UNIWERSYTET GDAŃSKI
WYDZIAŁ CHEMII

Katedra Analizy Środowiska

Instrukcja do ćwiczeń laboratoryjnych z przedmiotu "Chromatografia"

ĆWICZENIE 2

Chromatografia gazowa – analiza ilościowa

związków aromatycznych metodą wzorca

wewnętrznego, dodatku wzorca oraz normalizacji

wewnętrznej

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

2

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest porównanie metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii

gazowej. Próbka zawierająca trzy związki aromatyczne (toluen, etylobenzen i p-ksylen) o

nieznanym stężeniu będzie analizowana metodą normalizacji wewnętrznej, dodatku wzorca oraz

wzorca wewnętrznego. Zadaniem studenta jest porównanie wyników poszczególnych analiz oraz

wskazanie przyczyn ewentualnych różnic.

2. Wprowadzenie do chromatografii gazowej

Termin "chromatografia" opisuje wszystkie te metody rozdzielania mieszanin związków, w

których poszczególne składniki mieszaniny ulegają podziałowi między dwie fazy – stacjonarną i

ruchomą, ze względu na różnice we właściwościach fizykochemicznych. Jeżeli mamy do czynienia

z układem, w którym fazą ruchomą (mobilną) jest gaz, to mówimy o chromatografii gazowej (gas

chromatography, GC). Możliwa jest chromatografia w układzie gaz – ciało stałe (adsorpcyjna

chromatografia gazowa, GSC) lub częściej stosowana chromatografia w układzie gaz – ciecz

(podziałowa chromatografia gazowa, GLC). W drugim przypadku rozdzielanie mieszanin na

składniki jest uwarunkowane różnicami w powinowactwie poszczególnych związków do fazy

stacjonarnej, co wyraża się różnicami w wartościach współczynnika podziału K

c

, wyrażonego

wzorem:

m

s

c

c

c

K

=

(1)

gdzie: c

s

i c

m

oznaczają stężenia substancji badanej odpowiednio w fazie stacjonarnej

i ruchomej.

Chromatografia gazowa służy nie tylko do rozdzielania mieszanin, ale także do analizy ilościowej i

w mniejszym stopniu, analizy jakościowej szerokiej gamy związków chemicznych.

2.1. Podstawowe pojęcia i definicje w chromatografii

Każda analiza metodą chromatografii gazowej polega na selektywnym wymywaniu (elucji)

związków z próbki wprowadzonej na kolumnę chromatograficzną za pomocą gazu nośnego.

Poszczególne składniki są wykrywane przez detektor, którego sygnał jest rejestrowany za pomocą

komputera, integratora bądź rejestratora. Uzyskany wykres zależności wskazań detektora od czasu

nazywany jest chromatogramem. Poszczególne sygnały (piki) obecne na chromatogramie można

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

3

scharakteryzować za pomocą szeregu parametrów retencyjnych (retencja = zatrzymywanie):

•

Całkowity czas retencji t

R

danego składnika to czas liczony od momentu

wprowadzenia próbki (iniekcji) do momentu pojawienia się na chromatogramie

maksimum sygnału związku, czyli do pojawienia się na wyjściu z kolumny jego

maksymalnego stężenia. Stąd całkowita objętość retencji to:

V

R

= t

R

· F

c

(2)

gdzie F

c

to objętościowa prędkość wypływu fazy ruchomej z kolumny [ml/min]

Całkowitą objętość retencji, współczynnik podziału oraz objętości faz: mobilnej i

stacjonarnej (odpowiednio V

m

i V

s

) łączy równanie:

V

R

=V

m

+K

C

V

s

(3)

Posługiwanie się objętościami faz i objętościami retencji jest w chromatografii gazowej

mało wygodne, jednak na podstawie równania (3) można ustalić, że wzrost wartości

współczynnika podziału K

c

powoduje wzrost czasu retencji. Należy również pamiętać,

ż

e czas retencji wydłuża się, gdy wzrasta długość kolumny, zaś skraca się, gdy

zwiększamy prędkość przepływu fazy ruchomej. Wyprowadzenie wzoru (3) można

znaleźć w literaturze, której spis jest podany na końcu instrukcji.

•

Zerowy czas retencji t

M

to czas przebywania na kolumnie substancji, która nie

oddziałuje z fazą stacjonarną (w przypadku chromatografii gazowej np. hel, metan). Stąd

zerowa objętość retencji wyrażana jest wzorem:

V

M

= t

M

· F

c

(4)

•

Zredukowany czas retencji t'

R

to różnica pomiędzy całkowitym czasem retencji

danego składnika a zerowym czasem retencji:

M

R

R

t

t

t

−

=

'

(5)

Wielkość ta charakteryzuje zatrzymywanie się danego składnika na fazie stacjonarnej.

Pojęcia całkowitego, zerowego i zredukowanego czasu retencji ilustruje Rys. 1.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

4

Rys. 1. Przykładowy chromatogram, wyjaśniający pojęcia: całkowity czas retencji (t

RA

, t

RB

), zerowy czas retencji

(t

M

) oraz zredukowany czas retencji (t`

RA

, t`

RB

).

•

Zredukowana objętość retencji to:

M

R

R

V

V

V

−

=

'

(6)

•

Względny czas retencji równy:

'

'

,

Rw

Ri

w

i

t

t

r

=

(7)

gdzie: indeks "i" oznacza dowolną substancję, a indeks "w" oznacza wzorzec

•

Współczynnik retencji k, zdefiniowany wzorem:

M

R

M

M

R

t

t

t

t

t

k

'

=

−

=

(8)

lub:

m

s

C

m

m

s

s

m

s

V

V

K

V

c

V

c

n

n

k

=

=

=

(8a)

gdzie: n oznacza liczbę moli substancji, c jej stężenie, V objętość fazy,

K

c

to współczynnik podziału, zaś indeksy "s" i "m" dotyczą odpowiednio fazy

stacjonarnej i ruchomej.

Im większą wartość przyjmuje współczynnik k, tym silniej substancja jest

zatrzymywana przez fazę stacjonarną.

•

Indeks retencji Kovátsa I

X

– wielkość charakterystyczna dla danej substancji,

analizowanej na danej fazie stacjonarnej, służąca do analizy jakościowej; z definicji dla

n-alkanów indeksy retencji są równe 100-krotności liczby atomów węgla w cząsteczce

(np. indeks retencji dla n-heksanu wynosi 600, dla n-dekanu 1000). Indeksy retencji

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

5

wyznacza się wobec dwóch n-alkanów o z oraz z+m atomach węgla w cząsteczce, z

których pierwszy jest eluowany z kolumny przed badanym związkiem, a drugi – po tym

związku. Stosuje się wtedy wzór:

'

'

)

(

'

'

log

log

log

log

100

100

Rz

m

z

R

Rz

Rx

X

t

t

t

t

m

z

I

−

−

+

=

+

(9)

gdzie:

I

X

– indeks retencji nieznanego związku,

t´

Rx

– zredukowany czas retencji

nieznanego związku,

t´

Rz

– zredukowany czas retencji alkanu zawierającego

z atomów węgla,

t´

R(z+m)

– zredukowany czas retencji alkanu zawierającego

z+m atomów węgla.

