Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

PRODUKCJA BIOMASY CZ. 4

Przemysł fermentacyjny dostarcza na rynek duże ilości wyrobów takich jak: wino, piwo i spirytus. Przy wyrobie tych napojów
wykorzystuje się funkcje życiowe komórek drożdży, przekształcających cukry w etanol.
Roztwory sacharozy mogą być bezpośrednio poddane fermentacji z udziałem drożdży, natomiast wielocukry (np. skrobia) nie

ulegają fermentacji i muszą być uprzednio poddane hydrolizie do tzw. cukrów fermentujących, głównie cukrów prostych i

dwucukrów – metabolizowanych przez drożdże. Stężenia alkoholu uzyskiwane w odfermentowanych środowiskach nie są

zbyt wysokie (przeważnie do 18% obj.).

Gorzelnictwo jest to gałąź przemysłu fermentacyjnego obejmująca produkcję spirytusu surowego na drodze fermentacji

alkoholowej cukrów, a następnie wydzielenie tego spirytusu z odfermentowanego zacieru w procesie destylacji.

Do produkcji spirytusu wykorzystuje się wiele surowców roślinnych zawierających różne węglowodany. Można je podzielić

na dwie grupy:

-

surowce zawierające wielocukry: ziemniaki, zboża, odpady krochmalnictwa, mąki, kasze, otręby;

-

surowce zawierające cukry bezpośrednio fermentujące (głównie sacharozę, glukozę, fruktozę): melas, buraki cukrowe,
trzcinę cukrową, marchew, owoce świeże i suszone, odpady przemysłu owocowego.

Wino jest to napój otrzymywany przez fermentację alkoholową winogron albo moszczu gronowego (wino gronowe) lub
owoców, względnie moszczu owocowego (wino owocowe). Takie określenie stosowane jest w Polsce, natomiast w Unii
Europejskiej kraje winiarskie zezwalają na stosowanie nazwy wino tylko w celu określenia wina gronowego wyprodukowane z
owoców rosnących w ściśle określonych rejonach.
Wszelkie napoje otrzymane z innych owoców niż winogrona nie mogą nazywać się winem, lecz powinny być określane w
inny sposób (np. wino jabłkowe jest nazywane cydrem).

-

wino gronowe - napój otrzymywany przez fermentację alkoholową świeżych winogron lub moszczu gronowego. Jest to
definicja ogólna, która w różnych krajach ulega pewnym zmianom, zezwalającym np. również na produkcję win z
suszonych winogron.

-

Polskie Wino - napój o stężeniu alkoholu od 9 % do 18 % obj., otrzymany w wyniku fermentacji alkoholowej z winogron
lub moszczu gronowego. Nazwa zastrzeżona dla „win gronowych” wyprodukowanych w Polsce.

-

wina owocowe - wyprodukowane z innych owoców niż winogrona, np.: z jabłek, porzeczek, agrestu, wiśni. Mogą
wykazywać moc od 9–18% obj. Zasadnicza różnica pomiędzy winami gronowymi a owocowymi polega na rodzaju
surowca, natomiast sposób uzyskania wina jest podobny, chociaż przy winach owocowych bardziej skomplikowany.
Moszcz gronowy z dojrzałych winogron zawiera dostateczną ilość cukru do otrzymania wina o odpowiedniej mocy,
zapewniającą mniejszą lub większą trwałość wina. Moszcz z innych owoców zawiera przeważnie zbyt mało cukru, a zbyt
wiele kwasów i dlatego musi być we właściwy sposób doprawiony, tzn. dosłodzony i ewentualnie rozcieńczony wodą.

-

miody pitne - są to napoje o stężeniu alkoholu od 9 % do 18 % obj., otrzymane w wyniku fermentacji alkoholowej
wodnego roztworu miodu pszczelego (brzeczki miodowej), z ewentualnym dodatkiem ziół aromatycznych lub przypraw
korzennych,

-

napoje winopochodne — są to napoje zawierające objętościowo od 4,5% do 15,0% alkoholu i zawierają minimum 50%
obj. win gronowych, owocowych lub miodu pitnego.

