Created by Neevia Document Converter trial version

Miętkiewski, „Kurs fizjologii doświadczalnej”, rozdział 5 – „Krew” (fragmenty)

3 A Oznaczanie liczby krwinek czerwonych i białych za pomocą komory Bürkera

Mieszalniki Potaina służą do rozcieńczania krwi odpowiednim płynem, aby przez to ułatwić liczenie

krwinek, które nie rozcieńczone leżałyby za gęsto w polu widzenia.

Mieszalnik do krwinek czerwonych jest to grubościenna rurką włosowata z podziałkami 0,5 i 1, rozdęta

w banieczkę, zakończona krótszą rurką, na którą nakłada się wężyk z ustnikiem. Na tej rurce jest podziałka 101.
W banieczce znajduje się ruchoma szklana perełka. Objętość banieczki jest 100 razy większa od pojemności
kapilary do podziałki 1, a 200 razy większa od objętości kapilary do podziałki 0,5. Mieszalnik Potaina do
białych ciałek jest zbudowany analogicznie, tylko objętość banieczki jest 10-krotną objętością kapilary do
podziałki 1 i 20-krotną tejże do podziałki 0,5.

Płyn Hayema składa się z 0,25 g HgCl

2

+ 0,5 g NaCl + 2,5 g Na

2

SO

4

+ H

2

O od 100 ml służy do

rozcieńczania krwi w celu liczenia krwinek czerwonych. Może go zastąpić wodny roztwór 2 – 3 % NaCl (342,2
– 523,2 mmol/l); chodzi o to, żeby taki płyn nie wywoływał ubytku czerwonych krwinek przez hemolizę, nie
pozwalał na układanie się krwinek w ruloniki i nadawał im wyraźne zarysy.

Płyn Türka składa się z lodowatego kwasu octowego 3,0 ml + 1 % (10 g/l) roztworu filetu goryczki

1,0 ml + wody destylowanej do 100 ml. Służy on do rozcieńczania krwi w celu liczenia krwinek białych. Kwas
octowy hemolizuje erytrocyty, które by przeszkadzały w liczeniu leukocytów oraz powoduje pęcznienie jąder
krwinek białych, przez co komórki te staja się bardziej widoczne. Fiolet goryczki barwi jądra leukocytów na
niebiesko i czyni je wyraźniejszymi w polu widzenia.

Stolik Bürkera jest to prostokątna płytka szklana tak wyszlifowana, że w środku długości przebiega

przez nią w poprzek wąska płytka, która znów w środku swojej długości bywa przepołowiona rowkiem,
biegnącym równolegle do długiego boku stolika. Bo obu stronach bloczka biegną analogiczne do niego, ale nie
przepołowione i o 0,1 mm wyższe płytki. Po nasunięciu szkiełka nakrywkowego na płytki stolik zamienia się w
komorę o wysokości 0,1 mm. Na każdej połówce bloczka, po obu stronach rowka, znajduje się siatka Thoma lub
Bürkera.

Siatka Bürkera składa się z podwójnych linii oddalonych od siebie o 1/20 mm i przecinających się pod

kątem prostym. W miejsc tego przecięcia powstają najmniejsze kwadraty x, o boku 1/20 mm i powierzchni
1/400 mm

2

. Każda para linii jest oddzielona od drugiej pary o 1/5 mm. Między liniami podwójnymi są zawarte

duże kwadraty y, o boku 1/5 mm i powierzchni 1/25 mm

2

. Wreszcie ci pięć dużych kwadratów podwójne linie są

rozdzielone trzecią. W ten sposób powstają największe kwadraty, ograniczone liniami potrójnymi, a zawierające
po 16 średnich kwadratów y do liczenia krwinek białych i po 9 kwadratów najmniejszych x do liczenia krwinek
czerwonych.

(...)
Do jednego szkiełka zegarkowego nalewa się około 3 ml płynu Hayema lub 2 – 3 % roztworu NaCl, do

drugiego taką samą ilość płynu Türka.

Przed nakłuciem badany powinien umyć ręce w ciepłej wodzie, co przyczyni się nie tylko do ich

odkażenia, ale spowoduje czynne przekrwienie, a to z kolei ułatwi obfitszy wypływ krwi z miejsca nakłucia bez
niepożądanego wyciskania czy masowania palca. Pierwszą kroplę krwi ścieramy suchą i jałową watą, gdyż może
jeszcze zawierać resztki środka użytego do odkażenia skóry. Do następnej kropli przystawiamy wylot kapilary
mieszalnika, trzymanego poziomo w prawej ręce. Aspirując bardzo ostrożnie wciągamy krew do podziałki 0,5.
Gdy przewidujemy bardzo małą ilość krwinek czerwonych, wciągamy krew do podziałki 1. Koniec mieszalnika
wyciera się od zewnątrz i sprawdza, czy słupek krwi w kapilarze jest ciągły, czy nie zawiera pęcherzyków
powietrza oraz czy dokładnie sięga podziałki 0,5 lub 1. Gdy nieznacznie przewyższa podziałkę, odciągamy
nadmiar krwi przez lekkie dotykanie wylotu kapilary kawałkiem suchej ligniny lub waty. Bardzo ostrożnie
aspirując przez ustnik, zanurzamy wylot kapilary w płynie Hayema i aspirujemy nieco silniej, aby uzupełnić
wnętrze mieszalnika do podziałki 101, zmieniając powoli jego położenie z ukośnego na pionowe. Mieszalnik
chwytamy następnie tak, żeby kciuk zaciskał przez gumę załamanego wężyka górny, a palec środowy – dolny
jego wylot. Przez kilka minut należy ostrożnie potrząsać mieszalnikiem, żeby za pomocą ruchomej perełki
jednolicie wymieszać krew z płynem Hayema. Mieszalnik powinno się trzymać w palcach poziomo, a ruchy
wstrząsające wykonywać w kierunku pionowym.

Podobnie pobieramy krew do liczenia krwinek białych, z tą tylko różnicą, że używamy mieszalnika z

podziałkami 0,5, 1 i 11 i po nabraniu krwi do podziałki 1 dopełniamy go płynem Türka.

Na bardzo czysty stolik Bürkera nasuwamy szkiełko nakrywkowe w ten sposób, aby między nim a

bloczkiem powstał srebrzysty połysk lub pojedynczy barwny pierścień Newtona. Komorę kładziemy na stolik
mikroskopu i w małym powiększeniu oraz wąskiej przesłonie nastawiamy ostry obraz siatki. Po ponownym
wstrząśnięciu mieszalnika wypuszczamy 2 pierwsze krople, nie nadające się do liczenia, a następnie mała kroplę
umieszczamy na bloczku, tuż obok krawędzi szkiełka nakrywkowego. Krew wnika do komory siłą

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

włosowatości. Krwinki czerwone rozmieszczają się na siatce przeważnie równomiernie. Należy chwilę
zaczekać, aż krwinki opadną na no komory i ruch ich ustanie.

Krwinki czerwone liczymy w 80 małych kwadratach. Jeżeli liczba krwinek w poszczególnych

kwadratach jest bardzo różna, dalsze obliczanie jest bezcelowe, gdyż świadczy o niedokładnym wymieszaniu i
rozmieszczeniu krwi, co może być przyczyną bardzo dużego błędu. W tym wypadku trzeba doświadczenie
powtórzyć z większą dokładnością. Otrzymaną sumę dzielimy przez liczbę kwadratów, aby znaleźć średnią na
jeden kwadrat. Znaleźliśmy np. 480 krwinek w 80 kwadratach, wówczas w jednym kwadracie mamy średnio 6, a
w 1 ul krwi 4800000 krwinek czerwonych, gdyż 6 (średnia na 1 kwadrat) x 4000 (objętość) x 200
(rozcieńczenie) = 4800000 (4,8 T/l).

Aby unikać podwójnego liczenia niektórych krwinek, liczymy tylko te które leżą wewnątrz kwadratu,

nie dotykając żadnego boku i wszystkie, które dotykają lewego i górnego boku, choćby leżały poza tym
kwadratem. Nie liczmy natomiast krwinek, które dotykają prawego i dolnego boku, choćby leżały wewnątrz
kwadratu.

