Ćwiczenie nr 1 

Wykrywanie cukrowców oraz kwasów nukleinowych (DNA) 

w ekstrakcie drożdżowym 

 

Kwasy rybonukleinowe i dezoksyrybonukleinowe można wykrywać i odróżniać na podstawie 

analizy składnika cukrowego, zasady azotowej oraz reszty fosforanowej.  

Celem  ćwiczenia  jest  poznanie  reakcji  barwnych  umożliwiających  wykrywanie  składników 

cukrowych oraz DNA. Wykazanie obecności tych składników następuje po ich uwolnieniu w wyniku 
częściowej lub całkowitej hydrolizy. Całkowite uwolnienie zasad, cukrów i kwasu ortofosforowego z 
DNA  i  RNA  następuje  pod  działaniem  kwasów  w  podwyższonej  temperaturze.  Przez  łagodną 
hydrolizę,  przeprowadzoną  zasadami  lub  enzymami,  uzyskuje  się  większe  fragmenty  kwasów 
nukleinowych - nukleotydy i nukleozydy.  
 

1.  Otrzymywanie kwasów nukleinowych z drożdży  

 

Drożdże  są  dogodnym  źródłem  kwasów  nukleinowych.  Kwasy  te  izoluje  się  w  środowisku 

alkalicznym  lub  obojętnym,  gdyż  przy  niższych  wartościach  pH  następuje  degradacja  DNA.  Do 
wytrącania  kwasów  nukleinowych  z  roztworów  stosuje  się  etanol,  a  delipidację  otrzymanego  osadu 
prowadzi się przy pomocy eteru.  

Wykonanie  doświadczenia:  Ze  względu  na  czasochłonność  wykonania  ekstraktu  kwasów 

nukleinowych każda sekcja otrzyma na zajęciach gotowy ekstrakt.  
 

2.  Hydroliza kwasów nukleinowych  

 

Całkowitą  hydrolizę  kwasów  nukleinowych  do  zasad  azotowych,  kwasu  fosforowego 

i pentozy prowadzi się przy pomocy kwasu siarkowego w podwyższonej temperaturze.  
 
Wykonanie doświadczenia  

Do  małej  ilości  kwasów  nukleinowych  dodać  5  ml  2n  H

2

SO

4

,  wstawić  do  wrzącej  łaźni 

wodnej na 10 minut. Hydrolizat zobojętnić ługiem sodowym wobec papierka wskaźnikowego.  
 

3.  Wykrywanie cukrowców  

 

W hydrolizacie kwasów nukleinowych można wykazać obecność pentoz przy pomocy reakcji 

Molischa na cukrowce i reakcji Biala na pentozy. Natomiast odróżnienie 2-dezoksyrybozy od rybozy 
może nastąpić za pomocą reakcji z dwufenyloaminą (reakcja Dischego). W środowisku kwaśnym 2-
dezoksyryboza z dwufenyloaminą tworzy produkt kondensacji o barwie niebieskiej, a ryboza w tych 
warunkach nie reaguje.  
 

3.1.  Odróżnianie cukrowców od innych związków organicznych (próba Molischa).  

 

Cukrowce  pod  wpływem  stężonego  kwasu  siarkowego  ulegają  odwodnieniu  przekształcając 

się w pochodne furfuralowe. Z pentoz powstaje furfural, natomiast z heksoz - hydroksymetylofurfural.  
Wytworzone  związki,  posiadające  grupę  aldehydową  połączone  z  heterocyklicznym  układem 
furanowym, reagują z fenolami tworząc barwne produkty. W przypadku reakcji Molischa wynikiem 
kondensacji z naftolem jest produkt o fioletowej barwie.  

Dodatni  wynik  z  odczynnikiem  Molischa  dają  również  w  większym  stężeniu  niektóre  inne 

związki organiczne (aldehydy, kwasy, aceton).  
 
Wykonanie doświadczenia  

Odmierzyć l ml próbki oraz dodać po 4 krople odczynnika Molischa, a następnie podwarstwić 

trzema mililitrami stężonego kwasu siarkowego (pipetą po ścianie skośnie ustawionej probówki). 

Na  granicy  warstw  w  obecności  cukrowca  winien  pojawić  się  fioletowy  pierścień;  często 

poniżej powstaje zielony krążek pochodzący od zanieczyszczeń α-naftolu.  
 

3.2.  Próba Biała na pentozy  

 

Reakcja Biala pozwala na odróżnienie pentoz od heksoz. Tworzący się z pentoz pod wpływem 

ogrzewania z kwasem solnym furfural reaguje z orcyną (metylowa pochodna dwufenolu - rezorcyny), 
tworząc kompleks o zielonym zabarwieniu.  