-

napoje winopodobne — są to napoje o stężeniu alkoholu od 9% do 15% obj., różniące się od win owocowych i miodów
pitnych mniejszym udziałem soków lub miodu w nastawie, otrzymane w wyniku fermentacji alkoholowej nastawu na
fermentowane napoje winiarskie inne niż Polskie Wino.

Podział win w zależności od:
a. Barwy:

-

białe o barwie od jasnożółtej lub zielonkawej do brązowej;

-

czerwone o barwie od jasnoczerwonej do ciemnowiśnowej;

-

różowe o barwie od różowej do jasnoczerwonej.

b. Zawartości alkoholu:

-

lekkie, o mocy 9–11% obj.;

-

średnio mocne 11–14% obj.;

-

mocne 14–18% obj.;

wzmocnione (alkoholizowane) o mocy powyżej 18% obj.
c. Zawartości cukru (cukry redukujące po inwersji g/l):

Wina gronowe

Wina owocowe

Wytrawne

do 10

do 15

Półwytrawne

powyżej 10 – 30

powyżej 15 – 30

Półsłodkie

powyżej 30 – 60

powyżej 30 – 60

Deserowe słodkie

powyżej 60

powyżej 60 – 100

Bardzo słodkie

powyżej 100

Sposób produkcji wina jest nieco odmienny dla win białych, czerwonych i różowych. Przy produkcji win białych poddaje się
fermentacji oddzielony od miazgi moszcz z winogron białych, natomiast przy produkcji win czerwonych fermentuje się nie

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

moszcz, lecz miazgę winogron czarnych, przy czym w czasie fermentacji barwniki i garbniki zawarte w skórce winogron
czarnych przechodzą do moszczu, co daje wina zabarwione na czerwono o odpowiedniej cierpkości. Wina różowe produkuje
się w sposób pośredni, tzn. fermentuje się miazgę winogron czarnych tylko przez bardzo krótki czas, po czym oddziela się
lekko zabarwiony moszcz i poddaje dalszej fermentacji już bez miazgi. Wino może zawierać dodatek barwników
spożywczych, karmelu lub cukru palonego.

Wymagania normatywne dla win

Ekstrakt bezcukrowy

Białe i różowe

Czerwone

Wino jednorodne z porzeczki agrestu i jeżyny

nie mniej niż [g/l]

Wina gronowe

15

17

—

Wina owocowe

15

19

15

Wina specjalne:

-

wina alkoholizowane — z dodatkiem alkoholu etylowego pochodzenia rolniczego lub destylatu owocowego,

-

wina aromatyzowane — z dodatkiem dozwolonych na podstawie przepisów o warunkach zdrowotnych żywności i
żywienia, ziół aromatycznych, przypraw korzennych lub naturalnych i identycznych z naturalnymi substancji
aromatycznych,

-

wermuty — gronowe wino ziołowe, Nazwa wina pochodzi od niemieckiej nazwy piołunu Wermutkraut, który jest
podstawowym składnikiem wermutowych mieszanek ziołowych. Winem podstawowym jest wino białe. Oprócz piołunu w
skład mieszanek ziołowych wchodzą m.in. kolendra, tatarak, tysiącznik, krwawnik, majeranek, goździki, gałka
muszkatołowa, cynamon, wanilia i wiele innych,

-

wina musujące i gazowane są to wina pozostające w stanie silnego nasycenia dwutlenkiem węgla (ciśnienie ok. 0,4-0,5
MPa) i wykazują zwykle umiarkowaną ilość alkoholu (10–12%),. Wysoki stopień nasycenia CO

2

osiąga się przez dodatek

cukru do wina i wtórną fermentacją w naczyniu zamkniętym (wina musujące), lub przez sztuczne wysycenie CO

2

z butli

(wina gazowane).