Krwinki białe liczymy tak samo, tylko we właściwych kwadratach, którym odpowiada objętość

1/250 mm3. Należy przeliczyć jak największą liczbę kwadratów, np. 125, a średnią pomnożyć 250, gdyż
objętość graniastosłupa o podstawie dużego kwadratu = 1/250 mm

3

oraz przez 10 lub 20, jak rozcieńczona była

krew w mieszalniku. Znaleźliśmy np. 375 białych krwinek w 125 dużych kwadratach, wtedy średnia na jeden
kwadrat wynosi 3. W 1 ul krwi mamy 7500 krwinek białych, gdyż 3 (średnia na kwadrat) x 250(objętość) x 10
(rozcieńczenie) = 7500 (7,5 G/l).

(...)

4 Oglądanie i liczenie krwinek płytkowych

Krwinki płytkowe, trombocyty albo płytki krwi Bizzozera, stanowią twory z większością cech żywej

komórki, które jednak nie mają jądra, bardzo łatwo zlepiają się i rozpadają. Są one przeciętnie 2 – 3 razy
mniejsze od krwinek czerwonych, płaskie, różnokształtne z wypustkami i silnie załamują światło. W krążącej
krwi mają zwykle kształt wrzecionowaty. Według niektórych autorów liczba płytek waha się od 700 do 800
tysięcy w 1 ul krwi. Najczęściej w klinikach stosowana metoda pośrednia obliczania płytek według Fonio daje
jednak wyniki daleko niższe (średnio 250 tys.), dopuszczając wahania od 130 do 350 tys. w 1 ul (130 – 350 G/l).

Płytki Bizzozera można oglądać w zabarwionym preparacie krwi oaz nie zabarwione we krwi

wynaczynionej albo w krążącej. Płytki krwi licz się bezpośrednio, podobnie jak krwinki białe lub czerwone albo
pośrednio – w zabarwionym preparacie odpowiednio przygotowanego rozmazu krwi.

Do oglądania płytek w nie zabarwionym preparacie krwi wynaczynionej potrzebne są: ostrza do

nakłuwania skory, bardzo dokładnie oczyszczone szkiełko podstawowe i nakrywkowe, bloczek parafinowy,
jałowy roztwór 14 % siarczanu magnezowego (567,9 mmol/l), klosz szklany lub zlewka, środek odkażający i
mikroskop.

Po zupełnym wyparowaniu lotnego środka odkażającego umieszcza się na opuszce palca kroplę

jałowego roztworu siarczan magnezu i poprzez nią nakłuwa się skorę. Wypływającą ze skaleczeni krew miesza
się z roztworem siarczanu magnezu, który w dużym stopniu przyczynia się do utrwalenia płytek krwi, chroni je
przed rozpadem i układaniem się w większe skupiska, a osocze przed skrzepnięciem. Nie mając pewności, czy
roztwór siarczanu magnezowego jest jałowy, nie wolno poprzez taką kroplę nakłuwać palca. Kroplę siarczanu
można też w tym wypadku od raz umieścić na bloczku parafinowym, a małą ilość krwi wypływającą z nakłucia
przenieść do tego roztworu i natychmiast dokładnie wymieszać pałeczką szklaną, powleczoną cienką warstewka
parafiny lub silikonu.

Kroplę krwi zmieszanej z siarczanem magnezowym puszczamy na czystą i gładka powierzchnię

bloczka parafinowego. Nakrywamy go odwróconą zlewką, pod którą kładziemy trochę waty moczonej w wodzie
w celu nawilgotnienia komory. Komorę chronioną przed parowaniem pozostawiamy przez 20 min, żeby na
górnej powierzchni zebrało się rozcieńczone osocze, zawierające większą liczbę płytek; cięższe bowiem
pozostałe elementy postaciowe krwi szybko opadają ku podstawie.

Wtedy ostrożnie dotyka się środkiem powierzchni szkiełka podstawowego górnej warstwy kropli.

Zebrany ślad osocz nakrywa się szkiełkiem nakrywkowym i ogląda przez mikroskop, nastawiając ostrość na
nieliczne erytrocyty, ułatwiające orientacje w polu widzenia. Większa liczba krwinek czerwonych jest w tym
preparacie niepożądana, gdyż zaciemnia pole widzenia utrudnia wyszukanie płytek krwi.

Aby policzyć krwinki płytkowe w sposób pośredni, należy najpierw przygotować rozmaz krwi

spływającej do kropli siarczanu magnezowego i dobrze wysuszyć go w powietrzu. Rozmaz barwi się nastepnie
według Pappenheima barwnikiem May-Grünwalda i Giemsy. Barwienie roztworem Giemsy trzeba jednak
prawie dwukrotnie przedłużyć, gdyż barwnik ten słabiej działa wobec siarczanu magnezowego.

Po ustaleniu liczby erytrocytów w sposób opisany w poprzednim rozdziale liczy się w zabarwionym

preparacie krwinki czerwone i płytki krwi przypadające na każde pole widzenia, używając okularu z przesłoną o
bardzo małym otworze. Wyniki zapisuje się w oddzielnych kolumnach, az liczba napotkanych erytrocytów

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

będzie wynosiła 1000, a zauważonych równocześnie krwinek płytkowych x. Znając stosunek liczby płytek do
erytrocytów oraz liczbę krwinek czerwonych w 1 ul łatwo już można obliczyć ile krwinek płytkowych przypada
na 1 ul krwi wziętej do badania.

Jeden ze sposobów bezpośredniego liczenia płytek krwi polega na tym, że w mieszalniku Potaina do

krwinek białych naciąga asie krew do podziałki 0,5 i do podziałki 11 uzupełnia płynem, który barwi płytki krwi,
rozpuszcza znaczną część krwinek czerwonych i zapobiega krzepnięciu, przez co umożliwia dalsze
postępowanie, opisane w rozdziale o liczeniu krwinek białych. Może to być np. płyn wersenianowy o składzie:
wersenianu sodowego 1,0, NaCl 0,7 i wody destylowanej – podbarwionej 1 kroplą alkoholowego roztworu
eozyny – do 100 ml.

5 Pomiar względnej objętości krwinek czerwonych hematokrytem Hedina i w heparynowanych rurkach nie
kalibrowanych

Odsetkową objętość zajmowaną we krwi przez erytrocyty można ustalić wirując nie krzepnącą krew w

kalibrowanych rurkach szklanych. Cięższe krwinki zgromadzą się w dalszym końcu rurki, a lżejsze osocze
pozostanie bliżej osi obrotu. Gdy cała rurka podzielona jest na równe 100 części, wystarczy po ukończonym
wirowaniu odczytać podziałkę na granicy między osoczem i krwinkami czerwonymi, aby mieć gotowy wynik
badania. Urządzenia do tego celu są różne, a nazywają się hematokrytami.

Hematokryt Hedina składa się z dwu grubościennych włosowatych rurek szklanych, podzielonych na

całej przestrzeni na 100 równych odcinków, które po napełnieniu krwią umieszcza się w oprawie pasującej o
wirówki i uniemożliwiającej wyciekanie krwi z rurek.

Na oczyszczonej opuszce palca umieszcza się odrobinę sproszkowanego szczawianu amonowego i

potasowego lub pozwala wyschnąć 1 kropli 4 % roztworu wersenianu sodowego (40 g / l) bądź 1 kropli 10-
krotnie rozcieńczonej heparyny, z którymi miesza się dużą kroplę krwi wydobywającą się po nakłuciu. Można
używać heparynowanej krwi żylnej lub krew z miejsca nakłucia wciągać do heparynowanych rurek
hematokrytowych.

Krew nabiera się siłą włosowatości do obu rurek pod podziałkę 100. Rurki osusza się od zewnątrz i

szczelnie umieszcza w oprawie kierując je zerowymi podziałkami na zewnątrz w stosunku do osi obrotu.

