Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

PRODUKCJA BIOMASY CZ. 2

Melasa jest odciekiem pokrystalicznym, produktem ubocznym w procesie produkcji cukru. Przy przerobie buraków ilość
melasy stanowi około 4% ich masy. Melasa buraczana zawiera tę część cukru, która w normalnym procesie technologicznym
nie daje się odzyskać (wykrystalizować) w sposób ekonomiczny. Pod tym względem istotny dla cukrowników jest
współczynnik czystości melasy, który wynosi zwykle około 60. W skład melasy wchodzą cukry i wszystkie substancje
niecukrowe nie usunięte wraz z wysłodkami i szlamem defekacyjnym, podczas produkcji cukru. Jest cieczą ciemnobrunatną,
bardzo gęstą (1,35 g/cm

3

) o swoistym zapachu (z wyczuwalnym aromatem karmelu), słodką o gorzkim posmaku. Skład

chemiczny melasy zależy od gatunku buraków, warunków gruntowych i klimatycznych ich wegetacji, a także od rodzaju
procesu technologicznego produkcji cukru.

Tabela 1 Skład chemiczny melasy

Składnik

Zawartość w melasie [%]
Buraczanym Trzcinowym

Sucha substancja
Sacharoza
Cukry redukujące
Rafinoza
Popiół węglanowy
Kwasy bezazotowe
Aminokwasy
Azot ogólny

80,0
50,0
0,3
0,5
8,6
4,5
5,5
1,7

80,0
38,4
20,0 1,6
7,5
3,0
1,0
0,5

Najcenniejszym z cukrów melasy jest sacharoza ze względu na jej ilość i dobrą przyswajalność przez drożdże. Znajduje się tu
także trójcukier – rafinoza w ilości 2%. Enzymy drożdżowe rozkładają rafinozę na fruktozę i melibiozę (glukoza +
galaktoza). Ta ostatnia nie jest przyswajalna przez drożdże. Oprócz tych dwóch cukrów melasa zawiera niewielkie ilości
cukru inwertowanego.
Jako surowiec melasa wykorzystywana jest do produkcji:

-

drożdży piekarskich

-

drożdży paszowych

-

alkoholu w gorzelnictwie przemysłowym

-

kwasów organicznych — kwas cytrynowy, kwas mlekowy

-

butanolu, acetonu

-

innych substancji, np. witamin.

Melasa rozcieńczona wodą nazywa się w gorzelnictwie brzeczką. Fermentacja melasy nierozcieńczonej nie jest
możliwa, ponieważ w melasie jest zbyt duże stężenie cukrów i soli nieorganicznych. Melasa odznacza się także dużą
zawartością substancji niecukrowych, które są inhibitorami wzrostu drożdży; utrudniają one ich rozmnażanie i hamują
procesy fermentacyjne. Z tych też powodów fermentację przy produkcji spirytusu prowadzi się w rozcieńczonych
roztworach melasy. Najlepsze warunki dla rozmnażania drożdży występują wtedy, gdy melasa jest rozcieńczona
dziesięciokrotnie, a nawet trzydziestokrotnie, do gęstości 2 – 4

0

Blg. Przez odpowiednią adaptację niektórych szczepów

drożdży otrzymano rasy rozmnażające się również w trudnych warunkach, tj. w brzeczkach melasowych o gęstości
nawet 25

0

Blg. Jednym z czynników hamujących wzrost drożdży przy niższych stężeniach jest alkohol etylowy, który

już w stężeniu 0,7% może mieć ujemny wpływ na rozmnażanie komórek. Przy fermentacji alkoholowej ujemny wpływ
wywiera na drożdże zwiększona zawartość w surowcu kwasów lotnych (ponad 2%).

Rodzaje areometrów

Areometry służą do pomiaru gęstości cieczy lub stężenia ciekłego roztworu i działają na zasadzie prawa Archimedesa i prawa
ciążenia. Jest to szklany, pionowy pływak, składający się z części rozszerzonej, obciążonej rtęcią lub ołowiem oraz z tzw.
trzpienia, na którym naniesiona jest skala. Podziałka wyskalowana jest w jednostkach gęstości (densymetr) lub w procentach
stężenia danej substancji (alkoholomierz, sacharymetr, solomierz itp.).

Areometr został wynaleziony prawdopodobnie już w starożytności. Nowożytnym wynalazcą areometru był Baumé, który
1786 roku zbudował areometr do pomiaru gęstości i wprowadził umowną skalę, tzw. skalę Baumégo.
Zastosowanie areometru do pomiaru stężenia roztworu jest główną zasługą Gay-Lussaca, który zbudował alkoholomierz.