Rodzaje drożdży stosowanych w winiarstwie:
a. Wina lekkie: (10% alkoholu):

-

białe – Chablis (Fr), Sauternes (Fr), Riesling (D);

-

czerwone - Bordeaux (Fr).

b. Wina stołowe: (11-14%alkoholu):

-

białe – Bingen (H), Steinberg (D), Tokay (H), Johannisberg;

-

czerwone – Bordeaux, Bingen, Chambertin (Fr), Burgund (Fr).

c. Wina słodkie deserowe; (>14% alkoholu):

-

białe – Bingen, Tokay, Madera (Portug.), Sherry (Hiszp.);

-

czerwone – Portwein (Portug.), Malaga (Hiszp.), Burgund (Fr).

Wady wina - są to braki obniżające jego wygląd lub smak, które dają się łatwo usunąć. Zwykle spowodowane są złą jakością
surowca lub nieodpowiednim sposobem składowania moszczu.

-

brak klarowności (w winach trudno klarujących się: śliwkowe, gruszkowe, agrestowe),

-

opalescencja - lekka biało–mleczna, spowodowana jest dużą zawartością substancji pektynowych lub białek i garbników
(usuwa się taniną, żelatyną),

-

czernienie wina - spowodowane nadmiarem żelaza i garbników przy niskiej zawartości kwasów,

-

brunatnienie - na skutek kontaktu z powietrzem,

-

zbyt niska moc - poniżej 8%,

-

nieodpowiednia kwasowość – zbyt wysoka, powyżej 12 g/l, zbyt niska, poniżej 9 g/l,

-

nadmierna goryczka (nadgniłe owoce) – w celu korekcji należy wino dobrze wysiarkować i skupażować.

Choroby wina są to zmiany wywołane działaniem i rozwojem szkodliwych drobnoustrojów, które powodują znaczne
pogorszenie się wyglądu i trwałości oraz obniżenie właściwości zapachowo-smakowych.

-

Tworzenie się kożucha - najczęściej spotykane, spowodowane zakażeniem przez drożdże - Mycoderma vini, Candida,
Hansenula, Torulopsis, Pichia,

-

Zaoctowanie - tzw. „sztych octowy" - wywołane przez drobnoustroje tlenowe z rodzaju Acetobacter,

-

Fermentacja mlekowa - tzw. „sztych mlekowy", objawia się zapachem kiszonej kapusty lub zsiadłego mleka oraz utratą
klarowności – Lactobacillus, Pediococus i Leuconostoc,

-

Posmak mysi „myszka", a przy silnym rozwoju choroby zapach mysich ekstrementów wraz z utratą klarowności –
zakażenie bakteriami z rodzaju Lactobacillus lub drożdżami z rodzaju Brettanomyces,

-

Śluzowacenie wina - zakażenie bakteryjne z rodzaju Streptococus, Pediococus i Leuconostoc, pleśnie Aureobasidium
pullulans, a także drożdże z rodzaju Pichia i Torulopsis,

-

Fermentacja mannitowa – zmętnienie, zapach psujących się owoców, octowanie, śluzowacenie – tworzy się mannitol,

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

kwas octowy i mlekowy. Chorobę powodują bakterie z rodzajów: Lactobacillus brevis.

Destylacja prosta

Destylacja jest bardzo użyteczną metodą rozdziału wieloskładnikowych mieszanin ciekłych, a tym samym oczyszczania

substancji lotnych. Polega ona na odparowaniu najbardziej lotnego w danych warunkach ciśnienia i temperatury składnika, a
następnie na skropleniu par i zebraniu skroplonej cieczy (destylatu). Podczas ogrzewania cieczy prężność pary wzrasta aż do
momentu, gdy staje się równa ciśnieniu atmosferycznemu i rozpoczyna się wrzenie czyli parowanie w całej objętości cieczy.
Temperatura wrzenia cieczy jest to więc temperatura, w której prężność par cieczy jest równa ciśnieniu atmosferycznemu.
Rozróżnia się cztery typy destylacji: destylację prostą, destylację frakcyjną, destylację z parą wodną i destylację pod
zmniejszonym ciśnieniem.
W destylacji prostej pary cieczy poddaje się skropleniu przez bezpośrednie oziębianie, co pozwala z reguły tylko na
zagęszczenie składników mieszaniny w poszczególnych coraz wyżej wrzących frakcjach. Poniższy rysunek przedstawia
typowy zestaw do destylacji prostej.

