Transkrypcja i rola RNA w komórce

1. Zasada transkrypcji z DNA do RNA

2. Transkrypcja u bakterii i operon

3. RNA eukariontów

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów

5. Usuwanie intronów

6. Alternatywne składanie egzonów

7. Degradacja RNA

8. Wyciszanie RNA

9. Transportowanie RNA

1. Zasada transkrypcji z DNA do RNA

Transkrypcja, czyli syntetyzowanie mRNA na matrycy DNA, polega zawsze na

dodawaniu rybonukleotydów przez polimeraz

ę

RNA do ko

ń

ca 3’ syntetyzowanej nici

1.

Zasada transkrypcji z DNA do RNA

W czasie transkrypcji nici DNA rozdzielaj

ą

si

ę

na stosunkowo krótkim odcinku: jedna ni

ć

jest czynna jako matryca (template) a druga bierna. Nawet gdy geny le

żą

blisko siebie,

to nie zawsze ta sama ni

ć

jest czynna, co sprawia,

ż

e kierunek przesuwania si

ę

polimerazy RNA wzd

ł

u

ż

chromosomu jest ró

ż

ny w ró

ż

nych genach

2.

Transkrypcja u bakterii -

inicjacja

Na transkrypcj

ę

sk

ł

adaj

ą

si

ę

trzy etapy:

- inicjacja: polimeraza RNA rozpoznaje promotory czyli odcinki DNA zawieraj

ą

ce

specyficzne sekwencje; u E.coli około 35 zasad przed pocz

ą

tkiem transkrypcji wyst

ę

puje

sekwencja TTGACAT, a około10 zasad przed tym pocz

ą

tkiem sekwencja TATAAT

2. Transkrypcja u bakterii

- elongacja: dodawanie nukleotydów
z wykorzystaniem energii
zgromadzonej w dostarczanych do tej
reakcji nukleotydów z trójfosforanem

;

jeden gen mo

ż

e by

ć

odczytywany

przez wiele kompleksów polimerazy
RNA na raz, dlatego produkcja mRNA
mo

ż

e by

ć

obfita

... co wi

ę

cej, do nieuko

ń

czonych

ła

ń

cuchów RNA doczepiaj

ą

si

ę

rybosomy i rozpoczyna si

ę

translacja;

w ten sposób z jednego odcinka DNA
powstaje od razu wiele polipeptydów
(w genach gdzie transkrypcja jest
intensywna)

2. Transkrypcja u bakterii

- terminacja, zale

ż

y cz

ę

sto od sekwencji DNA, która le

ż

y za genem; typow

ą

przyczyn

ą

terminacji u E. coli jest taka sekwencja DNA, która

transkrybowana na mRNA powoduje,

ż

e tworzy ono p

ę

tle b

ę

d

ą

ce sygna

ł

em

dla polimerazy RNA by od

łą

czy

ć

si

ę

od DNA

2. Transkrypcja u bakterii

Obróbka zsyntetyzowanego bakteryjnego RNA jest mało intensywna.
Bakteryjny mRNA nie jest modyfikowany, nadaje si

ę

od razu do translacji.

Natomiast bakteryjne rRNA (wchodzi w skład rybosomów) i tRNA
(transportuj

ą

cy) wchodz

ą

w skład długich pre-RNA, które s

ą

potem ci

ę

te

przez specyficzne rybonukleazy (w przykładzie M5, M16, M23)

2. Transkrypcja u bakterii
- operon.

- ekspresja stała
(konstytutywna) wyst

ę

puje

w przypadku wielu genów,
których produkty s

ą

zawsze

potrzebne w komórce (na
rycinie obok stale jest
produkowane białko
represora słu

żą

ce

normalnie do wyciszenia
operonu laktozy)

-ekspresja indukowana:
(a) operon laktozy -
regulacja negatywna –
normalnie wył

ą

czony,

obecno

ść

laktozy go

uruchamia

2. Transkrypcja u bakterii -
operon

- ekspresja indukowana:

operon tryptofanu - regulacja
pozytywna – normalnie
czynny, obfito

ść

tryptofanu

go unieczynnia

3. RNA eukariontów

W komórkach eukariontów s

ą

trzy polimerazy RNA, ka

ż

da transkrybuje inne rodzaje RNA

mRNA – transkrypty genów daj

ą

cych bialka (protein coding RNA)

tRNA – transport aminokwasów do rybosomu
rRNA – rybosomalne RNA, komponent rybosomów, stanowi 80% całego RNA w komórce
snRNA – small nuclear RNA, bior