Można użyć heparynowanych rurek nie kalibrowanych, np. o wymiarach: długość 90 mm, średnica

zewnętrzna 5 mm, średnica wewnętrzna 0,5 mm. Wtedy z miejsca nakłucia krew wnika do pochylonej rurki na
przestrzeni około 70 mm. Nie napełniony krwią przeciwległy koniec rurki zakleja się szczelnie roztopionym
lakiem. Rurki takie po zabezpieczeniu przed stłuczeniem wiruje się w zwykłym naczyniu wirówkowym, np. w
ciągu 30 min z szybkością 4000 obr. / min. Wynik odczytuje się za pomocą specjalnego wykresu bądź też
zwykła podziałką milimetrową mierzy się długość słupków erytrocytów i osocza, obliczając, jaki procent całej
długości stanowią same erytrocyty.

Wyniki w dużej mierze zależą od warunków badania i w zasadzie można jest porównywać dokładnie

tylko wówczas, gdy zyskano je jednakową metodą przy równym czasie i szybkości wirowania. Zazwyczaj
wiruje się w ciągu 30 min, z szybkością 4000 obr. / min, z siła 2250 g. Wtedy wskaźnik hematokrytu waha się
od 40 do 48 % (0,4 – 0,48 l / l).

6 Hemoliza i określenie oporności krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych

W prawidłowych warunkach hemoglobina zawarta jest w krwinkach czerwonych. Ich zawiesina w

odpowiednim roztworze jest nieprzezroczysta, a po opadnięciu lub odwirowaniu krwinek roztwór pozostaje
bezbarwny. Czynniki niszczące budowę krwinek czerwonych lub uszkadzające ich półprzepuszczalną błonę,
powodują częściowe lub całkowite przemieszczenie hemoglobiny do roztworu, czyli hemolizę. Czynniki
hemolityczne można podzielić na fizyczne, chemiczne oraz biologiczne.

Krwinki czerwone można porównać z małym osmometrem, gdyż najbardziej zewnętrzna ich warstewka

jako błona półprzepuszczalna pozwala na przenikanie wody z otoczenia do krwinek i na odwrót, ale poza
wyjątkami nie przepuszcza ciał rozpuszczonych. Dlatego też jedynie w roztworach izotonicznych krwinki
czerwone nie zmieniają kształtów; w roztworach hipertonicznych natomiast kurczą się i przybierają wygląd
owocu morwy; w roztworach hipotonicznych pęcznieją, wydają się kuliste, większe, aż wreszcie pękają,
uwalniając hemoglobinę do roztworu, czyli ulęgają hemolizie.

Izotoniczny z krwią ludzką jest taki roztwór, który wywiera ciśnienie osmotyczne około 6,7 atmosfer i

powoduje obniżenie punktu zamarzania do –0,56

oC

(272, 59 K). Jednakże bywają roztwory izotoniczne, w

których krwinki czerwone pękają podobnie jak w wodzie destylowanej, gdyż ciało rozpuszczone może przenikać
do wnętrza krwinki: tu należy przede wszystkim roztwór mocznika, a także, choć w znacznie mniejszym
stopniu, roztwór glukozy.

Wreszcie rozcieranie krwi z piaskiem, podgrzewanie jej do temperatury powodującej topnienie lipidów

otoczki, naprzemienne zamrażanie i odmrażania, działanie promieni UV i innych o bardzo krótkiej fali oraz

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

elektryczność – należą do fizycznych czynników hemolitycznych. Krwinki czerwone w roztworze
fizjologicznym o wiele łatwiej podlegają hemolizie niż w osoczu lub surowicy. Niewątpliwie działają tu
ochronne koloidy osocza.

Z czynników chemicznych wymienić trzeba rozpuszczalniki ciał tłuszczowych, jak eter, chloroform,

benzyna, które rozpuszczają lipidowe składniki otoczki krwinek i przez to powodują hemolizę. Również kwasy i
zasady w odpowiednich stężeniach i temperaturze oraz kwasy żółciowe, lecytyna, mydła i saponiny wywołują
hemolizę, gdyż tak uszkadzają otoczkę, że hemoglobina może wydostawać się poza jej obręb.

Do czynników biologicznych należą ciała odpornościowe – hemolizyny, które występują we krwi

obcych gatunków jako heterohemolizyny lub nawet jako izohemolizyny we krwi tego samego gatunku.
Podobnie działają toksyny niektórych drobnoustrojów.

Podatność erytrocytów na działanie czynników hemolitycznych zależy od weku krwinek, młode są

bardziej wytrzymałe niż starsze. Dlatego też po znacznych krwotokach, kiedy duża liczba młodych krwinek
przenika z narządów krwiotwórczych do obiegu krwi, oporność jest większa. W innych stanach patologicznych,
np. w żółtaczce hemolitycznej, krwinki czerwone są bardzo mało oporne.

(...)

A Działanie różnych czynników hemolizujących

W statywie umieszcza się 7 suchych probówek, oznaczonych kolejnymi numerami. Za pomocą czystej i

suchej pipety nalewa się do każdej probówki odpowiednie ilości czynników hemolizujących. Po napełnieniu
wstrząsa się każdą próbówką kilkakrotnie, aby dokładnie wymieszać umieszczone w niej czynniki. Najwcześniej
po 15 min od napełnienia probówek należy ponownie zamieszać ich zawartość i zapoznać się z wynikiem,
oceniając go na oko i za pomocą mikroskopu.

Nie zhemolizowana rozcieńczona krew jest roztworem nieprzezroczystym, gdyż zawiesina krwinek

czerwonych, wypełnionych hemoglobiną rozprasza światło, nie przepuszczając promieni w przedłużeni linii ich
padania. Krew zhemolizowana jest czerwonym roztworem przezroczystym, gdyż uwolniona hemoglobina po
rozpadzie lub uszkodzeniu erytrocytów przechodzi do roztworu, a cienie krwinek nie zmieniają kierunku
promieni padających.

Aby stwierdzić zmiany mikroskopowe krwinek w powyższym doświadczeniu, przygotowuje się

preparaty zawiesiny erytrocytów w płynie hiper-, izo- i hipotonicznym, tzn. 5, 0, 0,9 i 0,6 % roztworze NaCl
(855,5, 154 i 102,6 mmol/l).

W pierwszym preparacie erytrocyty są mocno skurczone i maja kształt owocu morwy, gdyż dla

wyrównania różnicy stężeń tylko woda może przenikać przez półprzepuszczalną otoczkę z krwinek do roztworu.
Cząsteczki rozpuszczone nie mogą wnikać do wnętrza krwinki.

W drugim preparacie erytrocyty nie zmieniają kształtu ani wielkości, gdyż stężenie cząsteczek

rozpuszczonych w roztworze i wewnątrz krwinki jest jednakowe.

W trzecim preparacie erytrocyty są napęczniałe, powiększone i kuliste, a nawet częściowo już

zhemolizowane, gdyż dla wyrównania stężeń woda wnika do wnętrza krwinki, powodując zwiększenie jej
objętości i rozdęcie do formy kulistej. Cząsteczki znajdujące się w większym stężeniu w krwince nie mogą
przenikać przez półprzepuszczalną otoczką do roztworu hipotonicznego.

