mikro ćw 7, Ćw


Ćw. 7 Metabolizm bakterii - procesy oddechowe

Oddychanie -> reakcja kataboliczna prowadząca do powstania ATP w wyniku fosforylacji oksydacyjnej z wykorzystaniem łańcucha transportu elektronów oraz egzogennego ostatecznego akceptora elektornów (organicznego lub nieorganicznego)

Ostateczne akceptory elektronów:

Egzogenne akceptory elektronów wykorzystywane są w fosforylacji oksydacyjnej (czyli podczas oddychania)

Endogenne akceptory elektronów wykorzystywane są w fosforylacji substratowej, czyli np. podczas fermentacji

Mechanizmy tworzenia ATP u chemoorganoheterotrofów:

Aby fosforylacja oksydacyjna mogła zajść potrzeba:

Fosforylacja substratowa zachodzi bez udziału łańcucha oddechowego -> dużo mniejszy zysk energetyczny niż w przypadku fosforylacji oksydacyjnej.

Podział bakterii ze względu na wymagania tlenowe:

Oddychanie azotanowe - oddychanie w którym azotany są wykorzystywane jako końcowe akceptory elektronów. Bakterie wykorzystujące ten typ oddychania są względnymi tlenowcami - w środowisku z dostępem tlenu wykorzystują go jako akceptor elektronów, dopiero gdy nie ma tlenu wykorzystują azotany.

W oddychaniu azotanowym występuje krótszy niż w oddychaniu tlenowym łańcuch oddechowy - zysk energetyczny jest mniejszy

Jednym ze sposobów tego oddychania jest denitryfikacja

Azotany przyjmują elektrony i są redukowane:

NO3- -1> NO2- -2> NO -3> N2O -4> N2

Zielonym kolorem są oznaczone produkty gazowe.

1 - reduktaza azotowa dysymilacyjna (znajduje się w błonie) -> hamowana przez obecność tlenu

2 - reduktaza azotynowa dysymilacyjna (w cytoplazmie) -> hamowana przez obecność…

3 - reduktaza tlenku azotu

4 - reduktaza podtlenku azotu

W glebie zachodzi denitryfikacja (zubożenie gleby w azotany) w warunkach złego napowietrzenia (ponieważ bakterie denitryfikujące przeprowadzają oddychanie azotanowe tylko w przypadku braku tlenu)

Wzrost stężenia N2O potęguje efekt szklarniowy.

Ponad to denitryfikacja powoduje zubożenie gleby w związki azotowe

Oddychanie azotanowe może tylko prowadzić do powstania azotynów, np. E. coli u której ostatecznym akceptorem jest azotan - E. coli nie posiada enzymów do dalszej redukcji związków azotowych.

Oddychanie siarczanowe - występuje u niektórych bezwzględnych beztlenowców. Ostatecznym akceptorem elektronów są siarczany a produktem jest H2S

Fermentacja (występuje u chemooragnotrofów) -> reakcja kataboliczna prowadząca do powstania ATP w wyniku fosforylacji substratowej.

Jeśli jedynym produktem fermentacji jest kwas mlekowy to mówimy o fermentacji homomlekowej.

Jeśli oprócz kwasu mlekowego powstają inne produkty to mówimy o fermentacji heteromlekowej

Większość procesów rozkładu cukrów przebiega do pirogronianu - w wyniku redukcji pirogronianu podczas fermentacji często powstaje kwas mlekowy

Metody hodowania beztlenowców:

  1. Całkowite usunięcie O2 i zastąpienie go mieszaniną gazów obojętnych (Ar, N2, He). Stworzenie takich warunków jest możliwe w anaerostacie - urządzeniu służącym do hodowania beztlenowców. Tylko w anaerostacie możemy używać metod umożliwiających ilościowe badanie beztlenowców (żeby na płytkach wyrosły kolonie)

  2. Niecałkowite usunięcie tlenu - hodowanie warunkowych beztlenowców:

W czasie metabolizmu tlenu powstają reaktywne formy tlenu, które są szkodliwe dla komórek:

Enzymy inaktywujące toksyczne pochodne tlenu:

