Ćwiczenie nr 1

Wykrywanie cukrowców oraz kwasów nukleinowych (DNA)

w ekstrakcie drożdżowym

Kwasy rybonukleinowe i dezoksyrybonukleinowe można wykrywać i odróżniać na podstawie

analizy składnika cukrowego, zasady azotowej oraz reszty fosforanowej.

Celem ćwiczenia jest poznanie reakcji barwnych umożliwiających wykrywanie składników

cukrowych oraz DNA. Wykazanie obecności tych składników następuje po ich uwolnieniu w wyniku
częściowej lub całkowitej hydrolizy. Całkowite uwolnienie zasad, cukrów i kwasu ortofosforowego z
DNA i RNA następuje pod działaniem kwasów w podwyższonej temperaturze. Przez łagodną
hydrolizę, przeprowadzoną zasadami lub enzymami, uzyskuje się większe fragmenty kwasów
nukleinowych - nukleotydy i nukleozydy.

1. Otrzymywanie kwasów nukleinowych z drożdży

Drożdże są dogodnym źródłem kwasów nukleinowych. Kwasy te izoluje się w środowisku

alkalicznym lub obojętnym, gdyż przy niższych wartościach pH następuje degradacja DNA. Do
wytrącania kwasów nukleinowych z roztworów stosuje się etanol, a delipidację otrzymanego osadu
prowadzi się przy pomocy eteru.

Wykonanie doświadczenia: Ze względu na czasochłonność wykonania ekstraktu kwasów

nukleinowych każda sekcja otrzyma na zajęciach gotowy ekstrakt.

2. Hydroliza kwasów nukleinowych

Całkowitą hydrolizę kwasów nukleinowych do zasad azotowych, kwasu fosforowego

i pentozy prowadzi się przy pomocy kwasu siarkowego w podwyższonej temperaturze.

Wykonanie doświadczenia

Do małej ilości kwasów nukleinowych dodać 5 ml 2n H

2

SO

4

, wstawić do wrzącej łaźni

wodnej na 10 minut. Hydrolizat zobojętnić ługiem sodowym wobec papierka wskaźnikowego.

3. Wykrywanie cukrowców

W hydrolizacie kwasów nukleinowych można wykazać obecność pentoz przy pomocy reakcji

Molischa na cukrowce i reakcji Biala na pentozy. Natomiast odróżnienie 2-dezoksyrybozy od rybozy
może nastąpić za pomocą reakcji z dwufenyloaminą (reakcja Dischego). W środowisku kwaśnym 2-
dezoksyryboza z dwufenyloaminą tworzy produkt kondensacji o barwie niebieskiej, a ryboza w tych
warunkach nie reaguje.

3.1. Odróżnianie cukrowców od innych związków organicznych (próba Molischa).

Cukrowce pod wpływem stężonego kwasu siarkowego ulegają odwodnieniu przekształcając

się w pochodne furfuralowe. Z pentoz powstaje furfural, natomiast z heksoz - hydroksymetylofurfural.
Wytworzone związki, posiadające grupę aldehydową połączone z heterocyklicznym układem
furanowym, reagują z fenolami tworząc barwne produkty. W przypadku reakcji Molischa wynikiem
kondensacji z naftolem jest produkt o fioletowej barwie.

Dodatni wynik z odczynnikiem Molischa dają również w większym stężeniu niektóre inne

związki organiczne (aldehydy, kwasy, aceton).

Wykonanie doświadczenia

Odmierzyć l ml próbki oraz dodać po 4 krople odczynnika Molischa, a następnie podwarstwić

trzema mililitrami stężonego kwasu siarkowego (pipetą po ścianie skośnie ustawionej probówki).

Na granicy warstw w obecności cukrowca winien pojawić się fioletowy pierścień; często

poniżej powstaje zielony krążek pochodzący od zanieczyszczeń α-naftolu.

3.2. Próba Biała na pentozy

Reakcja Biala pozwala na odróżnienie pentoz od heksoz. Tworzący się z pentoz pod wpływem

ogrzewania z kwasem solnym furfural reaguje z orcyną (metylowa pochodna dwufenolu - rezorcyny),
tworząc kompleks o zielonym zabarwieniu.