Areometr Ballinga (°Blg) i Brixa (°Brix)

Areometry te nazywane są cukromierzami i ich wskazania odnoszą się do wodnego roztworu sacharozy. W środowiskach
wodnych zawierających obok sacharozy i inne cukry lub związki, np. kwasy organiczne, sole mineralne, garbniki — wskazania
cukromierza są obarczone błędem. Błąd pomiaru będzie tym większy, im więcej różni się ciężar właściwy substancji
towarzyszącej sacharozie od ciężaru właściwego sacharozy. W świeżych zacierach, moszczach, brzeczce piwnej i melasie,
wskazania areometru Ballinga niewiele się różnią od rzeczywistej zawartości suchej masy w badanym środowisku. Wynika to
z tego, że ciężary właściwe różnych cukrów prostych i złożonych nieznacznie różnią się od ciężaru właściwego sacharozy.

Obecność w roztworze alkoholu etylowego lub innych związków lotnych, których ciężar właściwy jest znacznie mniejszy od
ciężaru właściwego sacharozy, zmniejsza istotnie wynik pomiaru. Gęstość alkoholu etylowego jest w przybliżeniu dwa razy
mniejsza niż gęstość cukru.

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

Zakres pomiaru przy pomocy areometru Ballinga wynosi 1–1,4 g/cm

3

, a skala ma podziałkę od 0

0

do 80

0

. Głębokość

zanurzenia się areometru w wodzie destylowanej o temp. 20

0

C oznaczono kreską „0”, a głębokość zanurzenia w 10 %

wodnym roztworze sacharozy o temp. 20

0

C, oznaczono kreską „10”. Odległość między kreskami dzielimy na 10

części, z których każda kreska oznacza 1 % sacharozy albo 1

0

Blg albo 1

0

Brix

Areometr Trallesa i Richtera (alkoholomierz)
Podaje w czystych roztworach wodnych stężenie alkoholu etylowego w procentach objętościowych.
1

0

Trallesa (1

0

T.A.) odpowiada stężeniu 1 % obj. etanolu.

Zakres pomiaru areometru Trallesa wynosi od 1 do 0,729 g/cm

3

.

Mogą być także stosowane alkoholomierze Richtera, które podają stężenie alkoholu w procentach wagowych.
Głębokość zanurzenia się areometru w wodzie destylowanej o temp. 20

0

C oznaczono kreską „0”, a głębokość

zanurzenia się w czystym alkoholu (temp. 20

0

C), oznaczono kreską „100”. Ponieważ ciężar właściwy alkoholu jest

mniejszy od jedności, wobec tego kreska „0” znajduje się w dolnej części trzpienia, a kreska „100” w górnej części.
Odległość między kreską „0”, a kreską 100 ustalamy praktycznie, gdyż zmiany gęstości nie są proporcjonalne do
zmian zawartości alkoholu.

Wykonanie ćwiczenia

I. Produkcja biomasy - tlenowa i beztlenowa hodowla drożdży

1. Przygotowanie gęstwy drożdżowej
Z kostki drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae pobrać jałową łyżeczką 15g sprasowanych drożdży i
przenieść ilościowo do kolby 50 cm

3

– zalewając 50ml jałowej wody destylowanej. Całość dokładnie wymieszać.

2. Nastaw na hodowlę biomasy drożdży

- Przygotować jałową kolbę o pojemności 250/300 cm

3

, zawierającą 100ml podłoża hodowlanego o składzie:

melasa rozcieńczona do zawartości sacharozy 10% jałową wodą destylowaną z dodatkiem 0,85g (NH

4

)

2

SO

4

i

0,12g (NH

4

)

2

HPO

4

na każde 100ml podłoża.

Aby odpowiednio rozcieńczyć melasę trzeba najpierw oznaczyć w niej poziom sacharozy!!!

- W tak przygotowanym podłożu doprowadzić pH do wartości ok. 5,0 za pomocą 5N NaOH lub 10N H

2

SO

4

(kwas lub zasadę dodawać bardzo powoli – kroplami cały czas kontrolując pH).

- Kolbę zaszczepić drożdżami Saccharomyces cerevisiae (5ml gęstwy).
- Kolbę zatkać korkiem z waty, zważyć, oznaczyć poziom cieczy i inkubować w temperaturze ok. 30

0

C przez

tydzień.

3. Nastaw fermentacji

- Przygotować kolbę o pojemności 250/300 cm

3

zawierającą:

· 170ml podłoża hodowlanego o składzie: sok owocowy (klarowny) o 20% zawartości sacharozy (oznaczyć

poziom sacharozy i w razie potrzeby sok dosłodzić odpowiednią ilością cukru),

· 0,85g (NH

4

)

2

SO

4

i 0,12g (NH

4

)

2

HPO

4

na każde 100ml podłoża,

- W tak przygotowanym podłożu doprowadzić pH do wartości ok. 5,0 za pomocą 5N NaOH lub 10N H

2

SO

4

.

