu z powietrza. Rosną w 1-15% stężeniu tlenu. Np. Enterococcus faecalis, Campylobacter jejuni, Magnetospirillum magnetotacticum
Beztlenowce - nie wykorzystują tlenu jako akceptora elektronów i nie są zdolne do wzrostu w atmosferze (21% stężeniu tlenu)
Aerotolerancyjne - tolerują niskie stężenie tlenu
Bezwzględne - nawet niskie stężenie tlenu jest dla nich letalne
Oddychanie azotanowe - oddychanie w którym azotany są wykorzystywane jako końcowe akceptory elektronów. Bakterie wykorzystujące ten typ oddychania są względnymi tlenowcami - w środowisku z dostępem tlenu wykorzystują go jako akceptor elektronów, dopiero gdy nie ma tlenu wykorzystują azotany.
W oddychaniu azotanowym występuje krótszy niż w oddychaniu tlenowym łańcuch oddechowy - zysk energetyczny jest mniejszy
Jednym ze sposobów tego oddychania jest denitryfikacja
Azotany przyjmują elektrony i są redukowane:
NO3- -1> NO2- -2> NO -3> N2O -4> N2
Zielonym kolorem są oznaczone produkty gazowe.
1 - reduktaza azotowa dysymilacyjna (znajduje się w błonie) -> hamowana przez obecność tlenu
2 - reduktaza azotynowa dysymilacyjna (w cytoplazmie) -> hamowana przez obecność…
3 - reduktaza tlenku azotu
4 - reduktaza podtlenku azotu
W glebie zachodzi denitryfikacja (zubożenie gleby w azotany) w warunkach złego napowietrzenia (ponieważ bakterie denitryfikujące przeprowadzają oddychanie azotanowe tylko w przypadku braku tlenu)
Wzrost stężenia N2O potęguje efekt szklarniowy.
Ponad to denitryfikacja powoduje zubożenie gleby w związki azotowe
Oddychanie azotanowe może tylko prowadzić do powstania azotynów, np. E. coli u której ostatecznym akceptorem jest azotan - E. coli nie posiada enzymów do dalszej redukcji związków azotowych.
Oddychanie siarczanowe - występuje u niektórych bezwzględnych beztlenowców. Ostatecznym akceptorem elektronów są siarczany a produktem jest H2S
Fermentacja (występuje u chemooragnotrofów) -> reakcja kataboliczna prowadząca do powstania ATP w wyniku fosforylacji substratowej.
Nie ma w niej łańcucha oddechowego
Związki nie ulegają całkowitemu spalaniu - powstaje produkt który ma jeszcze w sobie energię
Końcowym akceptorem elektronów jest endogenny związek organiczny
Jest znacznie mniej wydajna energetycznie od oddychania tlenowego - dlatego procesy fermentacji są bardzo intensywne (każda komórka wymaga takiego samego zapotrzebowania na energię). Mały zysk ponieważ występuje niepełne spalanie związków
Fermentację przeprowadzają warunkowe tlenowce i beztlenowce
Produktami fermentacji są:
Kwasy, np. masłowy, mlekowy
Alkohole, np. etylowy, izopropanowy, butylowy
Ketony, np. aceton
Gazy, np. CO2,
Jeśli jedynym produktem fermentacji jest kwas mlekowy to mówimy o fermentacji homomlekowej.
Jeśli oprócz kwasu mlekowego powstają inne produkty to mówimy o fermentacji heteromlekowej
Większość procesów rozkładu cukrów przebiega do pirogronianu - w wyniku redukcji pirogronianu podczas fermentacji często powstaje kwas mlekowy
Metody hodowania beztlenowców:
Całkowite usunięcie O2 i zastąpienie go mieszaniną gazów obojętnych (Ar, N2, He). Stworzenie takich warunków jest możliwe w anaerostacie - urządzeniu służącym do hodowania beztlenowców. Tylko w anaerostacie możemy używać metod umożliwiających ilościowe badanie beztlenowców (żeby na płytkach wyrosły kolonie)
Niecałkowite usunięcie tlenu - hodowanie warunkowych beztlenowców:
Stosowanie wysokiego słupa płynnego podłoża - dyfuzja tlenu na sam dół słupa jest słaba
Usunięcie tlenu rozpuszczonego w podłożu przez zagotowanie przed wysianiem - wraz ze wzrostem temperatury maleje rozpuszczalność tlenu w cieczach
Dodanie do płynnej pożywki agaru tak by powstał 0,1-0,2% roztwór - zwiększenie lepkości pożywki co skutkuje mniejszym mieszaniem pożywki i tym samym mniejszym rozpuszczaniem tlenu w pożywce