Nr Zawartość probówki

Zmiany makro- i mikroskopowe

Objaśnienia przyczyn i skutków

1

5 ml 5 % NaCl (855,5
mmol/l), 3 krople krwi

roztwór nieprzezroczysty, krwinki
mają kształt owocu morwy

w roztworze hipertonicznym krwinki oddają
wodę i kurczą się

2

5 ml 0,9 % NaCl (154
mmol/l), 3 krople krwi

roztwór nieprzezroczysty, krwinki
zachowują kształt prawidłowy

w roztworze izotonicznym krwinki nie
ulegają zmianom

3

5 ml 0,6 % NaCl (102,6
mmol/l), 3 krople krwi

roztwór nieprzezroczysty, krwinki
są napęczniałe, kuliste

w roztworze lekko hipotonicznym krwinki
pobierają wodę z otoczenia i pęcznieją, ale
jeszcze nie pękają

4

5 ml wody
destylowanej,
3 krople krwi

roztwór przezroczysty, widać
najwyżej cienie krwinek

w roztworze mocno hipotonicznym krwinki
nabrały tyle wody, że ich otoczka zupełnie
pękła i uległy zupełnej hemolizie

5

5 ml 0,9 % NaCl (154
mmol/l), 1 ml eteru lub
chloroformu, 3 krople
krwi

roztwór przezroczysty, krwinki
zhemolizowane

dodany do izotonicznego roztworu
rozpuszczalnik rozpuścił lipidową cześć
otoczki krwinek i spowodował hemolizę

6

5 ml 0,9 % NaCl (154
mmol/l), 3 ml digitoniny
2 % (20 g/l), 3 krople
krwi

roztwór przezroczysty, krwinki
zhemolizowane

digitonina (saponina) mimo izotoniczności
roztworu tworzy z cholesterolem otoczki
digitonid i powoduje hemolizę

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

7

5 ml 1,5 % roztworu
mocznika (249 mmol/l)
– izotoniczny, 3 krople
krwi

roztwór przezroczysty, krwinki
zhemolizowane

mocznik łatwo przenika do wnętrza krwinek
i, mimo że jego roztwór jest izotoniczny,
wywołuje hemolizę jak woda destylowana

B Oznaczanie oporności krwinek czerwonych na działanie roztworów hipotonicznych

W statywie umieszcza się 21 suchych, zaopatrzonych kolejnymi numerami stożkowatych probówek

wirówkowych. Do pipety z podziałkami co 0,01 ml nabiera się 1 ml 1 % roztworu soli kuchennej (171, 1
mmol/l). Do pierwszej probówki nalewa się 0,7 ml, a do 21. resztę, tj. 0,3 ml. Następny mililitr tego roztworu
dzieli się tak, że do probówki 2. wlewa się 0,68 ml, a do probówki 20. resztę, tj. 0,32. Postępując w analogiczny
sposób, nalewa się do każdej kolejnej probówki od początku szeregu o 0,02 ml mniej, a do każdej kolejnej
probówki od końca szeregu o 0,02 ml więcej niż do poprzedniej, aż do napełnienia wszystkich probówek. Z
kolei każdą probówkę z odmierzoną ilością roztworu NaCl dopełnia się wodą destylowana do objętości 1 ml,
postępując jak poprzednio, tylko w odwrotnej kolejności. W ten sposób przygotowuje się szereg rozcieńczeń soli
kuchennej od 0,7 % do 0,3 % (119 – 5 mmol/l) z przeskokami od próbówki poprzedniej do następnej o 0,02 %
NaCl (3,42 mmol/l).

Do każdej z tak przygotowanych probówek dodaje się 2 – 3 krople świeżo z żyły pobranej krwi albo

zawiesiny przemytach krwinek czerwonych, zmieszanych stosunku 1 : 5 z fizjologicznym roztworem NaCl.

Już po 15 min od chwili zmieszania krwi z roztworem można odczytać wynik, ale poleca się również

drugie odczytywanie po 2 godzinach. Przed odczytaniem wyniku powinno się poddać wszystkie próbówki
kilkunastominutowemu wirowaniu.

Odczytanie wyniku polega na znalezieni stężenia soli kuchennej w probówce, w której roztwór nad

opadłymi – nie zhemolizowanymi – krwinkami jest jeszcze bezbarwny. To najmniejsze stężenie roztworu, w
którym jeszcze nie wystąpiła hemoliza, stanowi minimalna granicę oporności, w warunkach prawidłowych
0,46 % NaCl (78,7 mmol/l), gdyż już w roztworze następnej próbówki o 0,02 % mniejszym stężeniu zaczyna się
właśnie hemoliza najmniej opornych krwinek.

Wreszcie odszukanie probówki, w której na dnie znajduje się najmniejszy osad krwinek czerwonych nie

zhemolizowanych oznacza granicę maksymalnej oporności, gdyż już w następnej probówce o stężeniu 0,02 %
mniejszym wszystkie krwinki uległy hemolizie i na dnie probówki nie dostrzega się żadnego osadu. Dokładniej
badanie to wykonuje się za pomocą zbuforowanych roztworów NaCl, gdy stopień hemolizy ocenia się
fotoelektryczne w płynie po odwirowaniu każdej probówki i wyraża się w procentach.

(...)

11 Ilościowe oznaczanie hemoglobiny

Ilość hemoglobiny można oznaczyć jedną z następujących metod: chemiczną, kolorymetryczną,

spektrofotometryczną, gazometryczną i refraktometryczną.

Metoda chemiczna polega na tym, że w odmierzonej objętości krwi określa się zawartość żelaza.

Uwzględniając znany fakt, że na 100 g Hb przypada 0,336 g Fe, ławo już obliczy się ilość Hb w badanej próbce,
a ostateczny wynik poda w g Hb / 100 ml badanej krwi. Metody tej nie stosuje się praktycznie w celach
klinicznych. Ma ona jednak ważne znaczenie jako dokładna metoda sporządzania wzorców do łatwiejszych
metod stosowanych praktyce.

Metody kolorymetryczne polegają na porównywaniu intensywności zabarwienia roztworu po

zhemolizowaniu badanej krwi z roztworem wzorcowym o znacznym stężeniu hemoglobiny. W tym celu można
porównywać niezmieniony chemicznie barwnik krwi w postaci hemoglobiny, oksyhemoglobiny lub
karboksyhemoglobiny badanej próbki z wzorcowymi roztworami odpowiednich postaci hemoglobiny.
Intensywność i właściwości zabarwienia są jednak wtedy w znacznej mierze zależne od stopnia utlenowania lub
wysycenia tlenkiem węgla.

Dlatego też zwykle porównuje się kolor hematyny, czyli oksyheminy uzyskanej z badanej krwi pod

wpływem kwasu solnego, z z wzorcowym roztworem kwaśnej hematyny, powstałej ze znanej ilości
hemoglobiny. W ten sposób kolorymetria staje się niezależna od stopnia utlenowania krwi użytej do badania,
gdyż zabarwienie kwaśnej hematyny jest już zależne tylko od ilości hemoglobiny w badanej próbce, a nie od
stopnia jej wysycenia tlenem. Poza tym wzorcowe roztwory kwaśnej hematyny są o wiele bardziej trwałe niż
roztwory nie zmienionej hemoglobiny, zawierającej białko i żelazo dwuwartościowe. Ostatnio stosuje się w tym
celu cyjanometemoglobinę.

Metoda gazometryczna polega na tym, że próbkę krwi całkowicie uprzednio nasyconą tlenem pozbawia

się w próżni pochłoniętego tlenu, którego objętość dokładnie mierzy się odpowiednimi przyrządami. Biorąc pod
uwagę, że 1 g Hb wiąże – a więc może też uwolnić – 1,34 ml O2, można ze znanej ilości uwolnionego tlenu
obliczyć ilość wiążącej go hemoglobiny i określić ją w g / 100 ml badanej krwi.

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

Metoda fotometryczna, elektrofotometryczna lub spektrofotometryczna polega na tym, że światło o

danej długości fali przepuszcza się przez roztwór badanej krwi o znanej grubości warstwy i ustala się, jaka
różnica powstała między siła światła padającego a przepuszczonego, czyli ile światła zostało pochłonięte przez
roztwór hemoglobiny lub barwnika z niej powstałego. Można to określić na oko lub bardzo dokładnie zmierzyć
za pomocą odpowiednich fotometrów elektrycznych.

Znając długość fali użytego światła, grubość warstwy roztworu badanej krwi, przez którą światło

przechodzi oraz stopień ekstynkcji lub przepuszczalności światła w tym przypadku i stałą ich zależność od
stężenia barwnika wzorcowego bardzo dokładnie i łatwo możemy już obliczyć, jakie jest stężenie Hb w
badanym roztworze, a tym samym – jaka jest jej wartość w 100 ml badanej krwi.