W tych samych warunkach dodatni wynik dają również dezoksypentozy, ale w słabym

stopniu. Natomiast heksozy przekształcają się w hydroksymetylofurfural rozkładający się dalej.
Związek ten tworzy z orcyną żółtobrązowy produkt.

Wykonanie doświadczenia

Do probówki odmierzyć 5 ml odczynnika Biala. (Uwaga: pobierać pipetą z gruszką) i

ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 minut. Następnie do probówki wprowadzić l ml badanego
roztworu. Ogrzewać przez kilka minut i zanotować wynik.

3.3. Wykrywanie DNA metodą dwufenyloaminową

Powszechnie stosowana metoda oznaczenia dezoksypentozy opiera się na reakcji z

dwufenyloaminą. Reakcja ta polega na tworzeniu niebieskiego zabarwienia podczas ogrzewania DNA
z dwufenyloaminą, kwasem octowym i siarkowym o temperaturze 100° przez kilka minut. Znacznie
lepszą czułość reakcji otrzymuje się przez dodanie kwasu nadchlorowego oraz aldehydu octowego i
rozwijanie koloru przez 17 godzin w 30°C, jednakże ze względów czasowych w ćwiczeniu
wykorzystany jest pierwszy sposób prowadzenia reakcji. W reakcji bierze też udział wolna
deoksyryboza.

Wykonanie ćwiczenie

Do probówki wprowadzić 1 ml badanej próbki oraz 4 ml odczynnika dwufenyloaminowego i

ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Zanotować wynik.

3.4. Wykrywanie kwasu fosforowego

Obecność ortofosforanu w hydrolizacie kwasów nukleinowych można wykazać stosując

kwaśny roztwór molibdenianu amonowego. Tworzy się wówczas kompleks soli amonowej kwasu
cztero-trójmolibdenianofosforowego o żółtej barwie.

Dalsza reakcja wytworzonej soli z kwasem 1-amino-2-naftalo-4-sulfonowym, w wyniku której

następuje redukcja molibdenu związanego w soli kompleksowej do niższych tlenków molibdenu
(błękit molibdenowy), jest podstawą ilościowego oznaczenia fosforu w materiale biologicznym.

Wykonanie ćwiczenia

Do 0,5ml hydrolizatu dodać roztworu amoniaku aż do uzyskania alkalicznego odczynu. Ciecz

zakwasić stężonym kwasem azotowym (V) i dodać 3 ml molibdenianu amonu. Ogrzewać do wrzenia.
Zanotować obserwacje.

3.5. Reakcja Feulgena na deoksyrybozę

Reakcja Feulgena jest charakterystyczna dla kwasu deoksyrybonukleinowego; DNA

ogrzewa się z kwasem solnym, a po dodaniu roztworu fuksyny uzyskuje się barwę
fioletowoczerwoną; reakcja Feulgena uwarunkowana jest obecnością deoksyrybozy; stosuje
się m.in. do wybarwiania preparatów histologicznych.

Wykonanie ćwiczenia
Do 1ml ekstraktu drożdżowego dodać 5-6 kropli 1M roztworu HCl. Probówkę umieścić we wrzącej
łaźni wodnej na około 5 min. Po oziębieniu doprowadzić pH do 5 za pomocą 0,1 M roztworu NaOH.
Następnie dodać 2ml odczynnika Schiffa. Powstaje czerwone zabarwienie, które wskazuje na
obecność deoksyrybozy.

Sprawozdanie:
Omówić wyniki uzyskanych obserwacji odpowiadając jednocześnie na pytania:
Czy w badanej próbie występują cukrowce?
Czy w badanej próbie występują DNA i/lub RNA?
Jeżeli podczas wykonywania ćwiczenia natknięto się na rozbieżności w stosunku do informacji
zawartych w instrukcji (np. czas inkubacji w łaźni wodnej), należy przedstawić własne obserwacje.
Na podstawie składu chemicznego DNA i RNA wskazać sposób odróżnienia tych dwóch kwasów
nukleinowych (najlepiej wykonać tabelę porównawczą).