Dodanie substancji zredukowanych, które obniżają potencjał oksyredukcyjny, np. glukozy, cysteiny
Tuż po posiewie zalać słupek parafiną - odcinamy tym samym dostęp tlenu
Stosowanie gazpaków - zamknięty pojemnik z saszetka w której znajduje się substancji powodująca wytwarzanie wodoru - wraz ze wzrostem stężenia wodoru spada stężenie tlenu
W czasie metabolizmu tlenu powstają reaktywne formy tlenu, które są szkodliwe dla komórek:
O2-• rodnik ponadtlenkowy
H2O2 nadtlenek wodoru
Enzymy inaktywujące toksyczne pochodne tlenu:
Dysmutaza ponadtlenkowa:
2 O2-• + 2H+ -> O2 + H2O2
Katalaza:
2H2O2 -> O2 + H2O
Peroksydaza:
H2O2 + NADH + H+ -> 2H2O + NAD
Bakterie bezwzględnie beztlenowe (np. Clostridium) nie mają lub mają niski poziom aktywności katalazy oraz peroksydazy - dlatego są wrażliwe na tlen
Mikroaerofile nie mają niektórych mechanizmów obronnych przez toksycznymi metabolitami metabolizmu tlenowego - stąd ich gorszy wzrost w warunkach tlenowych (lepiej rosną w obniżonym ciśnieniu tlenu)
1. Określenie stosunku bakterii do tlenu:
Przygotowujemy 2 warianty bulionu odżywczego:
Bulion odżywczy w postaci niskiego słupa podłoża - dobre warunki tlenowe
Bulion odżywczy w postaci wysokiego słupa podłoża, które było wcześniej zagotowane, dodano do niego 0,5% glukozy (związek zredukowany), a po wysianiu zalano od góry parafiną - złe warunki tlenowe
Obserwujemy intensywność wzrostu poszczególnych szczepów w obu typach podłoża:
Intensywność wzrostu |
dobre natlenienie |
Złe natlenienie |
Stosunek do tlenu |
Obecność katalazy |
Micrococcus luteus |
++ |
++ |
Tlenowiec względny |
+ |
Pseudomonas fluorescens |
++ |
- |
Tlenowiec bezwzględny |
+ |
Escherichia coli |
++ |
++ |
Tlenowiec względny |
+ |
Serratia marcescens |
++ |
++ |
Tlenowiec względny |
+ |
Bacillus subtilis |
++ |
- |
Tlenowiec bezwzględny |
+ |
Paracoccus versutus |
++ |
++ |
Tlenowiec względny |
+ |
Pseudomonas stutzeri |
++ |
- |
Tlenowiec bezwzględny |
+ |
Enterococcus faecalis |
+- |
++ |
Mikroaerofil |
- |
++ - dobry wzrost
+- - słaby wzrost
- - brak wzrostu
Pseudomonas stutzeri - jest denitryfikatorem więc może oddychać beztlenowo. W teście wyszło inaczej ponieważ do oddychania azotanowego potrzebuje on NO3- których nie ma w podłożu
Serratia marcescens - w niskiej temperaturze oraz w warunkach tlenowych wytwarza czerwony barwnik - hodowla ma różowy kolor.
W warunkach beztlenowych gatunek ten ma biały wzrost.
Serratia marcescens wykorzystywana jest jako biologiczny test na obecność tlenu.
W jaki sposób Escherichia coli oddycha na wysokim słupie?
Na pewno nie przeprowadza ona fermentacji ponieważ w bulionie odżywczym nie ma ani laktozy ani glukozy.
Wykorzystuje ona fumaran jako zewnętrzny akceptor elektronów. Jest to oddychanie (ponieważ występuje łańcuch oddechowy), tak więc powstaje dużo więcej energii niż w przypadku fermentacji.
Pozostałe względne tlenowce również wykorzystują jakieś egzogenne akceptory elektronów.
24-godzinne hodowle szczepów bakterii na płytkach z agarem odżywczym zalać wodą utlenioną. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności katalazy - enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru na wodę i tlen.
Jedynie na agarze odżywczym z Enterococcus faecalis nie pojawiają się bąbelki - nie posiada on katalazy, ponieważ jest mikroaerofilem
Oddychanie bakterii w warunkach beztlenowych - oddychanie azotanowe i denitryfikacja:
Denitryfikacja - redukcja azotanów do wolnego azotu
Oddychanie azotanowe - niepełna denitryfikacja, czyli niepełna redukcja azotanów.
Jako podłoże stosujemy bulion odżywczy z dodatkiem KNO3 (źródło azotanów) w postaci wysokiego słupa (warunki beztlenowe). W probówce z podłożem umieszczamy rurkę Durham'a - jest to maleńka probówka służąca do zbierania gazów. Obecność gazów w probówce będzie świadczyła o przeprowadzaniu denitryfikacji przez bakterie.
