Ćwiczenie 13 - praktyka

Część praktyczna:

1. Wykonać preparaty mikroskopowe z następujących materiałów:

- próbki świeżego i zsiadłego mleka,

- zalewy z ogórków,

- soku z kiszonej kapusty,

- żurku,

- kefiru,

- jogurtu.

Technika sporządzania preparatów z mleka:

Próbki mleka przelać do probówek (po około 5 cm

3

) i ogrzewać w łaźni wodnej o

temp. 45–50ºC do momentu oddzielenia się skrzepu od serwatki. Wykonać rozmaz z

serwatki. Preparat suszyć na powietrzu (nie ogrzewać nad płomieniem!). Utrwalić w metanolu

przez 3 minuty, odtłuścić kilkanaście sekund w eterze, spłukać wodą destylowaną przez

zanurzenie preparatu w zlewce z dużą ilością wody. Wysuszyć na powietrzu. Barwić fuksyną

do Grama około 2 minuty. Fuksynę spłukać delikatnie wodą w sposób podany wyżej.

Pozostałe preparaty:

Przygotować w sposób standardowy i barwić metodą Grama.

2. Analiza preparatów mikroskopowych

a) obserwacja mikroflory próbki świeżego i kwaśnego mleka

b) obserwacja mikroflory jogurtu i kefiru

c) ocena kiszonek

Na podstawie obrazu mikroskopowego oraz pomiaru pH ocenić jakość kiszonek, biorąc pod

uwagę następujące kryteria:

Stosunek drożdży do bakterii

kiszonka bardzo dobra

od 1:80 do 1:200; pH 3,5

kiszonka dobra

od 1:3 do 1:30; pH 4,5

Przy większej ilości drożdży i wyższym pH kiszonka złej jakości.

3. Wykonanie próby reduktazowej

a) 10 cm

3

dokładnie wymieszanego mleka przenieść do sterylnej probówki i jałowo

dodać 0,5 cm

3

błękitu metylenowego, zamienić korek z waty na jałowy korek z

tworzywa sztucznego lub zakleić parafilmem,

b) Dokładnie wymieszać zawartość probówki, obracając ją kilkakrotnie do góry

dnem,

c) Probówkę wstawić do łaźni wodnej o temp. 35–37ºC,
d) Jednocześnie umieścić w łaźni probówkę z 1 cm

3

mleka i z termometrem w celu

stwierdzenia, kiedy zawartość probówki osiągnie temp. 37ºC,

e) Od tego momentu liczyć czas inkubacji mleka w łaźni. Obserwacje prowadzić na

początku, co 10 min., a później co 30 min. Co 30 min należy probówkę odwrócić
do góry dnem i z powrotem co zapobiega powstawaniu warstwy tłuszczu
unieruchamiającej drobnoustroje,

f) Oznaczenie uznać za zakończone, gdy mleko w probówce (0,5-1 cm górnej

warstwy) zostanie odbarwione,

g) Zależność między czasem odbarwienia, a zawartością drobnoustrojów

przedstawia tabela:

Czas odbarwiania błękitu

metylenowego

Liczba bakterii w 1 cm

3

(mln)

Jakość mleka

< 20 min.

> 20

Bardzo zła

20 min. – 2 godz.

20 – 4

Zła

2,0 – 5,5 godz.

4 – 0,5

Średnia

5,5 – 7,0 godz.

0,5 – 0,1

Dobra

> 7,0 godz.

< 0,1

Bardzo dobra

Próba reduktazowa jest oparta na oznaczeniu momentu wyczerpania tlenu rozpuszczonego w

mleku przez bakterie. Czas, w jakim tlen zostaje zużyty zależy od ilości, rodzaju i aktywności

drobnoustrojów. Po zużyciu tlenu rolę akceptora wodoru pełni dodany barwnik (błękit

metylenowy), który w wyniku zmiany potencjału oksydoredukcyjnego przechodzi z formy

barwnej w bezbarwną. Do bakterii zużywających tlen należą przede wszystkim bakterie

mlekowe i pałeczki z grupy coli.

4. Wykonanie posiewów mikrobiologicznych pozwalających odróżnić paciorkowce

mleczne od enterokoków

W tym celu wysiać metodą powierzchniową badane próbki mleka w ilości 0,5 cm

3

na

płytki Petriego z podłożem:

a) bulion o pH 9,6

b) bulion z dodatkiem 6,5% NaCl

Podłoża inkubować w temp. 28ºC.