ą

udział w przycinaniu pre-mRNA do dojrzałego mRNA

snoRNA – w j

ą

derku, uczestnicz

ą

w dojrzewaniu rRNA

miRNA – mikro RNA – małe cz

ą

steczki RNA, reguluj

ą

ekspresj

ę

indywidualnych genów

siRNA – short interfering RNA, reguluj

ą

ekspresj

ę

indywidualnych genów

3. RNA eukariontów

mRNA, czyli informacja z genów koduj

ą

cych to bardzo mała cz

ęść

RNA, ogromna

wi

ę

kszo

ść

to RNA funkcjonuj

ą

ca w ró

ż

nych procesach (głównie translacji). RNA

eukariontów jest znacznie bardziej zró

ż

nicowane ni

ż

RNA prokariontów

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów

Ka

ż

da z polimeraz RNA ma swoje typowe promotory

W dalszej cz

ęś

ci wykładu zajmiemy si

ę

głównie polimeraz

ą

RNA II bo jej aktywno

ść

ma zwi

ą

zek z regulacj

ą

ekspresji genów.

W wi

ę

kszej odleg

ł

o

ś

ci od

promotora (tysi

ą

ce bp) mog

ą

le

ż

e

ć

inne sekwencje DNA podnosz

ą

ce

(enhancers) lub obni

ż

aj

ą

ce

(silencers) prawdopodobie

ń

stwo

utworzenia kompleksu
transkrypcyjnego – s

ą

to odleg

ł

e

(distant) elementy typu cis.

W dowolnych miejscach genomu
(inne chromosomy) le

żą

geny

koduj

ą

ce bia

ł

ka, które w

łą

czaj

ą

si

ę

w kompleks transkrypcyjny – s

ą

to

bia

ł

ka regulatorowe typu trans.

Bia

ł

ka

łą

cz

ą

si

ę

z polimeraz

ą

RNA

i s

ą

oplatane nici

ą

DNA. Jest to

kompleks transkrypcyjny, którego

ł

atwo

ść

tworzenia, czyli

intensywno

ść

transkrypcji, mo

ż

e

by

ć

precyzyjnie regulowana

poprzez zmiany we wszystkich
elementach.

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów
Transkrypt eukariotycznego mRNA jest modyfikowany poprzez dodanie czapeczki (cap)
i ogonka (tail).

Czapeczka to zmetylowany GTP (guanozynotrójfosforan) dodawany przed pierwszy

rybonukleotyd transkryptu (czyli na jego ko

ń

cu 5’). Nast

ę

puje to gdy transkrypt ma

zaledwie 30 nukleotydów.

W terminalnej cz

ęś

ci transkryptu znajduje si

ę

sekwencja 5’-AAUAAA-3’ (czyli w DNA jest

to 3’-TTATTT-5’). Ta sekwencja transkryptu jest sygnałem do ci

ę

cia i

dodania ci

ą

gu około 250 adenin jako ogona w odległo

ś

ci około 20 nukleotydów za

sekwencj

ą

5’-AAUAAA-3’ (czyli na ko

ń

cu 3’ transkryptu)

4. Regulacja transkrypcji u eukariontów

Poliadenylacja ma wpływ na terminacj

ę

transkrypcji. Do kompleksu polimerazy II

doczepione jest białko CPSF. Gdy w transkrypcie pojawi si

ę

sekwencja poli(A), CPSF

przenosi si

ę

na t

ę

sekwencj

ę

transkryptu, co jest sygnałem do rozwi

ą

zania kompleksu

polimerazy.

5. Usuwanie intronów

5. Usuwanie intronów

Znaczna wi

ę

kszo

ść

intronów zaczyna si

ę

od 5’-GU-3’ a ko

ń

czy na 5’-AG-3’. S

ą

to miejsca

ci

ę

cia (splice sites). U wy

ż

szych eukariontów cz

ę

sto wyst

ę

puje te

ż

odcinek

polipirymidynowy. Te sekwencje maj

ą

swoj

ą

rol

ę

w procesie usuwania intronów.

5. Usuwanie intronów

W ogólnym zarysie, wycinanie
intronów rozpoczyna si

ę

od

tego,

ż

e grupa hydroksylowa

jednej z adenin w

ś

rodku

intronu doprowadza do rozbicia
wi

ą

zania fosforanowego przed

pierwszym nukleotydem intronu
(5’-G). W drugim etapie, grupa
hydroksylowa (3’-OH) z
ko

ń

ca poprzedzaj

ą

cego egzonu

doprowadza do rozbicia
wi

ą

zania fosforanowego

za ostatni

ą

zasada intronu (G-

3’). Egzony si

ę

ł

ą

cz

ą

, intron

ulega degradacji.

Operacja ta jest katalizowana
przez zespół snRNA, z których
ka

ż

dy jest poł

ą

czony z białkiem

(tutaj oznaczone 1-6). Tworz

ą

one razem spliceosome.

6. Aternatywne składanie egzonów (alternative spiling)

Wyci

ę

cie wszystkich egzonów prowadziłoby do powstania zawsze takiego samego

ko

ń

cowego mRNA.