Metoda refraktometryczna polega na pomiarze współczynnika załamywania światła w roztworze

przygotowanym z badanej krwi. Znając zależność między tym współczynnikiem a stężeniem hemoglobiny w
roztworze można obliczyć stężenie, a przez to ilość hemoglobiny w badanej próbce krwi.

W klinikach wystarczają przeważnie prostsze metody kolorymetryczne, dające wprawdzie wynik z

błędem około ± 5 %, ale za to szybkie i łatwe do wykonania. Na tej zasadzie opiera się najczęściej stosowna
metoda Sahliego. Odmierzoną ilość krwi miesza się z kwasem solnym, aby hemoglobiną przemienić w kwaśną
hematynę, którą porównuje się kolorymetrycznie z odpowiednimi wzorcami. Obecnie najczęściej oznacza się
ilość hemoglobiny na podstawie fotoelektrycznego określenia stężenia jej pochodnej cyjanowodorowej – metodą
Drabkina.

A Metoda Sahliego

Aparat Sahliego składa się z oprawki, w której przed matową szybką stoją dwa zworce barwne.

Zabarwienie wzorców odpowiada barwie kwaśnej hematyny, tj. chlorohemicy uzyskanej z krwi człowieka o
prawidłowej zawartości hemoglobiny rozcieńczonej 0,1 M kwasem solnym (100 mmol/l) w stosunku 1 : 100.
Sahli uważał za prawidłową krew, która zawiera 17,3 Hb w 100 ml. Między te wzorce wstawia się
wykalibrowaną próbówkę pomiarową.

Pierwotne hematokryty miały rurki pomiarowe z jedną podziałką w stopniach Sahliego. Kontrolne

badania wykazały jednak, że większość zdrowych ludzi w naszych warunkach geograficznych nie osiąga 100

o

Sahliego. Wprowadzono przeto drugą podziałkę, a mianowicie w procentach w stosunki do normy. Norma ta
wynosi dla mężczyzn 16, a dla kobiet 14,4 g Hb / 100 ml krwi (9,93 i 8,93 mmol/l). Wreszcie bywają rurki
pomiarowe z podziałką bezpośrednio w gramach hemoglobiny / 100 ml krwi.

Z jaką skalą mamy do czynienia, można się zorientować po tym, że podziałka wyrażona małymi

liczbami (do 24) oznacza gramy Hb w 100 ml. Spośród dwóch skal wyrażonych liczbami ponad 100, ta jest
podziałką procentową, która ma większe liczby, a skalą Sahliego jest ta, której liczby są mniejsze i podziałka 80
odpowiada podziałce 100 na poprzedniej skali, zatem 16 g = 100 % = 80

o

Sahliego (obecnie rzadko stosowane).

Zwykła pipetką nalewa się 0,1 M kwasu solnego (100 mmol/l) do podziałki 10 w środkowej rurce

hemoglobinometru Sahliego. W miarową pipetkę tego aparatu naciąga się 20 ul krwi z nakłutej opuszki palca,
jak opisano przy liczeniu krwinek. Pipetkę wyciera się z ewentualnych śladów krwi na zewnątrz i sprawdza, czy
nieprzerwany słupek krwi w kapilarze sięga dokładnie do podziałki 20. Ewentualny nadmiar krwi w pipetce
obciąga się przez wylotu bibuła filtracyjną lub watą. Wylot pipetki wprowadza się pod powierzchnię kwasu w
próbówce pomiarowej i ostrożnie wydmuchuje się krew, która opada na dno. Kwasem nie zmieszanym jeszcze z
krwią przemywa się wnętrze pipetki przez dwukrotne naciągnięcie do podziałki 20 i ponowne wydmuchnięcie
do probówki.

Mniej więcej przez minutę potrząsa się probówką wyjęta ze statywu, aż krew dobrze zmiesza się z

kwasem, ulegnie hemolizie, a hemoglobina przejdzie w kwaśną hematynę, tzn. aż powstanie roztwór
ciemnobrunatny i przejrzysty. Jeżeli krew częściowo skrzepnie i w roztworze widzi się zawiesiną grudek
skrzepu, doświadczenia trzeba powtórzyć, oczyściwszy przedtem przyrządy. Mieszając następnie zawartość
probówki szklana pałeczką, dolewa się kroplami wodę destylowana tak długo, aż kolory badanego roztworu i
wzorców dokładnie się zrównają. Należy uważać, aby szklanym pręcikiem do mieszania nie wynieść poza
probówkę ani kropli płynu. W tym celu wskazane jest albo nie wysuwać go całkowicie z rurki albo dokładnie
wycierać o wewnętrzne jej ścianki.

Całe doświadczenie trzeba tak wykonywać, aby wynik był odczytany po upływie 3 minut od momentu

zmieszania krwi z kwasem. Pomiar powinien być wykonany przy świetle dziennym. Cyfry podziałek na
probówce pomiarowej powinny być zwrócone na boki, a więc do roztworów barwnych, aby nie przeszkadzały w
polu widzenia.

Metoda Sahliego jest obciążona licznymi błędami. Dlatego też wszystkie laboratoria dysponujące już

fotokolorymetrami stosują jedną z metod elektrofotometrycznych, najczęściej cyjnomethemoglobinową metodę
Drabkina.

B Metoda Drabkina

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

Do małej probówki z korkiem, np. fiolki po penicylinie, odmierza się 5 ml odczynnika Drabkina, który

zawiera 0,305 g żelazicyjanku potasowego, 1,0 g kwaśnego węglanu sodowego i 0,05 g cyjanku potasowego w
jednym litrze wody. Do tego dodaje się 0,02 ml krwi, zamyka korkiem, miesza i czeka przynajmniej 5 minut, aż
z hemoglobiny wytworzy się cyjanomethemoglobina. Wtedy spektrofotometrycznie mierzy się ekstynkcję przy
długości fali 540 nm, uwzględniając analogiczny pomiar próby zerowej, czyli z odczynnikami bez próbki krwi.
Podstawiając znalezione wartości do wykresu kalibracyjnego lub też do wzoru razem z ekstynkcją wzorcowego
roztworu cyjanomethemoglobiny, znajduje się g % Hb w badanej krwi.

(...)

C Obliczanie wskaźnika barwnego

Ustalenie wskaźnika barwnego krwi – WB – pozwala zorientować się ile hemoglobiny w stosunku do

normy zawierają poszczególne krwinki czerwone. Wskaźnik poucza czy mamy niedokrwistość nadbarwiliwą
czy niedobarwliwą. Prawidłowa krew zawiera prawidłową liczbą krwinek czerwonych i prawidłową ilość
hemoglobiny, czyli każda krwinka zawiera prawidłową ilość hemoglobiny. Wskaźnik takiej krwi, jako stosunek
normy do normy wynosi 1.
WB = 100 % tj. norma Hb ( u mężczyzny 16 g / 100 ml, czyli 9,93 mmol/l) / 100 % tj. norma krwinek (u
mężczyzny 5 mln / 1 ul, czyli 5 T / l) albo (100 % Hb = 100) / (2 x 50 = 100) = 1

Wskaźnik ten znajduje się, dzieląc procentową zawartość hemoglobiny w badanej krwi przez liczbą

otrzymaną z podwojenia pierwszych dwóch cyfr liczby oznaczającej ilość krwinek czerwonych w 1 ul tej krwi.

Gdy indeks jest większy od jedności, to poszczególne krwinki czerwone mają za dużo Hb

(hyperchromia), a gdy jest mniejszy od jedności, to ilość Hb w pojedynczych krwinkach czerwonych jest za
mała (hipochromia). Wartości prawidłowe WB mieszczą się w granicach 0,85 – 1,15.

(...)

12 Oznaczanie czasu krwawienia

Odstęp czasu między sztucznie wywołanym małym skaleczeniem skóry a ustaniem krwawienia z tego

miejsca nazywamy czasem krwawienia. Prawidłowy czas krwawienia waha się od 2 do 6 minut. Czas ten zależy
od krzepliwości krwi, jednak w większym jeszcze stopniu od właściwości naczyń krwionośnych oraz liczby i
cech czynnościowych krwinek płytkowych.