2 O2-• + 2H+ -> O2 + H2O2

2H2O2 -> O2 + H2O

H2O2 + NADH + H+ -> 2H2O + NAD

Bakterie bezwzględnie beztlenowe (np. Clostridium) nie mają lub mają niski poziom aktywności katalazy oraz peroksydazy - dlatego są wrażliwe na tlen

Mikroaerofile nie mają niektórych mechanizmów obronnych przez toksycznymi metabolitami metabolizmu tlenowego - stąd ich gorszy wzrost w warunkach tlenowych (lepiej rosną w obniżonym ciśnieniu tlenu)

1. Określenie stosunku bakterii do tlenu:

Przygotowujemy 2 warianty bulionu odżywczego:

Obserwujemy intensywność wzrostu poszczególnych szczepów w obu typach podłoża:

Intensywność wzrostu

dobre natlenienie

Złe natlenienie

Stosunek do tlenu

Obecność katalazy

Micrococcus luteus

++

++

Tlenowiec względny

+

Pseudomonas fluorescens

++

-

Tlenowiec bezwzględny

+

Escherichia coli

++

++

Tlenowiec względny

+

Serratia marcescens

++

++

Tlenowiec względny

+

Bacillus subtilis

++

-

Tlenowiec bezwzględny

+

Paracoccus versutus

++

++

Tlenowiec względny

+

Pseudomonas stutzeri

++

-

Tlenowiec bezwzględny

+

Enterococcus faecalis

+-

++

Mikroaerofil

-

++ - dobry wzrost

+- - słaby wzrost

- - brak wzrostu

Pseudomonas stutzeri - jest denitryfikatorem więc może oddychać beztlenowo. W teście wyszło inaczej ponieważ do oddychania azotanowego potrzebuje on NO3- których nie ma w podłożu

Serratia marcescens - w niskiej temperaturze oraz w warunkach tlenowych wytwarza czerwony barwnik - hodowla ma różowy kolor.

W warunkach beztlenowych gatunek ten ma biały wzrost.

Serratia marcescens wykorzystywana jest jako biologiczny test na obecność tlenu.

W jaki sposób Escherichia coli oddycha na wysokim słupie?

Na pewno nie przeprowadza ona fermentacji ponieważ w bulionie odżywczym nie ma ani laktozy ani glukozy.

Wykorzystuje ona fumaran jako zewnętrzny akceptor elektronów. Jest to oddychanie (ponieważ występuje łańcuch oddechowy), tak więc powstaje dużo więcej energii niż w przypadku fermentacji.

Pozostałe względne tlenowce również wykorzystują jakieś egzogenne akceptory elektronów.

  1. 24-godzinne hodowle szczepów bakterii na płytkach z agarem odżywczym zalać wodą utlenioną. Wydzielanie się pęcherzyków gazu świadczy o obecności katalazy - enzymu rozkładającego nadtlenek wodoru na wodę i tlen.

Jedynie na agarze odżywczym z Enterococcus faecalis nie pojawiają się bąbelki - nie posiada on katalazy, ponieważ jest mikroaerofilem

  1. Oddychanie bakterii w warunkach beztlenowych - oddychanie azotanowe i denitryfikacja:

Denitryfikacja - redukcja azotanów do wolnego azotu

Oddychanie azotanowe - niepełna denitryfikacja, czyli niepełna redukcja azotanów.

Jako podłoże stosujemy bulion odżywczy z dodatkiem KNO3 (źródło azotanów) w postaci wysokiego słupa (warunki beztlenowe). W probówce z podłożem umieszczamy rurkę Durham'a - jest to maleńka probówka służąca do zbierania gazów. Obecność gazów w probówce będzie świadczyła o przeprowadzaniu denitryfikacji przez bakterie.

Dodatkowo przeprowadzamy reakcję barwną na obecność azotynów (czy zachodzi oddychanie azotanowe= czy bakterie mają reduktazę azotową dysymilacyjną) - na skutek reakcji NO2- z α-naftyloaminą powstaje czerwone zabarwienie.

