ZASTOSOWANIE HPLC DO BADANIA PROCESÓW
Z UDZIAŁEM AKTYWNYCH FORM TLENU

Część I:

Analiza produktów peroksydacji cholesterolu jako metoda badania
mechanizmu reakcji fotouczulanych

Wstęp

Reakcje fotouczulane to zespół zjawisk fotofizycznych i fotochemicznych, w których

energia promieniowania, pochłonięta przez odpowiedni chromofor, zwany uczulaczem, jest
wykorzystana do indukcji przemian chemicznych substratu. Przemiany te mogą polegać na
utlenianiu, redukcji, izomeryzacji, przyłączaniu pewnych grup lub degradacji. Procesy
zachodzące z udziałem tlenu noszą nazwę fotouczulanego utleniania.

Przez działanie fotodynamiczne rozumie się efekty, jakie wywołuje w układach

biologicznych fotouczulane utlenianie. W przypadku komórek mogą to być np. mutacje,
uszkodzenia błon biologicznych lub nawet śmierć komórek. Zjawiska fotodynamiczne są
intensywnie badane ze względu na ich zastosowanie w fototerapii nowotworów i innych
schorzeń skóry. Metoda ta, zwana terapią fotodynamiczną, polega na lokalnym naświetleniu
dotkniętego chorobą miejsca po uprzednim wprowadzeniu do układu uczulacza. Wskutek
działania powstających w reakcjach fotouczulanych wysoce reaktywnych produktów tkanka
nowotworowa powinna ulec zniszczeniu. Skuteczność tej metody zależy głównie od stopnia
w jakim chora tkanka jest selektywnie wzbogacona w uczulacz oraz od penetracji aktywnego
promieniowania w obszarze schorzenia. Uważa się, że podczas zabijania lub uszkadzania
komórek spowodowanego działaniem fotodynamicznym szczególnie ważne są procesy
peroksydacji lipidów błony komórkowej oraz innych błon biologicznych.

Reakcje fotouczulane wymagają obecności uczulacza, tlenu oraz światła, najczęściej

widzialnego, o długości, którą absorbuje barwnik uczulający. Do uczulaczy zaliczają się
zarówno ksantyny, tiazyny, fenotiazyny, akrydyny, niesteroidowe leki przeciwzapalne,
antybiotyki, jak i barwniki endogenne występujące w organizmach zwierzęcych i roślinnych,
np. protoporfiryna, retinal, bilirubina czy chlorofil.

Podczas wszystkich typów reakcji fotouczulanych, także fotoperoksydacji lipidów,

proces rozpoczyna się od absorpcji przez cząsteczki uczulacza kwantów promieniowania, co
powoduje ich przejście do singletowego stanu wzbudzonego. Na skutek przejścia
interkombinacyjnego wzbudzony uczulacz przechodzi do dłużej żyjącego stany
trypletowego. W dalszym ciągu w zależności od rodzaju uczulacza oraz warunków
środowiska reakcja może przebiegać na dwa różne sposoby (Rys. 1):

Typ I. Wzbudzona cząsteczka

3

S reaguje z substratem (np. łańcuchem nienasyconego lipidu

LH) w wyniku czego powstaje rodnik alkilowy L

•

oraz anionorodnik uczulacza S

•–

.

Zachodząca następnie z dużą szybkością reakcja L

•

z tlenem napędza wolnorodnikowy

proces peroksydacji lipidów z rodnikami peroksylowymi (LOO

•

) jako formami pośrednimi

oraz wodoronadtlenkami lipidów (LOOH) jako produktami reakcji. W reakcji S

•–

z O

2

generowany jest anionorodnik ponadtlenkowy (O

2

–

), w wyniku dysproporcjonacji którego

powstaje nadtlenek wodoru (H

2

O

2

). W reakcji rozpadu H

2

O

2

katalizowanej przez

zredukowane jony metali przejściowych powstaje bardzo reaktywny rodnik hydroksylowy
(

•

OH).