Wzór (9) można stosować w przypadku analizy w stałej temperaturze (w izotermie).

Dla analiz w programowanej temperaturze stosuje się wzór van den Doola i Kratza:

Rz

m

z

R

Rz

Rx

Tp

T

T

T

T

m

z

I

−

−

+

=

+

)

(

100

100

(10)

gdzie:

I

Tp

– indeks retencji nieznanego związku,

T

R

– temperatura w Kelvinach,

przy której dany związek eluuje z kolumny (temperatura retencji)

lub całkowity czas retencji. Wyjaśnienie indeksów x, z, m, z+m jak we

wzorze (9).

2.2. Aparatura do chromatografii gazowej

W chromatografii gazowej gaz nośny jest oczyszczany i dostarczany do kolumny

chromatograficznej, umieszczonej w piecu chromatografu. Poprzez dozownik wprowadzamy

próbkę do strumienia gazu nośnego i dalej na kolumnę. Próbka jest rozdzielana i poszczególne

składniki trafiają do detektora. Kolumna, dozownik i detektor są utrzymywane w zaprogramowanej

temperaturze. Sygnał elektryczny z detektora jest wzmacniany i przekazywany do urządzenia

rejestrującego, którym może być rejestrator, integrator (pozwala na automatyczne określanie

między innymi czasów retencji i powierzchni sygnałów poszczególnych związków) lub, we

współczesnych zestawach, komputer. Współczesne chromatografy gazowe składają się z kilku

podstawowych części, które zostały pokazane na schemacie blokowym (Rys. 2).

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

6

Rys. 2. Schemat blokowy chromatografu gazowego: 1 – zbiornik gazu nośnego, 2 – regulacja przepływu, 3 –
filtry, 4 – dozownik, 5 – kolumna chromatograficzna, 6 – detektor, 7 – piec chromatografu, 8 – wzmacniacz
sygnału, 9 – urządzenie rejestrujące.

2.2.1. Zbiorniki gazu nośnego

Podstawowe cechy dobrego gazu nośnego to obojętność wobec fazy stacjonarnej,

elementów przyrządu oraz składników badanych mieszanin. Warunki te spełniają: hel, argon, azot

oraz wodór i te właśnie gazy stosowane są najczęściej. Gaz nośny jest zwykle dostarczany z butli

ciśnieniowych, wyjątkiem jest wodór, który można także dostarczać do chromatografu przy użyciu

generatorów elektrolitycznych. Ważny jest również stopień czystości gazu nośnego, gdyż

zanieczyszczenia mogą powodować zakłócenia pracy detektora i dezaktywację faz stacjonarnych.

Przed kolumną zwykle znajdują się zatem filtry (różnego rodzaju adsorbenty), służąc do usuwania

tlenu, wody i zanieczyszczeń organicznych. Przed wlotem na kolumnę znajdują się również

regulatory przepływu, pozwalające na utrzymanie stałego ciśnienia gazu na pożądanym poziomie.

Gaz nośny dobiera się często pod kątem przydatności do pracy w zestawie z konkretnym

detektorem (patrz punkt 2.2.4).

2.2.2. Dozowniki

Chromatografia gazowa służy do rozdzielania substancji, które w warunkach analizy mają

postać par lub gazów. Są to zatem te substancje, których temperatura wrzenia lub sublimacji nie

przekracza około 300-400°C (w zależności od możliwości konkretnego modelu chromatografu).

Dozowanie próbki musi przebiegać możliwie powtarzalnie i powinno wprowadzać na kolumnę

możliwie małe ilości próbki. Dozowniki pozwalają na wprowadzenie do strumienia gazu nośnego

analizowanych substancji. Często dozownik jest ogrzewany do takiej temperatury, by już w jego

obrębie wprowadzone substancje przeszły w stan gazu. W przypadku kolumn kapilarnych stosuje

się zwykle dwa typy dozowników:

•

dozowniki z dzieleniem strumienia (ze spliterem, split injection) – w tym przypadku do

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

7

gorącego dozownika wprowadza się próbkę za pomocą strzykawki przez membranę;

większość odparowanej próbki jest usuwana na zewnątrz przyrządu ze strumieniem gazu

nośnego, tylko niewielka jej część trafia wraz z gazem do kolumny; pozwala to na

dozowanie próbki w ilości optymalnej dla kolumn kapilarnych o małej średnicy,

natomiast problemem jest zapewnienie stałego stopnia podziału strumienia gazu tak, by

dozowano zawsze taką samą część próbki; obecne rozwiązania pozwalają na zmianę

stopnia podziału strumienia aż do takiego stanu, że dozowana jest cała próbka

(dozownik split – splitless)

•

dozowniki typu on-column – w tym przypadku ciekła próbka jest dozowana poprzez

nieogrzewany dozownik bezpośrednio na kolumnę o temperaturze 20-60°C, po czym

kolumna jest ogrzewana, odparowuje rozpuszczalnik, a następnie składniki próbki;

metoda ta zmniejsza prawdopodobieństwo termicznego rozkładu związków o małej

stabilności w wyższych temperaturach, jednak powoduje powstanie ryzyka

zanieczyszczenia początkowego odcinka kolumny substancjami nielotnymi lub słabo

lotnymi, wprowadzanymi razem z próbką

W rutynowych analizach często stosuje się obecnie dozowniki automatyczne, które w

zaprogramowany sposób dozują poszczególne próbki. Cały proces obejmuje programowanie

kolejności i ilości nastrzyków każdej próbki, płukania strzykawki i innych czynności.

2.2.3. Kolumny chromatograficzne

Współczesna chromatografia gazowa opiera się głównie na zastosowaniu tzw. kolumn

kapilarnych (o przekroju otwartym, open tubular, OT). Można wyróżnić trzy podstawowe typy tych

kolumn:

•

kolumny do chromatografii w układzie gaz – ciało stałe z porowatą warstwą adsorbentu

na ściankach (porous layer open tubular, PLOT)

•

kolumny z naniesionym na ścianki nośnikiem nasyconym ciekłą fazą stacjonarną

(support coated open tubular, SCOT)

•

kolumny ze ściankami pokrytymi ciekłą fazą stacjonarną (wall-coated open tubular,

WCOT)

W dalszej części instrukcji omawiane będą tylko kolumny z ciekłą fazą stacjonarną.

Kolumny kapilarne wykonane są zwykle ze stopionego kwarcu, co zapewnia im wymaganą

elastyczność i trwałość. Ich długość wynosi od 10 do nawet 300 metrów, ale najpowszechniejsze są

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

8

kolumny o długości 15-60 metrów. Średnica wewnętrzna takich kolumn to zwykle 0,2-0,3 mm, zaś

warstwa filmu ciekłej fazy stacjonarnej, pokrywającej ściankę wewnętrzną, ma zwykle grubość

rzędu ułamka mikrometra. Kolumny kapilarne wyparły tzw. kolumny pakunkowe (z wypełnieniem

fazy stacjonarnej), które są krótsze i mają większą średnicę. Stało się tak ze względu na znacznie

większą sprawność kolumn kapilarnych, która pozwoliła na osiąganie znacznie lepszych

rozdziałów.

