Obserwacje mikroskopowe

organizmów wyizolowanych

w preparatach przyżyciowych.

Cel ćwiczenia

• Nauka przygotowywania preparatów

przyżyciowych;

• nauka metody posiewu redukcyjnego.

Przygotowane preparaty

można oglądać bezpośrednio

pod mikroskopem lub dodatkowo je

wybarwić. Celem

barwienia jest

ułatwienie:

• obserwacji cech morfologicznych i diagnostycznych

(m.in.

kształt, wielkość, wzajemny układ komórek w hodowli,

tzn.

występowanie komórek pojedynczo lub w różnych

układach,

obecność

otoczek,

zdolność

ruchu,

ilość

i rozmieszczenie

rzęsek/wici, sposób rozmnażania się –

przez

podział, tworzenie pączków, zarodników i form

przetrwalnych),

• liczenia drobnoustrojów (żywych, martwych).

Barwienie

drobnoustrojów

jest

procesem

fizykochemicznym,

który polega na wniknięciu barwnika

do

wnętrza komórki i utworzeniu barwnego kompleksu

z

cytoplazmą.

W

zależności

od

sposobu

barwienia

wyróżniamy

barwienia

przyżyciowe

i

barwienie

preparatów

utrwalonych.

Przygotowanie preparatów

przyżyciowych

Preparaty

przyżyciowe służą do obserwacji ruchliwości,

żywotności,

sposobu

rozmnażania,

a

czasami

do

wykrywania substancji zapasowych.

Najczęściej prowadzi

się obserwacje drożdży i pleśni ze względu na ich budowę
i rozmiar. Obserwacja bakterii, ze

względu na małe

rozmiary, ogranicza

się jedynie do oceny ich ruchliwości.

Preparaty

przyżyciowe

wykonuje

się

na

szkiełku

podstawowym (w kropli

spłaszczonej), a w przypadku

badania

ruchliwości bakterii lub prowadzenia obserwacji

nad

sposobem

rozmnażania

drożdży

preparaty

wykonujemy na

szkiełku z wgłębieniem zwanym komorą

Lindnera (w kropli

wiszącej).

Wykonywanie preparatu w kropli

spłaszczonej

• Na odtłuszczonym szkiełku podstawowym (wyjęte

z alkoholu,

dokładnie wytarte i trzykrotnie przeciągnięte

nad

płomieniem palnika) umieszcza się kroplę płynnej

hodowli

drobnoustrojów

i

nakrywa

szkiełkiem

nakrywkowym,

opuszczając

je

ukośnie

w

celu

wyeliminowania

pęcherzyków powietrza. Nadmiar płynu

osusza

się

bibułą

filtracyjną.

Przy

sporządzaniu

preparatu z hodowli na

podłożu stałym lub z produktów

o konsystencji mazistej

należy nanieść na szkiełko

najpierw

kroplę jałowej wody destylowanej, a następnie

pobrany za

pomocą ezy materiał rozprowadzić w tej

kropli.

Całość nakryć szkiełkiem nakrywkowym.

• Preparaty przyżyciowe należy oglądać bezpośrednio po

przygotowaniu,

żeby nie dopuścić do przeschnięcia

materiału.

Najlepszą

jakość

uzyskuje

się

przy

preparatach cienkich, blisko brzegu kropli.

Barwienie preparatów

przyżyciowych

Preparat

przyżyciowy może być barwiony lub nie barwiony. Chcąc

wykonać barwienie obok kropli z materiałem badanym umieszcza

się

kroplę

barwnika,

miesza

ezą

i

przykrywa

szkiełkiem

nakrywkowym. Stosowane barwniki nie

mogą być toksyczne

i

muszą się charakteryzować wysoką kontrastowością. Mimo że

używa się ich w bardzo dużym rozcieńczeniu i tak wywołują
zahamowanie

rozmnażania.

• barwienie błękitem metylenowym pozwala ocenić żywotność

mikroorganizmów; barwnik przenika do wnętrza martwej

komórki, która barwi się na ciemnoniebiesko,

• barwienie płynem Lugola umożliwia wykrycie w komórce drożdży

substancji zapasowych

– glikogenu, który barwi się na brunatno,

a cytoplazma

komórki jasnożółto,

• barwienie bakterii płynem Lugola pozwala u gatunków

beztlenowych

wykryć granulozę - cukier stanowiący substancję

zapasową tych bakterii.

Metoda posiewu redukcyjnego

kolisty

nieregularny

soczewkowaty

nitkowaty

rozgałęziony

kształt kolonii

gładki

falisty

nitkowaty

płatowaty

z obwódką

brzeg kolonii