W  tych  samych  warunkach  dodatni  wynik  dają  również  dezoksypentozy,  ale  w  słabym 

stopniu.  Natomiast  heksozy  przekształcają  się  w  hydroksymetylofurfural  rozkładający  się  dalej. 
Związek ten tworzy z orcyną żółtobrązowy produkt.  

 

Wykonanie doświadczenia  

Do  probówki  odmierzyć  5  ml  odczynnika  Biala.  (Uwaga:  pobierać  pipetą  z  gruszką)  i 

ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Następnie do probówki wprowadzić l ml badanego 
roztworu. Ogrzewać przez kilka minut i zanotować wynik.  

 

3.3.  Wykrywanie DNA metodą dwufenyloaminową 

 

Powszechnie  stosowana  metoda  oznaczenia  dezoksypentozy  opiera  się  na  reakcji  z 

dwufenyloaminą. Reakcja ta polega na tworzeniu niebieskiego zabarwienia podczas ogrzewania DNA 
z dwufenyloaminą, kwasem octowym i siarkowym o temperaturze 100° przez kilka minut. Znacznie 
lepszą czułość reakcji otrzymuje się przez dodanie kwasu nadchlorowego oraz aldehydu octowego i 
rozwijanie  koloru  przez  17  godzin  w  30°C,  jednakże  ze  względów  czasowych  w  ćwiczeniu 
wykorzystany  jest  pierwszy  sposób  prowadzenia  reakcji.  W  reakcji  bierze  też  udział  wolna 
deoksyryboza.  

 

Wykonanie ćwiczenie  

Do probówki wprowadzić 1 ml badanej próbki oraz 4 ml odczynnika dwufenyloaminowego i 

ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Zanotować wynik.  
 

3.4.  Wykrywanie kwasu fosforowego 

 

Obecność  ortofosforanu  w  hydrolizacie  kwasów  nukleinowych  można  wykazać  stosując 

kwaśny  roztwór  molibdenianu  amonowego.  Tworzy  się  wówczas  kompleks  soli  amonowej  kwasu 
cztero-trójmolibdenianofosforowego o żółtej barwie. 

Dalsza reakcja wytworzonej soli z kwasem 1-amino-2-naftalo-4-sulfonowym, w wyniku której 

następuje  redukcja  molibdenu  związanego  w  soli  kompleksowej  do  niższych  tlenków  molibdenu 
(błękit molibdenowy), jest podstawą ilościowego oznaczenia fosforu w materiale biologicznym.  

 

Wykonanie ćwiczenia 
 

Do 0,5ml hydrolizatu dodać roztworu amoniaku aż do uzyskania alkalicznego odczynu. Ciecz 

zakwasić stężonym kwasem azotowym (V) i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzewać do wrzenia. 
Zanotować obserwacje. 
 

3.5.  Reakcja Feulgena na deoksyrybozę 

 

Reakcja  Feulgena  jest  charakterystyczna  dla  kwasu  deoksyrybonukleinowego;  DNA 

ogrzewa  się  z  kwasem  solnym,  a  po  dodaniu  roztworu  fuksyny  uzyskuje  się  barwę 
fioletowoczerwoną;  reakcja  Feulgena  uwarunkowana  jest  obecnością  deoksyrybozy;  stosuje 
się m.in. do wybarwiania preparatów histologicznych. 

 
 
 

Wykonanie ćwiczenia 
Do  1ml  ekstraktu  drożdżowego  dodać  5-6  kropli  1M  roztworu  HCl.  Probówkę umieścić  we  wrzącej 
łaźni wodnej na około 5 min. Po oziębieniu doprowadzić pH do 5 za pomocą 0,1 M roztworu NaOH. 
Następnie  dodać  2ml  odczynnika  Schiffa.  Powstaje  czerwone  zabarwienie,  które  wskazuje  na 
obecność deoksyrybozy. 
 
Sprawozdanie:  
Omówić wyniki uzyskanych obserwacji odpowiadając jednocześnie na pytania:  
Czy w badanej próbie występują cukrowce?  
Czy w badanej próbie występują DNA i/lub RNA?  
Jeżeli  podczas  wykonywania  ćwiczenia  natknięto  się  na  rozbieżności  w  stosunku  do  informacji 
zawartych w instrukcji (np. czas inkubacji w łaźni wodnej), należy przedstawić własne obserwacje.  
Na  podstawie  składu  chemicznego  DNA  i  RNA  wskazać  sposób  odróżnienia  tych  dwóch  kwasów 
nukleinowych (najlepiej wykonać tabelę porównawczą).