1

ĆWICZENIE 56

Temat: Spektrofotometryczna analiza ludzkiej

hemoglobiny.

Hemoglobina jest białkiem złożonym z grupy prostetycznej zwanej hemem,
złączonej z atomem dwuwartościowego żelaza i białka prostego - globiny. Na

cząsteczkę hemoglobiny przypadają cztery
hemy (każda z nich może przyłączyć
cząsteczkę tlenu) i cztery globiny
(składającej się z czterech łańcuchów:
dwóch alfa i dwóch beta). W kapilarach płuc
hemoglobina po połączeniu się z tlenem
przybiera postać oksyhemoglobiny (HbO

2

)

(krew

utlenowana,

tętnicza),

która

następnie krążąc po całym organizmie
roznosi tlen do wszystkich tkanek. Tam
następuje odłączenie tlenu i przyłączenie
dwutlenku węgla (krew odtlenowana Hb) i
w końcu zostaje przetransportowany do
płuc, a jego miejsce zajmuje tlen.
Hemoglobina ma zdolność wiązania tlenu w
sposób odwracalny, zależny od ciśnienia

parcjalnego tego gazu. W warunkach prawidłowych l g hemoglobiny może związać
1,34 cm

3

tlenu. Proces wiązania tlenu przez hemoglobinę nazywa się utlenowaniem,

ponieważ nie towarzyszy mu zmiana stopnia utlenienia żelaza hemowego.
Wiązaniu tlenu przez hemoglobinę towarzyszy zmiana kształtu cząsteczki
polegająca na przemieszczeniu poszczególnych podjednostek względem siebie.

Spektroskopia optyczna obejmuje metody badania materii przy użyciu

promieniowania elektromagnetycznego, które może być w danym układzie
wytwarzane lub może z układem oddziaływać. Zajmuje się ona interpretacją widm.

W jednym ze sposobów pomiarów spektroskopowych, padające promieniowanie
elektromagnetyczne może oddziaływać ze składnikami układu (związki chemiczne,
jony, ugrupowania atomów, atomy i inne). Jako wynik tych oddziaływań może być
obserwowana:
a) absorpcja promieniowania elektromagnetycznego,
b) odbicie,
c) refrakcja,
d) polaryzacja,
e) rozproszenie lub wtórna emisja (luminescencja, fosforescencja czy

fluorescencja) zjawisko Ramana.

2

Zjawisko

absorpcji

stanowi

podstawę

spektrofotometrii absorpcyjnej w nadfiolecie i
zakresie

widzialnym.

Podstawowe

prawo

spektrofotometrii absorpcyjnej to prawo Lamberta-
Beera, które wyraża się następująco:

jeśli

to

gdzie:
A - absorbancja

I

0

–natężenie światła padającego na

ciało

I

1

- natężenie światła po przejściu

przez ciało

l - droga jaką pokonuje światło w

ciele.

c - stężenie molowe substancji

absorbującej w roztworze

α - molowy współczynnik absorpcji

zwany poprawnie absorbancją
molową

λ - długość fali pochłanianego światła

k - molowy współczynnik ekstyncji

Prawo mówi o tym, że absorbancja światła monochromatycznego jest zależna do
stężenia roztworu, do grubości

warstwy absorpcyjnej i od długości fali

pochłanianego światła.

Spektrofotometr jest urządzeniem pomiarowym, umożliwiającym pomiar
transmitancji i/lub absorbancji ciał stałych, ciekłych i gazowych w funkcji
długości fali lub liczb falowych. Ogólny schemat blokowy spektrofotometru
przedstawia rysunek poniżej

.

Schemat blokowy spektrofotometru.

3

Widma hemoglobiny

Hemoglobina występująca w formie utlenowanej jako oksyhemoglobina, badana

na spektrofotometrze wykazuje dwa maksima absorpcji w żółtej i zielonej części
widma (578nm i 540nm). Hemoglobina odtlenowana ma barwę czerwonofioletową i
jej widmo posiada jedno maksimum absorpcji przy długości fali równej 565nm.
Methemoglobina ma barwę brunatną i w widmie można obserwować cztery
maksima absorpcji dla fal o długości 631nm, 576nm, 540nm i 500nm.

Część doświadczalna

I Uruchomienie spektrofotometru.

a) Włączyć spektrofotometr (przełącznik na tylnym panelu) oraz drukarkę.
b) Odczekać 1min, aż instrument wykona autotest. Wynik testu wydrukuje

drukarka.

II Wykonanie linii bazowej.