(kwas lub zasadę dodawać bardzo powoli – kroplami cały czas kontrolując pH).

- Oznaczyć ekstrakt w hodowli.

Niewielką ilość pożywki (ok. 30-40ml) wlać do cylindra szklanego i powoli włożyć cukromierz (aerometr Ballinga). Po 1-2 minutach
odczytać i zapisać wartość ze skali. Po pomiarze pożywkę wlać do kolby.

- Kolbę zaszczepić drożdżami Saccharomyces cerevisiae (5ml gęstwy).
- Kolbę zważyć, oznaczyć poziom cieczy, zamknąć szczelnie korkiem zaopatrzonym w rurkę fermentacyjną

wypełnioną wodą wapienną i inkubować w temperaturze 25-30

0

C przez 2 tygodnie.

4. Oznaczenie zawartości sacharozy w melasie
- przygotowanie roztworu podstawowego melasy 1: 4

Do suchej zlewki odważyć 10g wymieszanej melasy. Mieszając dolewać powoli ok. 40ml wody destylowanej.

(w razie potrzeby roztwór delikatnie podgrzać, aż do całkowitego rozpuszczenia kryształków cukru, a następnie schłodzić w zimnej
wodzie do temperatury ok. 20

0

C).

Uzupełnić naczynie wodą destylowaną do łącznej masy roztworu 50g.
Odważyć 25g roztworu podstawowego melasy 1:4 w kolbce miarowej o pojemności 50cm

3

, dodać kolejno po

5ml płynów Herlesa I i II, mieszając próbę po każdej dawce, zawartość kolby dopełnić do kreski wodą

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

destylowaną. Wymieszać starannie otrzymany roztwór i przesączyć (sączek z bibuły filtracyjnej). W przesączu
oznaczyć stężenie sacharozy poniższymi metodami.

- pomiar metodą areometryczną

Roztwór sacharozy (ok. 30/40ml) wlać do cylindra szklanego i powoli włożyć cukromierz (areometr Ballinga).
Po 1-2 minutach odczytać wskazania cukromierza.

(roztworu nie wylewać zachować do kolejnych oznaczeń)

- pomiar w refraktometrze

Pomiar wykonujemy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury.
W tym celu podnosimy osłonę pryzmatu, pipetą nanosimy ok. 1 ml roztworu sacharozy tak, aby zamykając
osłonę ciecz równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę
odczytujemy wynik.

(skala po lewej stronie w

0

Brix, skala po prawej stronie

0

T.A.)

Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie płuczemy pod bieżącą wodą i wycieramy delikatnie do sucha
papierowym ręcznikiem.

- pomiar w polarymetrze (sacharymetrze)

Rurkę polarymetryczną o długości 200mm przepłukać, a następnie dokładnie napełnić przesączem (pozbyć się
pęcherzyków powietrza). Następnie umieszczamy rurkę w polarymetrze i odczytujemy wynik.
Zawartość sacharozy (%) obliczyć ze wzoru:

[ ]

L

C

*

*

*

=

20
0

2

100

a

a

a - odczyt ze skali sacharymetru
L – długość rurki [dm]

[ ]

20
0

a

= 66

0

- skręcalność właściwa sacharozy, tj. kąt o jaki następuje skręcenie płaszczyzny polaryzacji światła przez roztwór

sacharozy o stężeniu 100g w 100 cm

3

roztworu, w rurce o długości 1 dm, przy użyciu światła żółtego, w temperaturze 20ºC.

5. Oznaczenie ilości komórek
Określić liczbę komórek w 1ml hodowli biomasy drożdży. Komórki liczymy pod mikroskopem w komorze
Thoma. W razie konieczności wykonujemy 10-krotne rozcieńczenie hodowli w płynie fizjologicznym.
Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i rozcieńczeniu (n), zawartość komórek (L) w 1ml wynosi:

L = 4 x 10

6

x a x n [jtk/ml]

II. Opracowanie wyników

Opis wykonanych doświadczeń oraz uzyskane wyniki należy zamieścić w sprawozdaniu.
Można skorzystać z tabeli:

Przed inkubacją

Po inkubacji

Waga kolbek [g]
Liczba komórek [w 1 cm

3

]

Zawartość sacharozy [%]
Stężenie białka [

mg/ml]

-

III. Materiały do ćwiczeń, które zapewnia student !!!!

- drożdże piekarskie (drożdże w kostce), lub winne (płyn),

- klarowny sok owocowy (200ml)

IV. Zagadnienia teoretyczne

- surowce wykorzystywane w przemyśle fermentacyjnym
- metody oznaczania zawartości sacharozy

- rodzaje areometrów

V. Literatura

1. Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne; Wyd. PWN, Warszawa; 1998.
2. Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
3. Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000