Instrukcja do ćwiczenia:

Chromatografia kolumnowa

Kierunek: Biotechnologia studia I stopnia
Rok II
Przedmiot: Procesy rozdzielania i oczyszczania produktów biotechnologicznych – laboratorium
Opracował dr Tomasz Girek

Częstochowa 2008

INSTYTUT CHEMII I OCHRONY ŚRODOWISKA

WYDZIAŁ MATEMATYCZNO – PRZYRODNICZY
AKADEMIA im. JANA DŁUGOSZA

CZĘSTOCHOWA

1. Wprowadzenie

Chromatografia adsorpcyjna jest najstarszą metodą chromatograficzną. Wykorzystuje różnice w

adsorpcji związków chemicznie podobnych na powierzchni sproszkowanego i nasyconego
rozpuszczalnikiem adsorbentu.

Adsorbent nie może reagować z substancjami rozdzielanymi ani z rozpuszczalnikiem, musi być

nierozpuszczalny w danym rozpuszczalniku i wykazywać odpowiednią aktywność w wiązaniu
rozdzielanych substancji. Rozdział zależy od natury adsorbentu i rozpuszczalnika. Poniżej podano
najczęściej używane adsorbenty i rozpuszczalniki uporządkowane według wzrastającej aktywności:

Adsorbenty: sacharoza < skrobia < talk < węglan sodowy < węglan potasowy < węglan wapniowy <

fosforan wapniowy < węglan magnezowy < tlenek magnezowy < tlenek wapniowy < żel
krzemionkowy < krzemian magnezowy < tlenek glinowy < węgiel aktywny < ziemia Fullera.

Rozpuszczalniki: eter naftowy (benzyna lekka) < czterochlorek węgla < cykloheksan < dwusiarczek

węgla < eter etylowy < aceton < benzen < estry kwasów organicznych < chloroform < etanol < woda
(zależnie od pH i rozpuszczonych soli) < pirydyna < kwasy organiczne.

Najsilniej adsorbuje węgiel aktywny i ziemia Fullera, najsłabiej sacharoza i skrobia. Najlepiej

adsorbują się związki rozpuszczone w eterze naftowym, a najsłabiej w pirydynie, wodzie i
kwasach organicznych. Do elucji lepiej nadają się rozpuszczalniki polarne (etanol, woda, pirydyna)
niż niepolarne, takie jak eter naftowy czy chloroform.

W chromatografii adsorpcyjnej rozdział zależy od siły, z jaką dana substancja jest adsorbowana z

rozpuszczalnika otaczającego fazę stałą. Warunkiem uzyskania dobrego rozdziału jest równomierne
wypełnienie kolumny suchym i odpowiednio oczyszczonym adsorbentem oraz właściwe wymiary
kolumny. Najczęściej stosunek średnicy rurki szklanej do jej długości wynosi 1:20.

W trakcie sączenia badanego roztworu przez kolumnę substancje silniej adsorbowane przesuwają się
wolniej, a słabo adsorbowane — szybciej. W przypadku barwników roślinnych, na różnej
wysokości kolumny powstają barwne pasma odpowiadające poszczególnym barwnikom. W celu
lepszego rozdzielenia pasm kolumnę przemywa się tym samym rozpuszczalnikiem, albo innym o większej
sile wymywania, wskutek czego warstwy szybciej przesuwają się ku dołowi i lepiej się rozdzielają.

II. Cel i wykonanie ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest chromatograficzne rozdzielenie barwników roślinnych: chlorofilu, ksantofilu

i karotenu. W ramach ćwiczenia należy przygotować kolumnę do rozdziału chromatograficznego,
wyekstrahować barwniki z materiału roślinnego oraz przeprowadzić ich chromatograficzne rozdzielenie.

Przygotowanie kolumny chromatograficznej

Kolumnę chromatograficzną stanowi szklana rurka o średnicy 5 cm, długości 60 cm, zwężająca się u

dołu z kranem teflonowym.

1. Wprowadzić do kolumny małymi porcjami około 20 g skrobi kartoflanej, lekko ubijając przez

potrząsanie kolumną. Na górnej powierzchni skrobi położyć mały kłębek waty. Pozostawić u góry
około 5 cm wolnej przestrzeni.

2. Po napełnieniu umieścić kolumnę w uchwycie statywu, podstawić u dołu odbieralnik.
3. Wlewać małymi porcjami (ostrożnie, po ściance kolumny) 10 cm

3

heksanu, tak aby nie wzburzyć

powierzchni skrobi, pilnując, aby nad skrobią utrzymywała się stale około 0,5 cm warstewka płynu.
Przemywanie kolumny zakończyć w chwili, gdy nadmiar rozpuszczalnika zacznie wypływać u
dołu kolumny.

4. Nad górną powierzchnią skrobi musi pozostać 0,5 cm warstewka cieczy.

Przygotowanie wyciągu z liści

1. Około 2 g liści rozdrobnić w moździerzu.
2. Dodać 10 cm

3

mieszanki heksanu z metanolem (98% obj. eteru).

3. Przesączyć przez bibułę zwilżoną heksanem do czystej i suchej probówki.

Rozwijanie chromatogramu

1. Przesączony wyciąg z liści wprowadzić na kolumnę, zachowując 0,5 cm warstwę cieczy nad

powierzchnią skrobi.

2. Po wprowadzeniu całego wyciągu na kolumnę (około 15 min), dodać, wlewając małymi porcjami

po ściance, 15 cm

3

rozpuszczalnika składającego się z mieszaniny heksanu, metanolu i eteru

etylowego (odpowiednio: 93% obj., 2% obj. i 5% obj.).

3. Po 20 min otrzymuje się wyraźny rozdział barwników liścia w następującej kolejności:

ż

ółtozielony chlorofil b, który najsilniej adsorbuje się na skrobi,

niebieskozielony chlorofil a,
ż

ółty ksantofil,

karoten, który jako najsłabiej adsorbujący się na skrobi wypływa z kolumny.

Sprawozdanie

W sprawozdaniu zamieścić rysunek pokazujący uzyskany rozdział barwników roślinnych.