Dodatkowo przeprowadzamy reakcję barwną na obecność azotynów (czy zachodzi oddychanie azotanowe= czy bakterie mają reduktazę azotową dysymilacyjną) - na skutek reakcji NO2- z α-naftyloaminą powstaje czerwone zabarwienie.
|
Wzrost |
Obecność NO2- |
Obecność gazu |
Escherichia coli |
+ |
+ |
- |
Pseudomonas stutzeri |
+ |
- |
+ |
Serratia marcescens |
+ |
+ |
- |
Paracoccus versutus |
+ |
- |
- |
Pseudomonas fluorescens |
+ |
- |
- |
Micrococcus luteus |
+ |
- |
- |
Wnioski:
Hodowle które po dodaniu α-naftyloaminy zmieniają barwę na czerwoną zawierają azotyny - przeprowadzają oddychanie azotanowe
Bakterie w hodowlach w których w rurce Durhama jest gaz (N2) są denitryfikatorami
Fermentacja i peptonizacja mleka - badamy czy bakterie przeprowadzają fermentację mleka (badanie zdolności proteolitycznych)
Bakterie wsiewamy do odtłuszczonego mleka z lakmusem - lakmus nadaje podłożu fioletowe zabarwienie.
Jeśli w hodowli danego szczepu zachodzi fermentacja (laktoza jest rozkładana) to powstaje zakwaszenie, które zmienia barwę lakmusu z fioletowej na różową
Dodatkowo możemy określić typ fermentacji mlekowej:
Jeśli powstaje jedna „bryła” skrzepu mleka to mamy do czynienia z fermentacją homomlekową
Jeśli natomiast skrzep mleka jest porozrywany (przez wydzielający się gaz) - fermentacja heteromlekowa
Enterococcus faecalis
Mleko jest ścięte w gładki (nieporozrywany) skrzep - homofermentacja mlekowa -> jedyny produktem fermentacji jest kwas mlekowy
Lakmus na górze słupa zmienia barwę na różową - powstaje zakwaszenie przez co wytrąca się kazeina (przy pH<4,6) - - powstaje skrzep kwaśny. Powstaje tylko kwas mlekowy - skrzep gładki. Od fosfokazeinianu wapnia odszczepia się wapń, powstaje mleczan wapnia-następuje obniżenie stężenia wapnia w białku, wytrąca się wolna kazeina
Od dna probówki lakmus jest odbarwiony - lakmus jest wykorzystywany jako egzogenny akceptor elektronów
Innym egzogennym akceptorem elektronów jest pirogronian - ponieważ kwas mlekowy jest jedynym produktem
Escherichia coli
Lakmus zmienia kolor na różowy w wyniku zakwaszenie - powstaje skrzep kwaśny
W skrzepie widać pęcherzyki gazu (skrzep poszarpany) - Escherichia coli przeprowadza fermentacje kwasów mieszanych - w wyniku fermentacji laktozy powstaje szereg kwasów. Jako akceptory elektronów wykorzystywane są różne związki -> powstaje dużo CO2 oraz… w wyniku czego skrzep jest poszarpany
Bacillus subtilis
Nie ma zmiany barwy na różową -> brak zakwaszenia
Alkalizacja - na skutek dezaminacji
Powstaje gąbczasty skrzep (skrzep słodki) - tworzy się w wyniku działania enzymów proteolitycznych
Na górze mleko jest przejrzyste - na skutek hydrolizy kazeiny
Bacillus subtilis nie fermentuje laktozy
Test redukcji błękitu metylenowego jako demonstracja intensywności procesu oddechowego
Do przygotowanych 5 probówek, wlać równe oobjętośco odpowiednich rozcienczeń młodej hodowli bulionowej E. Coli wg schematu a następnie dodać błękitu metylenowego
Nr probówki |
Bulion (ml) |
Hodowla (ml) |
1 |
9 |
1 |
2 |
7 |
3 |
3 |
5 |
5 |
4 |
- |
10 |
5 (kontrola) |
10 |
- |
Błękit metylenowy jest redukowany jedynie w przypadku braku tlenu. Dlatego w hodowli staraliśmy się utworzyć warunki beztlenowe stosując wysoki słup podłoża, by zaobserwować intensywność procesu oddychania w zależności od stężenia/zagęszczenia hodowli.
Wnioski:
W próbie kontrolnej wogóle nie następuje odbarwienie błękitu metylenowego - nie ma tam procesów oddechowych (bo nie ma tam bakterii)
Im jest większe stężenie bakterii w pożywce tym szybciej następuje odbarwienie roztworu -? Procesy oddechowe są intensywniejsze
Odbarwienie następuje od dna probówki, ponieważ panują tam warunki beztlenowe
Po odbarwieniu większości roztworu na szczycie hodowli pozostaje niebieski pierścień - w tym rejonie hodowla cały czas styka się z powietrzem: na skutek dyfuzji cały czas panują tam warunki tlenowe, więc błękit metylenowy nie jest wykorzystywany do redukcji