Poniżej zostaną omówione ciekłe fazy stacjonarne, stosowane zarówno w kolumnach typu

SCOT, jak i WCOT. Należy pamiętać, że wybór odpowiedniej fazy stacjonarnej, dopasowanej do

właściwości próbki, ma kluczowe znaczenie dla jakości wyników analizy.

Ciekła faza stacjonarna powinna:

•

rozpuszczać składniki rozdzielanej próbki,

•

wykazywać chemiczną obojętność wobec składników próbki oraz nośnika,

•

charakteryzować się małą lotnością oraz wysoką stabilnością termiczną w warunkach

analizy,

•

małą lepkością,

•

dużą selektywnością wobec rozdzielanych składników.

Wybór fazy stacjonarnej zależy od temperatury wrzenia poszczególnych związków w

próbce (faza musi wytrzymać warunki termiczne, w jakich prowadzimy analizę) oraz od ich

polarności. Stosuje się regułę mówiącą, że związki o danej polarności najlepiej rozpuszczają się w

substancjach o podobnej polarności. Stąd wniosek, że związki niepolarne na niepolarnych fazach

stacjonarnych są wymywane później, niż związki polarne o zbliżonych temperaturach wrzenia

(związek niepolarny lepiej rozpuszcza się w fazie stacjonarnej, a zatem jego współczynnik podziału

jest większy). Analogicznie, na fazach polarnych związki polarne mają większe wartości czasów

retencji, niż związki niepolarne o zbliżonych temperaturach wrzenia.

Ogólny podział faz stacjonarnych ze względu na ich polarność obejmuje trzy grupy:

•

fazy niepolarne – węglowodory, które dobrze rozpuszczają substancje niepolarne;

alkany mają na tych fazach duże czasy (objętości) retencji, zaś związki polarne są

szybko eluowane; przykłady takich faz to skwalan lub Apolan-87 (Rys. 3); fazy

niepolarne charakteryzują się zwykle wysokim limitem temperatury, w której mogą

pracować

•

fazy średnio polarne – głównie silikony modyfikowane różnymi podstawnikami (grupy

metylowe, fenylowe, cyjanoalkilowe; Rys. 4); w zależności od rodzaju podstawników i

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

9

ich ilości polarność może zmieniać się w dość szerokim zakresie; przykłady faz to OV-

1, SE-30 (dimetylosilikony), OV-3, OV-7, OV-17 (fenylosilikony o rosnącym udziale

grup fenylowych), OV-225 (25% grup cyjanopropylowych)

Rys. 3. Popularne niepolarne ciekłe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej.

•

fazy polarne – poliglikole (na przykład poliglikol etylenowy; fazy PEG oraz Carbowax),

różnego rodzaju estry

Struktury faz stacjonarnych i zawartości grup modyfikujących można znaleźć w licznych

katalogach producentów kolumn kapilarnych.

Rys. 4. Średnio polarne ciekłe fazy stacjonarne w chromatografii gazowej – silikony.

2.2.4. Detektory

Zadaniem

detektora

jest

wykrywanie

substancji,

które

opuszczają

kolumnę

chromatograficzną. Obecność w gazie nośnym innej substancji powoduje powstanie sygnału

elektrycznego, rejestrowanego przez komputer, integrator bądź rejestrator. Pożądane cechy

detektora to: duża czułość i wykrywalność, możliwie szeroki zakres liniowości wskazań (to jest,

proporcjonalności powstającego sygnału do stężenia związku), niski poziom szumów linii zerowej,

a także, jak w przypadku każdego sprzętu, możliwie niska cena i łatwość obsługi.

Detektory w chromatografii gazowej można podzielić na dwie zasadnicze grupy: detektory

uniwersalne (reagujące na związki z wielu różnych grup) oraz selektywne (wykrywające tylko

wybrane anality).

Spośród detektorów uniwersalnych, w powszechnym użyciu znajduje się detektor

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

10

płomieniowo–jonizacyjny (flame ionization detector, FID). Wykrywa on związki organiczne,

natomiast nie reaguje sygnałem na substancje nieorganiczne i takie związki węgla, jak CO, CO

2

,

CS

2

, HCOOH i COCl

2

. Sygnał detektora FID jest proporcjonalny do liczby atomów węgla, które

nie są związane z tlenem, a więc do masy substancji. Należy przy tym pamiętać, że wielkość

sygnału zależy także od charakteru substancji (zagadnienie to zostanie omówione w rozdziale

poświęconym analizie ilościowej). Detektor FID jest czuły, pozwala wykryć już 10

-12

g substancji

badanej. Zasada działania polega na pomiarze zmian przewodności elektrycznej atmosfery

płomienia w detektorze. Jeśli w płomieniu pojawi się związek organiczny, w wyniku jego spalania

powstają karbojony. Powstający prąd jonizacyjny jest wzmacniany i rejestrowany. Płomień

uzyskuje się, stosując mieszaninę wodoru i powietrza, doprowadzanych z butli ciśnieniowych.

Odpowiedni gaz nośny dla detektora FID to azot, hel lub argon.

Innym detektorem uniwersalnym jest katarometr, czyli detektor termokondukto-

metryczny (cieplno-przewodnościowy, thermal conductivity detector, TCD). Jego działanie polega

na pomiarze różnic w przewodności cieplnej czystego gazu nośnego oraz gazu opuszczającego

kolumnę. Jest to zatem detektor różnicowy. Wykrywa wszystkie związki, których przewodność

cieplna różni się od przewodności gazu nośnego. Jest detektorem stężeniowym (sygnał jest

proporcjonalny do stężenia substancji). Stosowane gazy nośne to wodór i hel. Wadami tego

urządzenia są: mniejsza niż w przypadku detektora FID czułość (pozwala wykryć 10

-7

– 10

-8

g

substancji w cm

3

fazy ruchomej), mniejszy zakres liniowości wskazań oraz konieczność

zachowania stałej temperatury detektora przez cały czas analizy (z dokładnością do dziesiątych

części stopnia Celsjusza), aby uzyskać wiarygodne wyniki.

Spośród detektorów selektywnych, na uwagę zasługują: detektor płomieniowo-

fotometryczny (flame photometric detector, FPD), służący do wykrywania związków siarki i

fosforu, detektor termojonowy (thermionic detector, TID), przydatny w analizie związków azotu i

fosforu, oraz detektor wychwytu elektronów (electron capture detector, ECD), który znalazł

zastosowanie w analizie substancji o znacznym powinowactwie elektronowym, głównie związków

halogenoorganicznych. Bliżej zostanie omówiony tylko ten ostatni.

Detektor ECD jest detektorem radiojonizacyjnym, a zatem zachodzi w nim proces jonizacji

analizowanych substancji za pomocą promieniowania jonizującego. Źródłem promieniowania β jest

folia z

63

Ni. W komorze detektora znajduje się również katoda oraz anoda. Gaz nośny (azot lub

argon) jest jonizowany przez cząstki β:

e

N

N

+

→

+

+

2

2

β

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

11

Wskutek powstania elektronów otrzymujemy prąd tła, który odpowiada linii podstawowej na

chromatogramie. Jeśli do detektora trafia substancja o dużym powinowactwie elektronowym,

wychwytuje ona elektrony, tworząc jony ujemne:

−

→

+

X

e

X

Te z kolei rekombinują z dodatnimi jonami gazu nośnego, tworząc cząsteczki obojętne:

2

2

N

X

N

X

+

→

+

+

−

Powyższe reakcje powodują spadek natężenia prądu tła, co w efekcie prowadzi do zarejestrowania

sygnału. Detektor ECD jest powszechnie używany w analizie chlorowcopestycydów. Wykrywa

nawet 10

-14

g Cl/cm

3

gazu nośnego.