Kolbę destylacyjną zawierającą ciecz (i kamyczek wrzenny) umieszcza się w płaszczu grzejnym lub na łaźni wodnej. Montuje
się nasadkę destylacyjną, chłodnicę (w zależności od temperatury wrzenia cieczy wodną lub powietrzną) oraz przedłużacz.
Niekiedy te części aparatury stanowią całość, noszącą wówczas nazwę chłodnicy destylacyjnej. Zintegrowany w ten sposób
zestaw znacznie ułatwia montaż aparatury. Chłodnicę wodną podłącza się do wody w taki sposób, aby woda wpływała niższym,
a wypływała wyżej położonym tubusem. U wylotu umieszcza się odbieralnik. Może to być kolba stożkowa, kolba
okrągłodenna lub butelka ze szlifem. W zasadzie nie powinno się używać zlewki. Termometr umieszcza się w ten sposób, aby
zbiorniczek rtęci znajdował się naprzeciw wlotu par do chłodnicy. Szlify w zestawionej aparaturze należy posmarować cienką
warstwą smaru pamiętając, że nadmiar smaru zanieczyszcza destylowaną ciecz. Istotną sprawą jest dobór odpowiedniego
rozmiaru kolby destylacyjnej. Przy rozpoczęciu destylacji kolba nie powinna być napełniona więcej niż do 2/3 objętości.
Dodanie kamyczka wrzennego ma na celu zapewnienie równomiernego wrzenia, ułatwia bowiem powstawanie pęcherzyków
pary. Bez kamyczków wrzennych następuje przegrzewanie cieczy i jej „rzucanie”. Jeśli zapomniano o kamyczku wrzennym, a
ciecz jest już gorąca i prawdopodobnie przegrzana, to przed dodaniem kamyczka wrzennego należy ciecz ochłodzić. W
przeciwnym razie może nastąpić gwałtowne wrzenie i wyrzucenie cieczy z naczynia.
Uwaga: Kamyczki wrzenne są jednorazowego użytku i po każdym przerwaniu wrzenia należy dodać świeży kawałek
niepolewanej porcelany.
Po rozpoczęciu wrzenia można zauważyć pierścień skraplającej się pary, podnoszący się w kolbie i nasadce. Termometr
zaczyna wskazywać wzrost temperatury aż do chwili, gdy zacznie się destylacja. Ogrzewanie należy wyregulować tak, aby
szybkość destylacji wynosiła 1 - 2 krople na sekundę. Przy silnym grzaniu duża ilość destylatu przechodzi jako niżej wrzący
przedgon. Jeśli destylacja jest zbyt wolna można, to z powodu strat ciepła można nie zaobserwować prawdziwej temperatury
wrzenia. Uwaga: Nigdy nie należy destylować substancji "do sucha"!

Wykonanie ćwiczenia

I. Analiza fermentacji

1. Opisać wygląd makroskopowy beztlenowych hodowli drożdży.
2. Oznaczyć masę kolby i poziom cieczy (porównać z masa wyjściową).
3. Określić liczbę komórek drożdży w komorze Thoma (przed pobraniem materiału hodowlę wymieszać).