U eukariontów cz

ę

ste jest jednak wycinanie niektórych egzonów przy okazji wycinania

intronów. Jest to alternatywne składanie egzonów, z jednego genu powstaj

ą

rózne mRNA!

6. Aternatywne składanie egzonów

Regulacja alternatywnego składania jest słabo poznana, ale wiadomo,

ż

e jego efekty mog

ą

by

ć

wa

ż

ne funkcjonalnie. U ludzi wyst

ę

puje gen slo koduj

ą

cy białko reguluj

ą

ce przepływ

jonów potasu prze błon

ę

komórkow

ą

. Ma on 35 egzonów, z których 8 (na zielono) mog

ą

wyst

ę

powa

ć

lub nie w ró

ż

nych kombinacjach. Znanych jest około 500 alternatywnych form

tego białka.

Gen slo jest aktywny w uchu wewn

ę

trznym, w otoczeniu włosów słuchowych. Alternatywne

aktywno

ś

ci form kodowanego przez niego białka daj

ą

wra

ż

liwo

ść

na ró

ż

ne cz

ę

stotliwo

ś

ci fal

d

ź

wi

ę

kowych, od 20 do 20.000 Hz.

7. Degradacja RNA

Czas

ż

ycia mRNA liczy si

ę

od

minut w bakteriach do godzin u
ssaków. Usuni

ę

cie mRNA

zapobiega powstawaniu białka,
tym samym mo

ż

e by

ć

elementem

regulacji ekspresji genów. Istnieje
kilka sposobów usuwania
wewn

ą

trzkomórkowego DNA.

Jednym z lepiej poznanych
mechanizmów (deanylation
dependent decapping) wymaga by
najpierw usuni

ę

ty został ogon

poli(A) a potem czapeczka
metyloguaniny. Ogon staje si

ę

dost

ę

pny dla egzonukleaz, gdy

odł

ą

cz

ą

si

ę

białka, które normalnie

go stabilizuj

ą

. Koniec 5’ staje si

ę

dost

ę

pny dla egzonukleazy gdy

czapeczka nie zwi

ąż

e si

ę

z

białkami stymuluj

ą

cymi translacj

ę

.

8. Wyciszanie RNA (RNA
silencing)

Eukarionty potrafia rozpozna

ć

i

usun

ąć

obce RNA z komórki,

jest to zabezpieczenie przed
np. retrowirusami. W
przeciwie

ń

stwie do mRNA, RNA

wirusów jest dwuniciowe
(cho

ć

by przej

ś

ciowo).

Rybonukleaza Dicer tnie
dwuniciowe RNA na kawałki po
21-28 nukleotydów nazywane
siRNA (short interfering RNA).
Najciekawsze jest to,

ż

e siRNA

jest rozdzielane na pojedyncze
nici i wtedy mo

ż

e odszuka

ć

komplementarne mRNA wirusa,
który zd

ąż

ył ju

ż

si

ę

namno

ż

y

ć

.

Te odcinki dwuniciowe
przywołuj

ą

kompleks białkowy

RISC, który rozkłada tak
wyznakowany RNA. Inwazja
wirusa jest powstrzymana.

8. Wyciszanie RNA (RNA silencing)
Bardzo podobne systemy s

ą

u

ż

ywane do selektywnego usuwania własnego mRNA. W

ró

ż

nych miejscach w genomie kodowane s

ą

krótkie odcinki RNA, które daj

ą

podwójna ni

ć

po transkrypcji (bo maj

ą

odwrócone powtórzenia). Sa one ci

ę

te przez Dicer a powstałe

jednoniciowe RNA okazuje si

ę

komplementarne do mRNA komórki, np. w odcinku

terminalnym mRNA nie podlegaj

ą

cym translacji. mRNA z doł

ą

czonymi miRNA jest

usuwane z komórki. Coraz wi

ę

cej miRNA jest znajdowane w genomach eukariontów.

Nasuwa si

ę

podejrzenie,

ż

e taka regulacja ekspresji jest cz

ę

sta i wa

ż

na. Biotechnolodzy

wykorzystuj

ą

to do wyciszenia aktywno

ś

ci genów bez przeprowadzania ich delecji!

9. Transportowanie RNA

RNA wydostaje si

ę

na zewn

ą

trz

j

ą

dra na drodze aktywnego

transportu poprzez kanały w
błonie j

ą

drowej. W transporcie

uczestnicz

ą

białka karioferyny

(ro

ż

ne dla ró

ż

nych rodzajów

RNA) i zu

ż

ywana jest energia

(hydroliza GTP).

Niektóre rodzaje RNA, takie jak
snRNA i snoRNA wydostaj

ą

si

ę

na zewn

ą

trz j

ą

dra ł

ą

cz

ą

w

kompleksy z odpowiednimi
białkami i takie połaczone
cz

ą

steczki wracaj

ą

do j

ą

dra

gdzie uczestnicz

ą

w

przekształcaniu/dojrzewaniu
j

ą

drowego RNA.