Należy jeszcze wspomnieć o połączeniu chromatografii gazowej z technikami

spektroskopowymi. W takim układzie można mówić albo o wykorzystaniu spektroskopów lub

spektrometrów jako detektorów w GC, bądź też o wykorzystaniu chromatografu gazowego jako

układu wprowadzania próbki do przyrządu mierzącego widmo. Do analizy związków organicznych

szczególnie przydatne jest połączenie chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS),

które pozwala na uzyskanie wielu dokładnych danych na temat struktury poszczególnych związków

oraz ustalenie ich mas cząsteczkowych. Informacje na temat obecności w cząsteczce analizowanej

substancji różnych grup funkcyjnych daje połączenie GC ze spektroskopią w podczerwieni (GC-

IR). Istnieją również połączenia chromatografii gazowej i spektroskopii atomowej, zarówno

absorpcyjnej, jak i emisyjnej, przydatne np. w analizie związków metaloorganicznych.

2.3. Parametry opisujące jakość rozdziału i sprawność kolumny

2.3.1. Jakość rozdziału chromatograficznego

Miarą skuteczności rozdzielenia składników mieszaniny jest:

•

współczynnik selektywności α (retencja względna; zdolność fazy stacjonarnej do

rozdzielenia dwóch składników) dla sygnałów związków A i B jest wyrażany wzorem:

A

B

M

RA

M

RB

k

k

t

t

t

t

=

−

−

=

α

(11)

•

zdolność rozdzielcza kolumny R

S

:

B

A

RA

RB

S

w

w

t

t

R

+

−

=

2

(12)

gdzie: w

A

i w

B

oznaczają szerokości pików substancji A i B mierzone przy podstawie.

Rozdzielczość zależy od wielu czynników aparaturowych. Znaczący wpływ ma temperatura

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

12

analizy, co zostanie bliżej omówione w dalszej części instrukcji.

2.3.2. Sprawność kolumny – pojęcie półki teoretycznej

Sprawność kolumny decyduje o tym, jaka będzie jakość uzyskanego chromatogramu.

Wysoka sprawność objawia się ostrymi, wąskimi pikami substancji chromatografowanych i dobrym

rozdziałem mieszaniny. Miarą sprawności kolumny chromatograficznej jest

wysokość równoważna

półce teoretycznej (WRPT lub HETP, height equivalent to a theoretical plate).

Półka teoretyczna – objętość kolumny, w której osiągany jest stan równowagi między stężeniami

substancji chromatografowanej w fazie ruchomej i stacjonarnej. Im więcej półek teoretycznych

(mniejsza wartość WRPT) ma kolumna, tym większa jest jej sprawność.

Każda kolumna składa się z N hipotetycznych półek teoretycznych, czyli:

NH

L

=

(13)

oraz:

H

L

N

=

(14)

gdzie: L – długość kolumny, H – wysokość równoważna półce teoretycznej (WRPT).

Liczbę półek teoretycznych można obliczyć, wykorzystując w tym celu substancję testową o

współczynniku retencji k w zakresie 5-10, pod warunkiem, że pik tej substancji ma kształt krzywej

Gaussa. Wtedy:

2

2

/

1

54

,

5













=

w

t

N

R

(15)

lub:

2

16













=

B

R

w

t

N

(16)

gdzie: t

R

– czas retencji (wygodnie jest zastąpić go odległością retencji na wydruku

chromatogramu), w

1/2

– szerokość piku w połowie jego wysokości, w

B

–

szerokość piku przy podstawie (

szerokości piku i czas retencji wyrażamy

zawsze w takich samych jednostkach - czasu lub odległości).

Analogicznie obliczamy efektywną liczbę półek teoretycznych, ale zamiast całkowitych

czasów retencji używamy w tym celu czasów zredukowanych. Kolumny kapilarne osiągają

wartości 4000-5000 półek teoretycznych na metr, co czyni je kilkukrotnie bardziej sprawnymi od

kolumn pakunkowych i wielokrotnie – od kolumn do niskociśnieniowej chromatografii cieczowej.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

13

Wartość WRPT w chromatografii podziałowej zależy od trzech zasadniczych czynników:

•

dyfuzji wirowej gazu nośnego (

A), wprost proporcjonalnej do średnicy ziaren

wypełnienia kolumny (w przypadku kolumn kapilarnych z ciekłą fazą stacjonarną – do

parametrów nośnika tej fazy),

•

dyfuzji podłużnej (

B) w fazie ruchomej (dyfuzji cząsteczek wzdłuż kolumny w obu jej

kierunkach), zależnej od krętości drogi gazu nośnego w obrębie ziaren wypełnienia,

•

oporu przenoszenia masy w fazie stacjonarnej (

C), zależnego od współczynnika retencji

k, grubości filmu fazy stacjonarnej oraz od współczynnika dyfuzji danego związku w

ciekłej fazie stacjonarnej.

Biorąc pod uwagę te trzy czynniki, można je połączyć w jedno uproszczone równanie,

opisujące sprawność kolumny i zwane

równaniem van Deemtera:

u

C

u

B

A

H

+

+

=

(17)

gdzie: ū oznacza liniową prędkość przepływu gazu nośnego.

Zależność ta jest równaniem hiperboli o różnym przebiegu dla różnych gazów nośnych (Rys. 5).

Analogiczną do wzoru (17) zależność można napisać, zamieniając w równaniu wartość

prędkości przepływu gazu nośnego temperaturą. Oznacza to, że dana kolumna z określoną fazą

stacjonarną ma zarówno optimum termiczne, w którym osiąga maksymalną sprawność, jak i

optymalną wartość ū. Zwykle stosowane są temperatury i prędkości przepływu gazu większe, niż

wartości optymalne, obliczone z równania van Deemtera. Wiąże się to z faktem, że pewien spadek

sprawności kolumny jest rekompensowany krótszym czasem analizy.

Zagadnienie teorii półek teoretycznych jest znacznie szerzej opisane w literaturze

poświęconej chromatografii.

Rys. 5. Zależność WRPT od prędkości przepływu gazu nośnego dla azotu, helu i wodoru.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

14

2.4. Czynniki wpływające na przebieg i jakość rozdziału

Wysoka sprawność kolumny, objawiająca się małymi wartościami WRPT, decyduje w

głównej mierze o tym, jak wyglądają piki analizowanych substancji. Im wyższa sprawność, tym

piki węższe i ostrzejsze. Aby jednak dwie substancje rozdzieliły się w wystarczającym stopniu,

wymagana jest również dostateczna selektywność na danej fazie stacjonarnej (patrz wzór 11). Rys.