Czas krwawienia przedłuża się w następujących przypadkach: niedobór witaminy C, toksyczne lub

zakaźna uszkodzenie ściany naczyń krwionośnych, niedostateczna szybkość krzepnięcia krwi oraz zmniejszona
liczba płytek krwi albo upośledzona ich czynność.

Czas krwawienia można oznaczyć za pomocą bibuły filtracyjnej. Odkażoną opuszka palca nakłuwa się

jałowym ostrze na głębokość około 3 mm. Notuje się czas nakłucia. Następnie co 30 s dotyka się bibułą
filtracyjną miejsca krwawiącego. Ślady krwawe na bibule, gdy każde dotknięcie zaznaczone jest w oddzielnym
miejscu, stają się coraz słabsze, aż wreszcie bibuła przestaje się barwić. Ten moment oznacza koniec
krwawienia.

13 Oznaczanie czasu krzepnięcia

Czas krzepnięcia, czyli odstęp czasu od chwili wynaczynienia krwi do momentu ej skrzepnięcia, można

oznaczyć wieloma metodami. Podając wynik trzeba dodać, jaką metodą i w jakiej temperaturze został
osiągnięty, gdyż różne metody dają rozmaite wielkości czasu krzepnięcia. Pełną wartość porównawczą mają
tylko wyniku uzyskane jedną metodą w jednakowych warunkach pomiaru.

A Metoda Vierordta

Oczyszczoną opuszka palca nakłuwa się, notuje czas i wyciera pierwszą kroplę krwi. Do następnej

dostawiamy jeden koniec poziomo trzymanej rurki, do której krew wnika na przestrzeni 0,5 do 2 cm. Przez drugi
koniec rurki wprowadza się włos, który po upływie 3 min zaczyna się przesuwać przez słupek krwi, pociągając
go w jednym kierunku co 15 s zawsze w kilka milimetrów. Obserwujemy, kiedy na włosie dadzą się zauważyć
czerwone plamki, pochodzące od krzepnącej krwi i kiedy znów przestaną się pojawiać. Te momenty oznaczają
początek i koniec krzepnięcia, a czas od chwili pojawienia się krwi na opuszce palca do początku krzepnięcia
oznacza czas krzepnięcia.

B Metoda kroplowa

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

Na środku wklęsłej powierzchni jednego szkiełka zegarkowego daje się dużą kroplę krwi i przykrywa

się drugim szkiełkiem odwróconym wypukłością ku górze. Obydwa szkiełka trzyma w płaszczyźnie poziomej
między kciukiem a palcem wskazującym. Następnie ostrożnie przechyla się szkiełka w kierunku płaszczyzny
pionowej i wraca do poziomu. Te ruchy wykonuje się zwykle co 30 s, poczynając od czwartej minuty po
wynaczynieniu krwi. Początkowo nie przyczepiona jeszcze do podstawy kropla krwi ślizga się po szkiełku
podczas pochylania w kierunku działania siły ciężkości. W pewnej chwili przestaje się ślizgać, gdyż wydzielone
pierwsze nitki włóknika przyczepiają krew do podstawy. Jest to początek krzepnięcia. Wreszcie po pewnym
czasie kropla nie tylko nie posuwa się ku dołowi w pionowym ustawieniu szkiełek, ale też nie odkształca się
więcej w postaci zwisającego woreczka. Jest to chwila oznaczająca koniec krzepnięcia.

(...)

15 Oznaczanie szybkości opadania krwinek (odczyn Biernackiego, OB)

Szybkość rozdzielania się nie krzepnącej krwi na górną warstwę osocza i dolną, zawierającą składniki

postaciowe, jest w warunkach prawidłowych stała. Zrozumiałe jest, że cięższe krwinki czerwone (ciężar
właściwy 1,090) zawieszone w osoczu o znacznie mniejszym ciężarze właściwym (1,027), pozostające w
spokoju poza organizmem, musza pod działaniem siły ciężkości opadać i oddzielać się od osocza. Objaśnienia
wymaga jednak fakt, że krwinki opadają szybciej, niżby się tego można spodziewać, uwzględniając tylko silę
ciążenia działającą na pojedyncze komórki w osoczu. Według takiego rozumowania erytrocyty powinny opadać
z prędkością około 0,2 mm / h. W rzeczywistości opadają jednak szybciej, gdyż układają się w różnej wielkości
zespoły, co znane jest pod nazwą agregacji. Szybkość opadania krwinek zależy przeto od tego, jak łatwo i w jak
wielkie zespoły układają się erytrocyty. Jeżeli agregacja prowadzi do powstawania zlepów po 10 komórek, to
krwinki opadają z prędkością 1 mm / h. W przypadku powstawania zlepów, z których każdy zawiera około
50 000 erytrocytów, prędkość sedymentacji zwiększa się do 75 mm / h.

Ogólnie mówiąc, przyspieszenie sedymentacji powodują: zwiększenie zdolności agregacyjnej krwinek

czerwonych, zmniejszenie ich liczby oraz zwiększenie frakcji globulinowej w stosunku do albuminowej w
osoczu i wzrost lepkości. Wydaje się, że najważniejszą przyczyną zmian sedymentacji jest stosunek globulin do
albumin w osoczu. Gdy globuliny zyskują przewagę, zmniejsza się ładunek elektryczny krwinek czerwonych i
zwiększa sie ich zdolność zlepna, a przez to zwiększa się szybkość sedymentacji i na odwrót. Oznaczenie tej
szybkości jest przeto prostą metodą, pozwalającą wnioskować o zmianach, jakie zachodzą w osoczu podczas
wielu stanów patologicznych.

Fizjologiczne przyspieszenie sedymentacji występuje po obfitych posiłkach, po gorących kąpielach, w

czasie miesiączkowania i w ciąży; szybkość opadania jest najmniejsza u noworodków; jest ona również mniejsza
rano niż po południu.

W stanach chorobowych przyspieszenie sedymentacji powodują: nowotwory złośliwe, kiła, gościec

stawowy, gruźlica i inne choroby zakaźne oraz procesy zapalne, niedokrwistość złośliwa, przewlekłe zatrucie
morfiną i inne. Zwolnienie sedymentacji wytęp uje w pewnych chorobach wątroby, wskutek nadużycia chininy i
w niektórych stanach uczulenia.

Ze względu na ilość krwi konieczną do oznaczenia szybkości opadania rozróżniamy metody makro i

mikro. W pierwszych konieczne jest pobranie krwi przez nakłucie żyły, w drugich wystarcza ilość krwi, jaką
możemy uzyskać przez nakłucie opuszki palca u dorosłych lub pięty u małych dzieci.

A Pobierane krwi przez nakłucie żyły

W celu pobrania krwi z żyły przygotowuje się strzykawkę ,kilka igieł do wstrzyknięć dożylnych i

szczypczyki anatomiczne wyjałowione przez gotowanie co najmniej 15 minut w wodzie destylowanej albo w
autoklawie pod ciśnieniem 2 atm.

Obnażone ramię podpiera się tak, aby zgięcie łokciowe zwrócone było ku górze. Przedramię powinno

być wyprostowane, a pięść zaciśnięta. Dookoła ramienia zakłada się opaskę w celu wywarcia ucisku większego
niż ciśnienie w żyłach, ale mniejszego niż ciśnienie skurczowe w tętnicach. W ten sposób zamyka się odpływ
krwi żylnej, a pozostawia swobodny dopływ krwi tętniczej, wskutek czego żyły nabrzmiewają i łatwo mogą być
nakłute.

Ostrze igły kieruje się w stronę najlepiej widocznej lub wyczuwalnej żyły w przegubie łokciowym.