Komórki liczymy pod mikroskopem w komorze Thoma. W razie konieczności wykonujemy 10-krotne
rozcieńczenie hodowli w płynie fizjologicznym. Przy średniej liczbie komórek w jednym kwadraciku (a) i
rozcieńczeniu (n), zawartość komórek (L) w 1ml wynosi:

L = 4 x 10

6

x a x n [jtk/ml]

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

4. Oznaczanie mocy
- pomiar metodą piknometryczną

Do kolby destylacyjnej odmierzyć cylindrem miarowym 150ml hodowli. Zmontować zestaw do destylacji
prostej i po uruchomieniu przepływu wody przez chłodnicę, ostrożnie prowadzić destylację zbierając destylat
do zlewki o objętości 100 cm

3

. Destylację zakończyć z chwilą uzyskania ok. 50ml destylatu - pozostałość w

kolbie destylacyjnej zachować do oznaczenia ekstraktu rzeczywistego !!!
Destylat przelać do cylindra miarowego o pojemności 100 cm

3

i uzupełnić wodą destylowaną do poziomu co

najmniej 50 cm

3

(zanotować dokładną ilość destylatu i dodanej wody).

Czysty i suchy piknometr zważyć na wadze analitycznej, następnie napełnić go wodą destylowaną o temp. ok.
20°C i ponownie zważyć. Tak samo postąpić z otrzymanym destylatem — napełnić piknometr i zważyć.

Gęstość destylatu (d) obliczyć ze wzoru:

P

1

– P

2

+ m

d =

P

2

– P

0

+ m

P

0

– masa piknometru pustego [g]

P

1

– masa piknometru z destylatem o temperaturze 20

0

C [g]

P

2

– masa piknometru z wodą o temperaturze 20

0

C [g]

m – poprawka na ważenie w powietrzu, która wynosi 0,0012

Na podstawie gęstości destylatu odczytać zawartość alkoholu etylowego z tablic (załącznik)

- pomiar metodą areometryczną

Otrzymany destylat przelać do cylindra i zmierzyć zawartość alkoholu za pomocą areometru Trallesa
(alkoholomierza). W tym celu 30-40ml destylatu wlać do cylindra szklanego i powoli włożyć areometr. Po 1-2
minutach odczytać stężenie alkoholu.

- pomiar metodą refraktometryczną

Oznaczyć stężenie procentowe alkoholu w destylacie za pomocą refraktometru.

5. Oznaczanie ekstraktu rzeczywistego

- pomiar metodą areometryczną

Pozostałość po destylacji przenieść do cylindra miarowego o pojemności 250 cm

3

i dopełnić wodą

destylowaną do 150 cm

3

i oznaczyć zawartość ekstraktu rzeczywistego za pomocą areometru Ballinga. Ok. 30-

40ml roztworu przelać do cylindra szklanego i powoli włożyć areometr. Po 1-2 minutach odczytać zawartość
ekstraktu.

- pomiar metoda refraktometryczną

Pomiar wykonujemy refraktometrem lunetowym MASTER-TA z automatyczną kompensacją temperatury.
W tym celu podnosimy osłonę pryzmatu, pipetą nanosimy ok. 1 ml roztworu tak, aby zamykając osłonę ciecz
równomiernie, bez pęcherzyków powietrza pokryła cały pryzmat. Następnie patrząc przez lunetkę odczytujemy
wynik w

0

Brix..

(skala po lewej stronie w

0

Brix, skala po prawej stronie

0

T.A.)

Po wykonaniu pomiaru refraktometr dokładnie płuczemy pod bieżącą wodą i wycieramy delikatnie do sucha
papierowym ręcznikiem.

II. Opracowanie wyników

Wykonać następujące obliczenia:

- w oparciu o zawartość ekstraktu przed i po destylacji obliczyć na podstawie poniższego równania reakcji

stężenie etanolu wytworzonego przez drożdże

C

12

H

22

O

11

+ H

2

O → 4C

2

H

5

OH + CO

2

- w oparciu o moc uzyskanego destylatu (metody piknometryczna, areometryczna, nefelometryczna) obliczyć

stężenie etanolu wytworzonego przez drożdże.

Uzyskane wyniki wraz z opisanymi wnioskami zamieścić w sprawozdaniu.

III. Zagadnienia teoretyczne:

- destylacja prosta.