6 przedstawia chromatogramy uzyskane na kolumnie o tej samej sprawności, ale różnej

selektywności fazy stacjonarnej wobec rozdzielanych składników.

Rys. 6. Chromatogramy tych samych związków, uzyskane podczas analizy na fazie stacjonarnej o zbyt małej (z
lewej) i wystarczającej (z prawej) selektywności [2].

Uzyskane chromatogramy wskazują, że w pierwszym przypadku rozdzielczość była zbyt

niska (patrz wzór 12). Przyjmuje się, że składniki są dobrze rozdzielone, gdy rozdzielczość jest nie

mniejsza niż 1, natomiast rozdzielenie pików do linii podstawowej uzyskujemy przy R

S

=1,15.

Zakładając żądaną rozdzielczość i uwzględniając parametry rozdzielania, możemy obliczyć ilość

półek teoretycznych N (a zatem także długość kolumny), potrzebną do osiągnięcia założonej

rozdzielczości:

2

2

1

1

16













+













−

=

k

k

R

N

S

α

α

(18)

gdzie: zdolność rozdzielcza kolumny R

S

, α – współczynnik selektywności,

k – współczynnik retencji.

Znaczny wpływ na rozdział mieszaniny składników mogą mieć procesy zachodzące na

powierzchni wewnętrznych ścianek kolumny, które zostały pozbawione warstwy ciekłej fazy

stacjonarnej. Im dłuższy czas używania kolumny i bardziej drastyczne warunki analizy (wysoka

temperatura), tym większe fragmenty ścianki kolumny mogą być odsłaniane. Sprawia to, że związki

o większej polarności (zawierające grupy hydroksylowe, aminowe czy karboksylowe) są

adsorbowane na powierzchni ścianki kolumny. Należy pamiętać, że szklane i kwarcowe kolumny

kapilarne wykazują aktywność adsorpcyjną ze względu na obecność na ich powierzchni grup

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

15

silanolowych. Efektem powyżej opisanego zjawiska może być: zmiana czasów retencji związków,

poszerzenie pików (związane ze zwiększeniem WRPT), zmniejszenie powierzchni pików

(powoduje błędy w analizie ilościowej) i deformacja kształtu sygnałów (tzw. ogonowanie, Rys. 7).

Wszystkie te zjawiska zaburzają uzyskane chromatogramy i mogą prowadzić do błędnej

interpretacji uzyskanych wyników. Związki zawierające w swej budowie wymienione grupy

funkcyjne często analizuje się w postaci pochodnych, co nie tylko ułatwia analizę np. poprzez

zwiększenie lotności, ale również niweluje w dużym stopniu wspomniane zakłócenia.

Rys. 7. Deformacje kształtu sygnałów chromatograficznych powstałe: (a) w wyniku przeładowania kolumny
(wprowadzenia zbyt dużej ilości związku na kolumnę); (b) z powodu oddziaływań o charakterze adsorpcyjnym
ze ściankami kolumny.

Jakość kolumn kapilarnych pod kątem występowania omówionych zjawisk adsorpcyjnych

można ocenić, stosując test Groba. Polega on na przeprowadzeniu analizy mieszaniny, zawierającej

ś

ciśle określone ilości konkretnych związków chemicznych o różnych właściwościach. Jedna

analiza z możliwością zastosowania programu temperaturowego pozwala na oszacowanie, w jakim

stopniu zachodzi adsorpcja na ściankach kolumny.

Na jakość rozdziału wpływają także inne czynniki aparaturowe, takie jak różnego rodzaju

procesy dyfuzyjne występujące w dozowniku i w połączeniu kolumny z detektorem. Wszelkie

przestrzenie, do których gaz nośny ma utrudniony dostęp oraz różnice w średnicach przekroju

przewodów zwiększają wpływ tych efektów na jakość rozdziału.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

16

2.4.1. Wpływ temperatury na jakość rozdziału

Temperatura analizy jest, obok rodzaju kolumny i fazy stacjonarnej, czynnikiem

decydującym o jakości uzyskanych wyników. Wybór odpowiedniej temperatury kolumny zależy od

temperatury wrzenia analizowanych związków oraz od zastosowanej fazy stacjonarnej. Należy

pamiętać, aby sprawdzić limit temperatury dla kolumny, której użycie planujemy. Generalnie

stosuje się temperatury nieco niższe niż maksymalne dopuszczalne. Polarne fazy stacjonarne mają

zwykle niższe limity temperatury niż fazy niepolarne. Dostępne są kolumny do

wysokotemperaturowej chromatografii gazowej (HT-GC), których limity przekraczają nawet

400°C. Kolumny takie, oznaczane literami HT (np. DB-1HT, RTX-1HT), posiadają zazwyczaj

niepolarne fazy stacjonarne.

Temperatury analizy w chromatografii podziałowej są zwykle nieco niższe od temperatury

wrzenia analizowanych substancji. Dobór sposobu analizy zależy w dużym stopniu od

spodziewanych różnic w temperaturach wrzenia analizowanych związków. Możliwe są dwie

podstawowe metody analizy:

•

analiza w stałej temperaturze (w izotermie) – gdy temperatury wrzenia poszczególnych

składników nie różnią się o więcej niż kilkadziesiąt stopni Celsjusza,

•

analiza w programowanej temperaturze, polegająca na podwyższaniu temperatury

kolumny o stałą wartość, zwykle od 1 do 10°C na minutę; często na początku i końcu

takiej analizy stosuje się izotermy (w temperaturze startowej oraz końcowej).

W obu przypadkach, znalezienie optymalnych warunków analizy polega na znalezieniu "złotego

ś

rodka" pomiędzy czasem analizy a jakością uzyskanego chromatogramu.

Analiza w izotermie wymaga dobrego dopasowania temperatury procesu, aby zarówno czas

analizy, jak i jakość uzyskanych wyników były zadowalające. Należy pamiętać, że wyższa

temperatura pozwala skrócić czas analizy, ale pogarsza rozdzielczość. Niska temperatura z kolei

pozwala na lepsze rozdzielenie składników mieszaniny, ale wydłuża czas analizy i powoduje

poszerzenie i asymetryczność pików. W skrajnych przypadkach zbyt niska temperatura może nie

pozwolić na elucję wszystkich składników, natomiast zbyt wysoka – uniemożliwić rozdzielenie

substancji, które będą eluowały prawie w tym samym czasie. W praktyce, dla mieszanin związków

różniących się temperaturą wrzenia o około 100°C i więcej, znalezienie optymalnej temperatury

analizy w izotermie często okazuje się niemożliwe. W takim przypadku, należy zastosować analizę

w programowanej temperaturze.

Liniowy wzrost temperatury podczas analizy przynosi wiele korzyści. Po pierwsze –

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

17

możliwe jest rozpoczęcie chromatografowania od tak niskiej temperatury, że wszystkie związki

zatrzymają się na początku kolumny i będą przez nią migrować wraz ze wzrostem temperatury.