Miejsce to trzeba przedtem dokładnie oczyścić watą zwilżoną w eterze lub alkoholu. Gdy wyschnie środek
odkażający, igłę wkłuwa się w miejsce gdzie żyła jest najlepiej wypełniona. Po przebiciu skóry tak nachyla się
strzykawkę, aby igła przebiegała równolegle do podłużnej osi żyły i jednym ruchem przekłuwa się przednią
ścianę żyły, wsuwając do niej igłę na mała głębokość w kierunku dosercowym. Ostrożnie przekłada się teraz
strzykawkę w lewą rękę, opartą o nakłuwane przedramię, a prawa delikatnie cofa się tłok strzykawki, aby
upewnić się, czy koniec igły tkwi w żyle, co objawia się napływem krwi do strzykawki. W ten sposób można
naciągnąć do strzykawki pożądaną ilość krwi, zwolnić ucisk na ramieniu, przyłożyć jałowy tamponik z gazy lub

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

waty zwilżonej w alkoholu tuż nad miejscem nakłucia i znów jednym ruchem wyciągnąć igłę z żyły. Przez kilka
minut należy lekko przyciskać miejsce nakłucia tamponikiem lub nałożyć mały opatrunek z elastycznego
przylepca.

Podobnie wykonuje się wstrzyknięcia dożylne, z ta tylko różnicą, że przed nakłuciem wypełnia się

strzykawkę i igłę odpowiednim płynem, tak aby nie było w nich powietrza. Po zaaspirowaniu krwi zdejmuje się
opaskę uciskową i powoli wtłacza płyn do żyły.

Na ćwiczeniach z fizjologii studenci powinni najpierw wykonać nakłucie żyły brzeżnej małżowiny

usznej u królika lub żyły odpiszczelowej psa i wstrzyknąć dożylnie fizjologiczny roztwór NaCl. Nakłuwania
żyły u człowieka musi z pełna odpowiedzialnością dopilnować asystent lekarz.

B Metoda Westergrena

Aparat Westergrena składa się ze statywu i rurek pomiarowych. Rurka szklana długości 30 cm i

średnicy wewnętrznej 2,5 mm jest od dołu zaopatrzona w podziałkę milimetrową na przestrzeni 20 cm w ten
sposób, że ostatnia dolna kreska podziałki = 200, a pierwsza górna = 0.

Rurkę napełnioną od dołu aż do podziałki o mieszaniną 4 części krwi i 1 części 3,8 % cytrynianu

sodowego ustawia się pionowo na środku gumowego korka tkwiącego w podstawie statywu. Na górny wylot
rurki nakłada się sprężynowy zacisk statywu, tak aby rurka ściśle przylegała dolnym wylotem do gumowej
podstawki, co uniemożliwi wylewanie się krwi. W badaniach seryjnych 1,6 ml krwi z każdej strzykawki wlewa
się najpierw do oddzielnej próbówki z 0,4 ml roztworu cytrynianu. Po skończeniu pobierania krwi zawartość
każdej probówki ponownie miesza się i naciąga przez aspirację do pipet Westergrena.

Po upływie jednej godziny odczytuje się wartość słupa przezroczystego osocza nad nieprzerwaną

warstwą krwinek. Wielkość ta oznacza szukaną szybkość sedymentacji. Klinicznie ważny jest także wynik
odczytany po 2 h, jak również wskaźnik obliczony z wyniku po pierwszej i drugiej godzinie.

C Metody mikro

W przypadku gdy pobranie krwi z żył napotyka trudności, musimy wykonać OB z krwi pobranej przez

nakłucie opuszki palca jedną z metod mikro.

Aparat mikrosedymentacyjny składa się ze statywu, rurek pomiarowych, małych próbówek i ustnika z

wężykiem. Rurka o średnicy wewnętrznej 1 mm i długości 15 cm jest zaopatrzona na całej długości w
milimetrową podziałkę, a po napełnieniu krwią może być ustawiona pionowo na statywie jak w aparacie
Westergrena.

Do małego naczyńka nalewa się 5 % roztwór cytrynianu sodowego (169 mmol/l). Na górny koniec

rurki sedymentacyjnej nakłada się wężyk zakończony ustnikiem. Aspirując przez ustnik naciąga się cytrynian w
rurkę do podziałki 3 cm i wdmuchuje go do małej próbówki należącej do aparatu.

Dolny koniec poziomo trzymanej rurki dostawia się do dużej kropli krwi na opuszce nakłutego palca,

aby naciągnąć krwi do podziałki 12 cm. Dla uniknięcia skrzepu trzeba krew natychmiast wydmuchać do
probówki, w której zmiesza się z cytrynianem w stosunku 1 : 5. Tej mieszanki nabiera się teraz w rurkę do
podziałki 100 i ustawia w statywie. Wynik odczytany po pierwszej i drugiej godzinie zgadza się z wielkościami,
jakie daje powszechnie używana metodę Westergrena, gdy prędkość opadania nie jest większa niż 30 mm / h.

Używając najczęściej stosowanej metody Westergrena lub innych metod dających zgodnie z niż wyniki,

przyjmuje się jako prawidłową wartość sedymentacji następujące wartości: po 1 h u noworodków 1 – 2 mm, u
mężczyzn 2 – 6 mm, u kobiet 3 – 10 mm. Średnią szybkość opadania znajdziemy, jeśli do wartości odczytanej
po pierwszej godzinie dodamy pół ogólnej wartości po 2 godzinach sumę tę podzielimy przez 2. Ta wielkość
wynosi dla kobiet 2 – 8, a dla mężczyzn 2 – 4 mm.

(...)

17 Oznaczanie grup krwi

(...)
Istnieją różne metody oznaczania grup krwi. Najczęściej stosuje się metodę, w której używa się surowic

wzorcowych. Jedna z nich zawiera tylko aglutyniny alfa, czyli anty-A, druga natomiast beta, czyli anty-B.

Do osobnych kropli surowic wzorcowych dodaje się badanych krwinek w postaci 5 % zawiesiny

(50 ml / l) uzyskanej przez 20-krotne rozcieńczenie izotonicznym roztworem cytrynianu sodowego i obserwuje
się, w której z wzorcowych badane krwinki uległy aglutynacji, aby na tej podstawie ocenić, do jakiej musiały
należeć grupy.

Jeżeli aglutynacja nie wystąpi w surowicy beta, czyli anty-B, ani w surowicy alfa, czyli anty-A, tzn. że

badane krwinki nie zawierają antygenu A ani antygenu B, badana krew należy więc do grupy 0.

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

Jeżeli aglutynacja wystąpi tylko w surowicy alfa, czyli anty-A, badane krwinki zawierają jedynie

antygen A, a więc badana krew należy do grupy A.

Jeżeli aglutynacja nastąpi tylko w surowicy zawierającej aglutyninę beta, czyli anty-B, to badane

krwinki mają jedynie antygen B, a więc krew tak należy do grupy B.

Jeżeli aglutynacja nastąpi zarówno w surowicy anty-B, jak i w surowicy anty-A, tzn. że badane krwinki

musiały zawierać antygen A i B, a więc krew taka należ do grupy AB.

Dla kontroli można używać surowicy grupy 0 zawierającej aglutyninę alfa i beta.
Surowice do oznaczania grup krwi kupuje się zazwyczaj gotowe, chociaż można je sporządzić samemu

z krwi osób z znanej grupie. Powinny one być świeże, zawarte w jałowych i hermetycznie zamkniętych
naczyniach, a miano ich nie powinno być mniejsze niż 1 : 32, tzn. że rozcieńczone nawet 32 razy powinny
jeszcze aglutynować 5 % zawiesinę krwinek odpowiedniej grupy (50 ml / l). Surowice te przechowuje się w
pomieszczeniach ciemnych i w temperaturze ok. + 5

oC

.