UWAGA !!! Należy pamiętać by nie dotykać powierzchni czynnych kuwety

(powierzchnie gładkie).

a) nalać do kuwety pomiarowej wodę destylowaną (ok. 1ml)
b) umieścić kuwetę w uchwycie wewnątrz spektrofotometru tak, by przez część

przezroczystą kuwety przechodziło światło i zamknąć pokrywę pomieszczenia
pomiarowego

c) nacisnąć przycisk „SCAN”
d) z widocznego menu na wyświetlaczu, wybrać „Baseline Menu”
e) zatwierdzić przyciskiem „E” (Enter)
f) z następnego menu wybrać „Store Baseline”
g) zatwierdzić „E” (Enter)
h) wpisać i zatwierdzić parametry linii bazowej

Enter Start WL [nm]: 450
Enter End WL [nm]:

700

Enter Speed [nm/min]: 600

i) po wybraniu parametrów nacisnąć przycisk “RUN / PRINT” Odczekać, aż

instrument dokona kalibracji linii bazowej

W momencie błędnego wpisywania parametrów, można anulować aktualnie
wpisywaną wartość naciskając przycisk „C” (Cancel). W przypadku zauważenia
pomyłki po zatwierdzeniu wielkości, linię bazową należy wykonać od początku
wracając do głównego menu przez naciśnięcie przycisku „SCAN”.

4

UWAGA !!! Przed wykonaniem dalszej części ćwiczenia należy koniecznie

założyć gumowe rękawiczki.

III Obserwacja widm pochodnych hemoglobiny.

1) Powstanie hemoglobiny oraz jej przejście w kontakcie z tlenem

atmosferycznym w oksyhemoglobinę. W wyniku kontaktu hemoglobiny z
powietrzem atmosferycznym uzyskuje się jej pochodną – oksyhemoglobinę.

a) w probówce znajduje się 80x rozcieńczony preparat oksyhemoglobin
b) przenieść do kuwety (za pomocą pipetki plastikowej lub pipety automatycznej)

preparat oksyhemoglobiny (ok. 1ml)

c) nacisnąć kilkakrotnie klawisz „SCAN” do momentu pojawienia się menu
d) wybrać

„WL Scan Menu”,
„E” (Enter), a następnie
„Scan”,
„E” (Enter).

e) ustawić parametry pomiaru:

Enter Start WL [nm]:

450 “E”

Enter End WL [nm]:

700 “E”

Enter Speed [nm/min]: 600 “E“
Enter Scale [nm/cm]:

25

“E“

Enter min Abs:

0.00 “E“

Enter max Abs:

2.00 “E“

f) wcisnąć przycisk „RUN / PRINT“. W celu obejrzenia całego wykresu na

wyświetlaczu użyj przycisków strzałek:

Lewo

←

,

Prawo →.

g) wydrukować wynik używając przycisku „RUN / PRINT”. Przejście do

następnego pomiaru bez drukowania następuje przez naciśnięcie przycisku
„NEXT”

h) wyniki zapisać w tabeli 1 (długości fali i absorbancja dla oksyhemoglobiny)

UWAGA !!! Należy zachować szczególną ostrożność w czasie pracy z tym

odczynnikiem chemicznym.

i) wyjąć kuwetę ze spektrofotometru
j) korzystając z dozownika dodać do kuwety, zawierającej preparat

oksyhemoglobiny, szczyptę ditioninu sodu (szczyptę określa asystent)

k) wymieszać pipetką plastikową
l) wykonać widmo (patrz punkt c) i wydrukować wynik ( w 2 powtórzeniach)
m) wartość charakterystycznej długości fali i maksymalnej absorbancji dla

hemoglobiny zapisać w tabeli nr 1

5

n) wyjąć kuwetę i przez 1 min mieszać próbkę plastikową pipetą nabierając cały

płyn i wypuszczając go powoli kroplami

o) wykonać następny pomiar widma
p) powtarzać punkt l i m do momentu, aż otrzymane widmo będzie przypominało

widmo oksyhemoglobiny

q) wyniki zapisać w tabeli nr 1

UWAGA !!! Należy pamiętać o dokładnym przepłukaniu kuwety przed

przystąpieniem do pomiaru widma methemoglobiny.

2)

Methemoglobina

a) umieścić w kuwecie 1ml 80 x rozcieńczonego preparatu oksyhemoglobiny
b) podać do kuwety 15-20µl 0,16% żelazicjanku potasu, wymieszać pipetką

plastikową

c) wykonać pomiar widma i wydruk wyników
d) wyniki zapisać w tabeli nr 1

Tabela 1.

λ

A

SCAN( nr)

oksyhemoglobina

1

2

hemoglobina

1

oksyhemoglobina

1

2

methemoglobina

1

2

3

4

Sprawozdanie powinno zawierać:
1. Załączone i opisane wykresy widm absorbcji uzyskane dla hemoglobiny i

wszystkich jej pochodnych.

2. Tabele pomiarowe.
3. Wnioski.
Literatura:
1. Kłyszejko –Stefanowicz L.

Ćwiczenia z biochemii PWN Warszawa-Poznań

1980r.

2. Nowicka-Janowska T.

Spektofotometria UV/VIS w analizie chemicznej PWN

Warszawa 1988r.