Dzięki temu unikamy stosowania zbyt wysokiej temperatury początkowej, powodującej słabe

rozdzielenie składników mieszaniny o najniższych temperaturach wrzenia. Po drugie – możemy tak

dobrać szybkość wzrostu temperatury, że wszystkie składniki zostaną rozdzielone w zbliżony

sposób i w rozsądnym czasie. Należy pamiętać, że im szybszy wzrost temperatury, tym gorszy efekt

rozdzielania i krótszy czas analizy. Do analizy dużej grupy związków o skrajnie różnych

temperaturach wrzenia (a taki charakter mają często próbki naturalne), analiza w programowanej

temperaturze jest jedynym możliwym wyborem, pozwalającym na zadowalające rozdzielenie

wszystkich składników w rozsądnym czasie.

Analiza w programowanej temperaturze wymaga stosowania faz stacjonarnych o dużej

stabilności termicznej w szerokim zakresie temperatur. Mniej stabilne fazy mogą być stopniowo

wynoszone z kolumny wraz ze wzrostem temperatury, przez co wyniki analiz ulegają pogorszeniu,

a czas życia kolumny bardzo się skraca. Widocznym efektem tego zjawiska jest dryf (podnoszenie

się) linii podstawowej chromatogramu.

Rys. 8. Chromatogramy mieszanin n-alkanów w: możliwie dobrze dobranej izotermie (a, zwróć uwagę na
poszerzenie ostatnich pików), w izotermie w zbyt wysokiej temperaturze (b) oraz w programie temperaturowym
(c) [2].

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

18

2.5. Analiza jakościowa i ilościowa w chromatografii gazowej.

2.5.1. Analiza jakościowa

Chromatografia gazowa nie jest idealnym narzędziem do identyfikacji rozdzielanych

substancji, jednak daje pewne możliwości w analizie jakościowej. Podstawowym sposobem

postępowania jest wykorzystywanie parametrów retencji i porównywanie ich z danymi dostępnymi

w literaturze. Często stosuje się:

•

względne czasy retencji, wyznaczane wobec określonej substancji

•

indeksy retencji (patrz wzory 9, 10)

Należy pamiętać, że wszelkie parametry retencji są, dla danego związku, charakterystyczne na

określonej (lub bardzo podobnej) fazy stacjonarnej. W pewnym stopniu zależą też od warunków

analizy, głównie od temperatury.

Związki organiczne należące do jednego szeregu homologicznego (szereg homologiczny

tworzą związki różniące się w budowie jedynie kolejnymi grupami – CH

2

–) wykazują ciekawą

cechę. Zależność logarytmów ich zredukowanych czasów bądź objętości retencji od liczby atomów

węgla lub temperatury wrzenia ma przebieg w przybliżeniu prostoliniowy, jak przedstawiono to na

Rys. 9. Jeśli mamy dane retencyjne dwóch związków z szeregu homologicznego, możemy w miarę

dokładnie przewidzieć parametry retencyjne innych związków z tego szeregu.

Rys. 9. Zależność logarytmów zredukowanych objętości retencji (lub zredukowanych czasów retencji) od liczby
atomów węgla w cząsteczce dla związków z jednego szeregu homologicznego. Linia przerywana wskazuje na
odchylenia od prostoliniowości tej zależności, istniejące dla pierwszych związków szeregu. Podobne odchylenia
wykazują homologi o bardzo dużych masach cząsteczkowych.

Stosunkowo duże możliwości daje wykorzystanie detektorów selektywnych. Użycie detektora

ECD pozwala na wykrycie nawet bardzo małych ilości związków chlorowcopochodnych w

mieszaninie. Podobnie detektor FPD służy do analizy związków organicznych zawierających siarkę i

fosfor, a detektor termojonowy pozwala selektywnie wykrywać związki zawierające fosfor lub azot.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

19

Nieporównywalnie większe możliwości w porównaniu z wyżej wymienionymi metodami

mają układy łączące chromatografię gazową z metodami spektroskopowymi. W analizie związków

organicznych połączenie GC ze spektrometrią mas (GC-MS) jest obecnie rutynowo

wykorzystywane we wszelkich analizach, szczególnie skomplikowanych mieszanin pochodzenia

naturalnego. Możliwość zarejestrowania widm mas poszczególnych związków połączona z

otrzymaniem parametrów retencyjnych substancji daje bardzo duże możliwości ustalenia struktury

związku organicznego. Dodatkowe informacje, często w pełni wystarczające do identyfikacji

analizowanych substancji, można otrzymać dzięki analizie różnego rodzaju pochodnych. Również

cenne informacje, chociaż rzadko wystarczające do pełnej identyfikacji związków, daje połączenie

GC-IR, które pozwala często na określenie przynależności badanych substancji do danej grupy

związków organicznych.

2.5.2. Analiza ilościowa

Chromatografia gazowa jest powszechnie wykorzystywana do wykonywania analizy

ilościowej nawet bardzo złożonych mieszanin. Warunkami wykonania poprawnych pomiarów są:

zachowanie stałych warunków analizy (jak np. stały przepływ gazu nośnego, stała lub zmieniająca

się o stałą wartość temperatura kolumny), możliwie duża powtarzalność kolejnych analiz,

znajomość sposobu, w jaki detektor reaguje na konkretne związki. Duże znaczenie ma zakres

liniowości wskazań detektora (zakres mas lub stężeń, dla których odpowiedź detektora jest

liniowa). W obrębie tego zakresu powierzchnia lub wysokość piku substancji jest wprost

proporcjonalna do masy/stężenia związku. Najpowszechniej wykorzystywanym detektorem w

analizach ilościowych jest detektor płomieniowo-jonizacyjny, dlatego też omawiane zagadnienia

będą dotyczyły głównie tego detektora.

Najdokładniejszą metodą wyznaczania odpowiedzi detektora jest określanie powierzchni pików.

Wysokości pików są mniej przydatne, gdyż w przypadku, gdy część sygnałów jest poszerzona, uzyskane

wartości nie będą proporcjonalne do udziału poszczególnych substancji w mieszaninie (patrz Rys. 8a).

Obecnie powierzchnie pików są zwykle wyznaczane automatycznie przez komputer lub rejestrator. Jeśli

chcemy obliczyć powierzchnię sygnału symetrycznego, możemy użyć jednego ze wzorów:

h

hw

S

2

/

1

=

(19a)

b

hw

S

5

,

0

=

(19b)

gdzie: S – powierzchnia piku, h – jego wysokość, w

1/2h

– szerokość w połowie

wysokości, w

b

– szerokość przy podstawie.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

20

Powierzchnię sygnału niesymetrycznego obliczamy ze wzoru:

2

85

,

0

15

,

0

w

w

h

S

+

=

(20)

gdzie: w

0,15

i w

0,85

oznaczają szerokość piku na 15 i 85% jego wysokości.

Jak już wspomniano, detektor FID nie reaguje jednakowo na takie same masy różnych

substancji. Aby otrzymane wyniki analiz ilościowych odpowiadały rzeczywistości, wprowadza się

współczynniki odpowiedzi (korekcyjne) f. Współczynnik korekcyjny jest liczbą, przez którą

należy pomnożyć powierzchnię piku, aby uzyskać wartość wprost proporcjonalną do masy

związku. Wartości te ustala się wobec głównego składnika próbki lub stosowanego wzorca (dla

tego związku przyjmujemy f = 1). W takim przypadku:

W

S

W

S

Y

Y

f

m

m

=

(21)

stąd:

S

W

W

S

Y

m

Y

m

f

=

(22)

gdzie: m

S

i m

W

oznaczają masę substancji badanej i wzorca, f – współczynnik

odpowiedzi, Y

S

i Y

W

– powierzchnie lub wysokości pików substancji i wzorca.