Wzrost

Obecność NO2-

Obecność gazu

Escherichia coli

+

+

-

Pseudomonas stutzeri

+

-

+

Serratia marcescens

+

+

-

Paracoccus versutus

+

-

-

Pseudomonas fluorescens

+

-

-

Micrococcus luteus

+

-

-

Wnioski:

      1. Hodowle które po dodaniu α-naftyloaminy zmieniają barwę na czerwoną zawierają azotyny - przeprowadzają oddychanie azotanowe

      2. Bakterie w hodowlach w których w rurce Durhama jest gaz (N2) są denitryfikatorami

  1. Fermentacja i peptonizacja mleka - badamy czy bakterie przeprowadzają fermentację mleka (badanie zdolności proteolitycznych)

Bakterie wsiewamy do odtłuszczonego mleka z lakmusem - lakmus nadaje podłożu fioletowe zabarwienie.

Jeśli w hodowli danego szczepu zachodzi fermentacja (laktoza jest rozkładana) to powstaje zakwaszenie, które zmienia barwę lakmusu z fioletowej na różową

Dodatkowo możemy określić typ fermentacji mlekowej:

Enterococcus faecalis

        1. Mleko jest ścięte w gładki (nieporozrywany) skrzep - homofermentacja mlekowa -> jedyny produktem fermentacji jest kwas mlekowy

        2. Lakmus na górze słupa zmienia barwę na różową - powstaje zakwaszenie przez co wytrąca się kazeina (przy pH<4,6) - - powstaje skrzep kwaśny. Powstaje tylko kwas mlekowy - skrzep gładki. Od fosfokazeinianu wapnia odszczepia się wapń, powstaje mleczan wapnia-następuje obniżenie stężenia wapnia w białku, wytrąca się wolna kazeina

        3. Od dna probówki lakmus jest odbarwiony - lakmus jest wykorzystywany jako egzogenny akceptor elektronów

        4. Innym egzogennym akceptorem elektronów jest pirogronian - ponieważ kwas mlekowy jest jedynym produktem

Escherichia coli

Bacillus subtilis

  1. Test redukcji błękitu metylenowego jako demonstracja intensywności procesu oddechowego

Do przygotowanych 5 probówek, wlać równe oobjętośco odpowiednich rozcienczeń młodej hodowli bulionowej E. Coli wg schematu a następnie dodać błękitu metylenowego

Nr probówki

Bulion (ml)

Hodowla (ml)

1

9

1

2

7

3

3

5

5

4

-

10

5 (kontrola)

10

-

Błękit metylenowy jest redukowany jedynie w przypadku braku tlenu. Dlatego w hodowli staraliśmy się utworzyć warunki beztlenowe stosując wysoki słup podłoża, by zaobserwować intensywność procesu oddychania w zależności od stężenia/zagęszczenia hodowli.

Wnioski:

  1. W próbie kontrolnej wogóle nie następuje odbarwienie błękitu metylenowego - nie ma tam procesów oddechowych (bo nie ma tam bakterii)

  2. Im jest większe stężenie bakterii w pożywce tym szybciej następuje odbarwienie roztworu -? Procesy oddechowe są intensywniejsze

  3. Odbarwienie następuje od dna probówki, ponieważ panują tam warunki beztlenowe

  4. Po odbarwieniu większości roztworu na szczycie hodowli pozostaje niebieski pierścień - w tym rejonie hodowla cały czas styka się z powietrzem: na skutek dyfuzji cały czas panują tam warunki tlenowe, więc błękit metylenowy nie jest wykorzystywany do redukcji



Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Mikro cw 6
mikro cw 3 id 300788 Nieznany
mikro ćw 6, Ćwiczenie 6: Metabolizm bakterii - odżywianie
06 MIKRO ćw TZK
mikro - cw 5- notatki, LEKARSKO-DENTYSTYCZNY GUMED, II ROK, MIKROBIOLOGIA I MJU
06 MIKRO ćw TZK(1)
mikro cw, Finanse i rachunkowość (UMCS), ROK I, Mikroekonomia
Mikro cw 6
mikro cw 3 id 300788 Nieznany
06 MIKRO ćw TZK(1)
06 MIKRO ćw TZK

więcej podobnych podstron