Biotechnologia ogólna dla studentów kierunku biotechnologia wersja 1.1

- temperatura wrzenia

- podział win

- drożdże stosowane do wyrobu wina

- wady i choroby wina

IV. Literatura:

1. Kunicki-Goldfinger W.; Życie bakterii; Wyd. PWN; Warszawa; 1998
2. Libudzisz Z. Kowal K.; Mikrobiologia techniczna; Wyd. Politechniki Łódzkiej; 2000

3.

Bednarski W., Reps A.; Biotechnologia żywności; WNT; Warszawa; 2003.

Zależność pomiędzy gęstością wodnych roztworów etanolu w 20

° C, a udziałem objętościowym etanolu

d , kg/m

3

Udział obj., %

d , kg/m

3

Udział obj., %

d , kg/m

3

Udział obj., %

d , kg/m

3

Udział obj., %

789,3

100,00

842

85,95

895

66,12

948

40,01

790

99,86

843

85,62

896

65,69

949

39,38

791

99,66

844

85,29

897

65,27

950

38,75

792

99,46

845

84,96

898

64,85

951

38,11

793

99,26

846

84,62

899

64,42

952

37,45

794

99,06

847

84,28

900

63,99

953

36,78

795

98,85

848

83,94

901

63,56

954

36,11

796

98,63

849

83,60

902

63,13

955

35,41

797

98,42

850

83,26

903

62,70

956

34,71

798

98,21

851

82,91

904

62,26

957

34,00

799

98,00

852

82,57

905

61,82

958

33,26

800

97,76

853

82,22

906

61,38

959

32,52

801

97,53

854

81,87

907

60,94

960

31,75

802

97,30

855

81,52

908

60,50

961

30,98

803

97,08

856

81,16

909

60,05

962

30,18

804

96,84

857

80,81

910

59,60

963

29,35

805

96,59

858

80,45

911

59,16

964

28,52

806

96,35

859

80,10

912

58,70

965

27,67

807

96,11

860

79,74

913

58,25

966

26,83

808

95,86

861

79,38

914

57,80

967

25,96

809

95,61

862

79,02

915

57,33

968

25,09

810

95,36

863

78,65

916

56,87

969

24,19

811

95,11

864

78,29

917

56,40

970

23,29

812

94,85

865

77,92

918

55,93

971

22,38

813

94,58

866

77,53

919

55,46

972

21,46

814

94,32

867

77,18

920

54,99

973

20,53

815

94,06

868

76,81

921

54,50

974

19,59

816

93,79

869

76,43

922

54,02

975

18,64

817

93,52

870

76,06

923

53,54

976

17,69

818

93,24

871

75,68

924

53,05

977

16,76

819

92,97

872

75,30

925

52,56

978

15,85

820

92,69

873

74,92

926

52,08

979

14,95

821

92,41

874

74,54

927

51,57

980

14,05

822

92,12

875

74,15

928

51,07

981

13,17

823

91,84

876

73,77

929

50,57

982

12,31

824

91,54

877

73,30

930

50,07

983

11,45

825

91,25

878

73,00

931

49,56

984

10,61

826

90,96

879

72,60

932

49,04

985

9,77

827

90,66

880

72,21

933

48,52

986

8,94

828

90,36

881

71,82

934

48,00

987

8,13

829

90,07

882

71,42

935

47,47

988

7,33

830

89,76

883

71,03

936

46,93

989

6,55

831

89,45

884

70,63

937

46,39

990

5,70

832

89,15

885

70,23

938

45,85

991

5,02

833

88,84

886

69,83

939

45,28

992

4,29

834

88,52

887

69,42

940

44,74

993

3,58

835

88,21

888

69,02

941

44,17

994

2,87

836

87,89

889

68,60

942

43,60

995

2,17

837

87,57

890

68,19

943

43,03

996

1,49

838

87,25

891

67,78

944

42,44

997

0,81

839

86,93

892

67,37

945

41,84

998

0,13

840

86,60

893

66,95

946

41,24

998,2

0,00

841

86,27

894

66,53

947

40,62