Różnice we wskazaniach detektora FID dla różnych substancji można zaobserwować,

analizując roztwór zawierający równe masy tych substancji. Odpowiedzi detektora (a zatem

powierzchnie pików) nie będą jednakowe. Analizując złożone mieszaniny związków pochodzenia

naturalnego, dla których trudno zdobyć wzorce, często przyjmuje się, że wartości współczynników

odpowiedzi są jednakowe (równe 1) dla wszystkich substancji. Jest to źródłem pewnego błędu. Aby

zminimalizować jego znaczenie, stosuje się wzorce dla każdego szeregu homologicznego, z którego

związki są obecne w próbce. Współczynniki odpowiedzi dla homologów, które nie różnią się

zbytnio masą (liczbą atomów węgla w cząsteczce), są w przybliżeniu jednakowe.

Istnieje kilka metod analizy ilościowej, stosowanych w chromatografii gazowej:

•

metoda normalizacji wewnętrznej,

•

metoda kalibracji bezwzględnej,

•

metoda dodatku wzorca,

•

metoda wzorca wewnętrznego.

Metoda normalizacji wewnętrznej polega na wyznaczeniu udziału procentowego wszystkich

substancji w próbce. Powierzchnie sygnałów mierzy się, a ich sumę przyjmuje za 100% próbki.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

21

Powierzchnia sygnału związku A

i

w stosunku do sumy powierzchni wszystkich sygnałów

odpowiada zawartości związku w próbce:

100

%

∑

=

A

A

i

i

(23)

Jeśli analizujemy związki zbliżone strukturalnie, nie jest konieczne wyznaczanie współczynników

odpowiedzi. Dla substancji o różnej budowie należy je wyznaczyć, w przeciwnym wypadku

otrzymamy tylko szacunkowe wyniki.

Metoda kalibracji bezwzględnej służy do określania ilości jednego lub kilku składników próbki,

które są zidentyfikowane. Dla każdego związku, którego ilość w próbce chcemy wyznaczyć,

sporządza się kilka (3-5) roztworów o różnych stężeniach i kilkukrotnie wykonuje się analizę

chromatograficzną dla każdego z tych roztworów. Następnie oblicza się średnią powierzchnię lub

wysokość piku i wykreśla

krzywą kalibracyjną, przedstawiająca zależność powierzchni piku od

stężenia substancji. Wynik analizy próbki o nieznanym stężeniu związku odczytywany jest z krzywej.

Problemem w tej metodzie jest uzyskanie takiej powtarzalności dozowania kolejnych próbek, by

krzywa kalibracyjna była wiarygodna. Kłopotliwe jest już pobranie za każdym razem takiej samej

objętości roztworu do strzykawki. Należy też pamiętać, że dozownik ze spliterem, powszechnie

stosowany w chromatografii gazowej, nie utrzymuje w czasie stałego stopnia podziału strumienia

gazu nośnego, a zatem nie wprowadza zawsze takiej samej ilości próbki na kolumnę. Sprawia to, że

zastosowanie omawianej metody w analizie ilościowej za pomocą GC jest niewielkie.

Metoda dodatku wzorca polega na wykonaniu dwóch równoległych analiz – badanej próbki

(próbka A) oraz takiej samej próbki, do której dodana została ściśle określona ilość

wzorca,

będącego jednocześnie oznaczaną substancją (próbka B). Porównując uzyskane chromatogramy,

łatwo zauważyć, że w próbce B udział analitu będącego jednocześnie wzorcem jest większy. Jest to

oczywiście związane z faktem dodania pewnej jego ilości do próbki, a przyrost odpowiedzi

detektora jest wprost proporcjonalny do tej ilości. Mierzymy powierzchnie sygnałów analitu-

wzorca (A) oraz innej analizowanej substancji (B) w pierwszej (Y

A

oraz Y

B

) i drugiej (Y

A

* oraz Y

B

*)

próbce. Możemy zatem napisać:

B

A

B

A

Y

Y

m

m

=

(24a)

oraz:

*

*

B

A

B

WZ

A

Y

Y

m

m

m

=

−

(24b)

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

22

Pierwsze równanie dotyczy próbki bez dodatku wzorca, drugie – próbki z dodanym wzorcem. Po

rozwiązaniu układu równań, utworzonego z (24a) i (24b) otrzymujemy:

*

*

*

B

A

B

A

B

A

WZ

A

Y

Y

Y

Y

Y

Y

m

m

−

=

(25a)

oraz

A

B

A

B

Y

Y

m

m

=

(25b)

Korzystając z powyższych równań można obliczyć ilość wszystkich analitów obecnych w próbce.

Wprowadzenie współczynników odpowiedzi dodatkowo komplikuje obliczenia (jeśli chcesz to

sprawdzić, rozwiąż układ równań, wprowadzając te współczynniki). Analiza bez współczynników

będzie wiarygodna tylko dla substancji bardzo zbliżonych strukturalnie (np. należących do jednego

szeregu homologicznego).

Metoda wzorca wewnętrznego jest najbardziej rozpowszechnioną i dającą najbardziej wiarygodne

wyniki metodą analizy ilościowej w chromatografii gazowej. Polega na dodaniu do próbki

określonej ilości

wzorca wewnętrznego, który nie jest jednym z analizowanych związków. Jeśli

analiza obejmuje szereg etapów wstępnych, typu ekstrakcja czy oczyszczanie, wzorzec należy

dodać przed pierwszym z nich, na samym początku procesu analitycznego. Pozwala to na

zniwelowanie strat analitów, występujących na każdym etapie analizy, o ile stopień odzysku wzorca

i analizowanych substancji będzie zbliżony. Zwykle stosuje się wzorce możliwie zbliżone

strukturalnie do związków obecnych w próbce i o podobnej temperaturze wrzenia. Warunkiem jest

rozdzielanie się wzorca i analitów podczas analizy chromatograficznej. Jeśli znamy współczynniki

odpowiedzi badanych związków wobec wzorca, stosujemy wzór (21). Często nie mamy możliwości

wyznaczenia współczynników (np. z powodu niedostępności wzorców), wtedy przyjmuje się, że dla

wszystkich związków f = 1.

2.5. Wybrane wielkości w statystycznej analizie wyników

Analiza statystyczna pozwala na ocenę uzyskanych wyników w kategoriach

matematycznych. Poniżej przedstawione zostaną tylko wybrane, podstawowe wzory.