A Oznaczanie grup krwi za pomocą surowic wzorcowych na szkiełku podstawowym

Szkiełko podstawowe umieszcza się na białym podkładzie. Na środek szkiełka wlewa się kroplę

surowicy wzorcowej 0 (alfa + beta), bliżej jednego końca umieszcza się kroplę wzorcowej surowicy beta, a
bliżej drugiego końca kroplę surowicy wzorcowej alfa. Do szkiełka zegarkowego nalewa się roztworu
cytrynianu sodowego. Nakłuwa się opuszkę palca, aby w mieszalnik Potaina nabrać badanej krwi do podziałki
0,5 i uzupełnić cytrynianem do podziałki 11. Po wymieszaniu usuwa się 2 pierwsze krople z mieszalnika.
Następnie do każdej z 3 kropel surowic wzorcowych daje się po kropli zawiesiny badanej krwi z mieszalnika.
Pałeczką szklaną lub narożnikiem szkiełka podstawowego mieszamy zawiesinę krwi z kroplą surowicy,
rozpościerając ją na przestrzeni o średnicy około 15 mm. Szkiełko podstawowe chwyta się za długie krawędzie i
kołysząc nim obserwuje się aglutynację, która powinna wystąpić przed upływem 5 minut. Dla kontroli ogląda się
każdą kroplę przez szkło powiększające lub mikroskop i według powyższego opisu znajduje się, do jakiej grupy
należała badana krew.

Aglutynacja prawdziwa, czyli zachodząca pod wpływem aglutynin, polaga na bezładnym zlepianiu się

krwinek w różnej wielkości grudki i odznacza się dużą trwałością.

Czasami po liku minutach od chwili zmieszania badanej krwi z surowicą wzorcową wystepuje pseudo

aglutynacja, czyli aglutynacja pozorna, zwana również agregacją, czyli odbywa się bez udziału aglutynin, a
polega na układaniu się krwinek czerwonych w ruloniki. Makroskopowo dostrzega się w badanej krwi
równomierną i drobną ziarnistość agregacji, widoczną przez warstwę przejrzystej cieczy. Ziarnistość tego typu
jest nietrwała, gdyż wymieszanie przez wstrząśnięcie szkiełkiem, szczególnie po dodaniu fizjologicznego
roztworu soli, prowadzi do ponownego pojawienia się równomiernej i nieprzejrzystej zawiesiny.

W odróżnieni od agregacji gruba ziarnistość prawdziwej aglutynacji utrzymuje się pomimo prób

mieszania lub rozcieńczania fizjologicznym roztworem soli.

Opisany sposób oznaczania grup krwi za pomocą surowic wzorcowych można też wykonać bez użycia

mieszalnika Potaina i cytrynianu sodowego do rozcieńczania krwi. Narożnik szkiełka podstawowego zanurza się
w kropli krwi wypływającej z ranki na opuszce palca. Przyczepioną do szkiełka małą ilość krwi przenosi się do
kropli jednej z surowic wzorcowych, umieszczonych jak poprzednio na szkiełku podstawowym. Mieszając
narożnikiem szkiełka podstawowego, otrzymuje się równomierną zawiesinę badanej krwi w surowicy
wzorcowej. W ten sposób przenosi się drugim narożnikiem szkiełka podstawowego badaną krew do drugiej
kropli surowicy wzorcowej i obserwuje się, gdzie wystąpi aglutynacja.

Należ koniecznie przestrzegać, aby w tych wszystkich czynnościach nie przenieść nawet śladów

kurwicy z jednej kropli do drugiej, a więc przede wszystkim nie mieszać tym samym przedmiotem najpierw
jednej, a potem drugiej kropli i bardzo czysto myć szkło laboratoryjne.

Dokładniejsze wyniki oznaczania grup krwi za pomocą surowic wzorcowych uzyskuje się wykonując

badania nie w jednej kropli na szkiełku podstawowym, ale w nieco większej ilości surowic w małych
probówkach. W miarę potrzeby próby kontrolne prowadzi się w cieplarce o temperaturze 37

oC

.

B Próba zgodności krwi biorcy i dawcy bez posługiwania się izoaglutyninami wzorcowymi

Kiedy nie ma surowic wzorcowych zawierających znane izoaglutyniny i nie można przygotować ich we

własnym zakresie, można w inny sposób zorientować się, czy krew proponowanego dawcy będzie dobrze
znoszona przez biorcę, czy też przetoczenie wykonać nie wolno, dopóki nie znajdzie się odpowiedniego dawcy.

W tym celu na środek szkiełka podstawowego z wyszlifowanym zagłębieniem opuszcza się kroplę

wody destylowanej, z która miesza się dokładnie krople biorcy. Gdy nastąpi hemoliza, dodaje się kroplę
cytrynianu sodowego. W ten sposób otrzymuje się płyn zawierający izohemaglutyniny biorcy. Narożnikiem
szkiełka podstawowego przenosi się do tego płynu kroplę krwi proponowanego dawcy. Po dokładnym
wymieszaniu obserwuje się, czy wystąpi aglutynacja krwinek dawcy pod wpływem aglutynin krwi biorcy. Na

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com

drugim szkiełku wykonuje się tę samą próbę w odwrotnym porządku, tzn. do zhemolizowanej kropli krwi
proponowanego dawcy dodaje się kroplę krwi biorcy. Jest to bardzo uproszczona próba krzyżowa; gdy jej wynik
jes pozytywny, nie wolno przetaczać krwi od tego dawcy, lecz dobrać innego, z którego krwią próba krzyżowa
wypadnie negatywnie.

Właściwą próbę krzyżową wykonuje się dokładniej. Nie używa się krwi zhemolizowanej i krwi pełnej,

lecz w obu częściach próby stosuje się osocze krwi dawcy lub biorcy, z którym miesza się 5 % zawiesinę
krwinek dawcy lub biorcy (50 ml / l), sporządzoną w 0,9 % roztworze NaCl (154 mmol/l) lub w odpowiednim
roztworze koloidalnym, a wynik odczytuje się po 30 min inkubacji w temperaturze 37

oC

.

Błędne oznaczanie grup krwi może wynikać nie tylko z pomylenia aglutynacji prawdziwej z pozorną i

na odwrót, ale również z powodu pojawienia się nieswoistej aglutynacji i autoaglutynacji.

Aglutynacja nieswoista zachodzi wtedy, gdy badana krew jes dano pobrana zanieczyszczona

drobnoustrojami, które mają właściwość takiego zmieninia antygenów w krwinkach że aglutynują z każdą
surowicą (zjawisko Thomsena).

Autoaglutynacja występuje w temperaturze od 0 do + 5

oC

i jest wywołana autoprzeciwciałami, które nie

mogą działać, gdy badania wykonuje się w temperaturze pokojowej.

W oznaczaniu grup krwi nie należy posługiwać się hemolizynami, gdyż hemoliza w temperaturze

pokojowej jest mniej wyraźna i wymaga oprócz hemolizyn także dopełniacza hemolitycznego. Surowice
wzorcowe do oznaczanie grup krwi pozbawia się dopełniacza przez podgrzewanie ich w ciągu 30 min do
temperatury + 55

oC

. W żywym organizmie natomiast w przypadku przetoczenia krwi nieodpowiedniej grupy

występuje przede wszystkim hemoliza obok aglutynacji.

C Znaczenie czynnika Rh

(...)
Oprócz zgodności grupowej dawcy z biorcą w zakresie układu AB0 trzeba również zapewnić zgodność

pod względem antygenu Rh.

Ponieważ nie mamy surowicy anty-Rh jako izoprzeciwciał normalnych, musimy posiłkować się

surowicami odpornościowymi. Samo badanie odbywa się już zasadniczo w sposób podobny jak w oznaczeniu
grup układu AB0.

Ze względu jednak na to, że przeciwciała anty-Rh należą do tzw. przeciwciał niekompletnych, badanie

należy prowadzić za pomocą wzorcowych surowic z dodatkiem odpowiedniego enzymu proteolitycznego, np.
papainy aktywowanej cysteiną. Przeciwciała niekompletne nie mają bezpośredniego dostępu do antygenów w
nie przygotowanej specjalnie otoczce krwinek czerwonych. Z tego powodu wzorcową surowicę anty-Rh miesza
się najpierw z równą objętością papainy aktywowanej cysteiną, a dalsze postępowanie jest już podobne do
opisanego przy oznaczaniu grup AB0.

Created by Neevia Document Converter trial version

http://www.neevia.com