•

Średnia arytmetyczna z n wyników wyrażana jest wzorem:

n

x

x

i

∑

=

(26)

gdzie x

i

oznacza pojedynczy wynik.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

23

•

Odchylenie standardowe pojedynczego wyniku (SD, standard deviation), które jest

miarą rozrzutu wartości indywidualnych wokół średniej, obliczamy ze wzoru:

(

)

1

2

−

−

=

∑

n

x

x

SD

i

(27)

•

Błąd standardowy, zwany odchyleniem standardowym średniej arytmetycznej (SE,

standard error), wyraża się wzorem:

(

)

(

)

1

2

−

−

=

=

∑

n

n

x

x

n

SD

SE

i

(28)

•

Względne odchylenie standardowe średniej arytmetycznej (RSE, relative standard

error) określa wielkość błędu standardowego wobec wartości średniej i wyrażane jest w

%:

100

x

SE

RSE

=

(29)

3. Część doświadczalna

Analizowane będą roztwory trzech związków (toluen, etylobenzen,

p-ksylen), których

struktury oraz gęstości są podane na Rys. 10. Jako rozpuszczalnik zastosowano disiarczek węgla

CS

2

(zastanów się, dlaczego). Wzorcem wewnętrznym jest izooktan (2,2,4-trimetylopentan) o

gęstości 0,6919 g/ml. Związki zawarte w próbce na kolumnie z niepolarną fazą stacjonarną eluują w

następującej kolejności: izooktan, toluen, etylobenzen,

p-ksylen. Zastanów się, jaka własność

izooktanu sprawia, że jest on wymywany z kolumny jako pierwszy.

Rys. 10. Wzory strukturalne i gęstości związków analizowanych w ćwiczeniu.

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

24

3.1. Chromatograf gazowy i warunki analizy chromatograficznej

•

chromatograf gazowy Varian Aerograph 1440 z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym,

•

kolumna kapilarna WCOT FUSED SILICA o wymiarach 30 m x 0,25 mm, z filmem

fazy stacjonarnej CP SIL 5CB o grubości 0,25 µm,

•

temperatura dozownika i detektora 175°C, kolumny 30°C,

•

gaz nośny – argon

3.2. Warunki pracy i obsługa integratora

•

model ChromJet Integrator (Thermo Separation Products)

•

po włączeniu integratora należy ustawić następujące parametry: atenuacja 16 (ATTEN

16 Enter), przesuw papieru 1 (CHART SPEED 1 Enter), PLOT AUTO

•

do rozpoczęcia analizy i jej zakończenia służy przycisk INJ/END A; raport zostanie

wydrukowany automatycznie

3.3. Sprzęt i odczynniki

•

roztwory wzorcowe i badane:

PRÓBKA BADANA o nieznanych stężeniach toluenu, etylobenzenu i

p-ksylenu,

PRÓBKA Z DODATKIEM WZORCA (próbka badana + 10 µl toluenu/10 ml

roztworu),

PRÓBKA DO WYZNACZANIA WSPÓŁCZYNNIKÓW ODPOWIEDZI (zawiera

po 20 µl izooktanu, toluenu, etylobenzenu i

p-ksylenu w 10 ml roztworu),

PRÓBKA Z WZORCEM WEWNĘTRZNYM (próbka badana + 10 µl izooktanu/10

ml roztworu);

•

disiarczek węgla,

•

strzykawka o pojemności 10 µl.

3.4. Obsługa chromatografu i integratora

•

odkręcić zawory argonu, powietrza i wodoru.

•

włączyć zasilanie chromatografu.

•

włączyć grzałkę dozownika i detektora.

•

po osiągnięciu przez detektor temperatury 100°C zapalić palnik detektora FID (zapalenie

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

25

go w niższej temperaturze spowoduje kondensację pary wodnej w obudowie) ;

ww.

czynności wykonuje prowadzący!,

•

włączyć i zaprogramować integrator według wskazówek z punktu 3.2.

•

po ustaleniu się temperatury dozownika i detektora na poziomie 170-180°C rozpocząć

analizy;

UWAGA – DOZOWNIK JEST GORĄCY!

•

po skończonych analizach wyłączyć grzałkę i zasilanie chromatografu oraz zakręcić

zawory na butlach z gazami;

wykonuje prowadzący!

3.5. Wykonanie analiz

•

sprawdzić, czy przez kolumnę przepływa gaz nośny, wykonując nastrzyk około 1 µl

toluenu,

•

wykonać analizę próbki badanej

(A) oraz próbki z dodatkiem wzorca (B); wykonać 4

powtórzenia każdej z próbek, nastrzykując je na przemian,

•

pięciokrotnie wykonać analizę próbki do wyznaczania współczynników odpowiedzi

(C),

•

wykonać pięć analiz próbki z wzorcem wewnętrznym

(D).

Każda analiza trwa około 6-7 minut. Należy nastrzykiwać po około 1,5 µl próbki za pomocą

strzykawki 10 µl. Strzykawkę należy myć w disiarczku węgla. Użycie innych rozpuszczalników

spowoduje pojawienie się na chromatogramie dodatkowego sygnału. Raport z analizy obejmuje

szereg wielkości, w tym czasy retencji oraz powierzchnie pików.

4. Opracowanie wyników

•

Na podstawie podanych wyżej gęstości związków, oblicz masy toluenu, etylobenzenu,

p-ksylenu oraz izooktanu w próbkach

C i D oraz masę toluenu dodanego do próbki

badanej (

B).

•

Zidentyfikuj poszczególne związki na chromatogramach.

•

Oblicz udział procentowy trzech badanych związków w próbce badanej, korzystając z

wyników analiz dla próbki

A. Bierz pod uwagę tylko powierzchnie pików tych

substancji. Wyniki przedstaw jako średnie arytmetyczne.

•

Korzystając z wyników analiz dla próbek

A i B, oblicz masy poszczególnych analitów w

próbce badanej, korzystając z wzorów podanych przy opisie

metody dodatku wzorca.

Wykonaj obliczenia dla każdej pary pomiarów, następnie policz średnie arytmetyczne

Ćwiczenie 2. GC – porównanie metod analizy ilościowej

26

oraz odchylenia standardowe tych średnich (wzór 28). Oceń, jaki jest rozmiar

względnych odchyleń standardowych średniej (wzór 29). Czy analizy były

powtarzalne (względny błąd standardowy na poziomie 5% można uznać za

zadowalający wynik)? Czy uzyskane wyniki pokrywają się z wynikami uzyskanymi

przy wyznaczaniu udziału procentowego związków w próbce badanej?

•

Dla każdej analizy próbki

C oblicz współczynniki odpowiedzi trzech badanych

związków względem izooktanu (wzór 22). Pamiętaj, że dla izooktanu przyjmujemy

f = 1.

•

Oblicz masy analitów w próbce, korzystając z wyników analiz próbki

D (wzór 21).

Pamiętaj o wyznaczonych wcześniej współczynnikach odpowiedzi! Wyniki przedstaw

jako średnie arytmetyczne. Oblicz SE i RSE dla tych średnich. Jaki jest błąd analizy?

•

Porównaj wyniki z analiz próbki

D (metoda wzorca wewnętrznego) z wynikami

uzyskanymi przy zastosowaniu

metody dodatku wzorca. Z czego wynikają różnice w

uzyskanych wartościach? Która metoda daje Twoim zdaniem bardziej wiarygodne

wyniki i dlaczego?

5. Literatura

1. W. Szczepaniak, Metody instrumentalne w analizie chemicznej, PWN, Warszawa 2005

2. Z. Witkiewicz, J. Hepter, Chromatografia gazowa, WNT, Warszawa 2001

3. Z. Witkiewicz, Podstawy chromatografii, WNT, Warszawa 2005