Typ II. Energia wzbudzenia elektronowego ze stanu

3

S przekazywana jest na cząsteczkę

tlenu (która w stanie podstawowym jest również w stanie trypletowym), w wyniku czego
powstaje tlen singletowy - wzbudzona, wysoce reaktywna forma tlenu (

1

O

2

). Może on

bezpośrednio reagować z nienasyconymi lipidami, co powoduje powstawanie
wodoronadtlenków lipidów. Poniższy schemat przedstawia w ogólny sposób opisane
procesy.

To, jaką drogą zachodzi reakcja w danym systemie zależy m. in. od potencjału

jonizacji uczulacza, stopnia jego hydrofobowości i powinowactwa do błony oraz stosunku
stężeń LH i O

2

konkurujących ze sobą o

3

S. Często mamy do czynienia z występowaniem

obu mechanizmów jednocześnie.

Określenie mechanizmu reakcji może być niekiedy bardzo istotne np. podczas

wprowadzania i badania nowych uczulaczy. W tym celu stosuje się różne podejścia. Można
obserwować, czy proces jest hamowany przez zmiatacze tlenu singletowego (azydek,
histydyna, b-karoten) lub rodników hydroksylowych (mannitol, tiomocznik, DMSO), ze

względu jednak na stosunkowo małą specyficzniość zmiataczy jednoznaczne określenie
mechanizmu reakcji przy ich pomocy jest często niemożliwe. Lepszy sposób, to oznaczanie
produktów specyficznych dla reakcji

1

O

2

i wolnych rodników. Mogą to być na przykład

izomeryczne formy wodoronadtlenków kwasu linolowego (9-OOH i 13-OOH dla reakcji
wolnorodnikowej, 10-OOH i 12-OOH dla

1

O

2

). Kwas linolowy może być z powodzeniem

wykorzystywany jako sonda w prostych układach modelowych (np. micelle), stosowanie go
jednak do analizy skomplikowanych układów biologicznych jest utrudnione. Znacznie lepszą
sondą jest natomiast cholesterol. Jest on naturalnym składnikiem wielu błon biologicznych,
a ponadto występuje w błonie oddzielnie, jako stosunkowo prosty związek (nie wchodzi w
skład różnych fosfolipidów jak kwas linolowy). Specyficzne produkty reakcji cholesterolu z
tlenem singletowym (5a-OOH, 6a- i 6b-OOH) oraz reakcji rodnikowych (7a- i 7b-OOH)
mogą być stosunkowo łatwo oznaczone (Rys. 2).

Róż bengalski, który zostanie użyty podczas ćwiczenia (4,5,6,7-tetrachloro-2',4',5',7'-

tetrajodofluoresceina) jest dobrze znanym fotouczulaczem. Jest on rozpuszczalny w wodzie,
jego roztwory silnie absorbują światło widzialne w okolicy 550 nm. Wzór RB i widmo

absorpcji są przedstawione na rysunkach 3. i 4).

Część praktyczna

1. Przygotowanie wielowarstwowych liposomów z fosfatydylocholiny (DMPC)
zawierających cholesterol.

- odważyć odpowiednią ilość lipidów i rozpuścić je w probówce w chloroformie;
(ilości lipidów mają być takie, żeby stężenie każdego z nich wynosiło 1 mM w 1 ml
zawiesiny liposomów w buforze)
- cały czas mieszając roztwór na wytrząsarce odparować chloroform strumieniem
azotu (pod dygestorium) tak, aby na ściankach probówki powstała błonka utworzona
z wysuszonych lipidów
- dodać 1 ml buforu PBSA i wytrząsać na wytrząsarce przez 1-2 minuty (powstanie
jednorodna, mętna zawiesina)

2. Naświetlanie liposomów w obecności fotouczulacza.

- przygotowane liposomy umieścić w termostatowanym naczyńku do naświetlania
(temperatura 4

o

C)

- dodać (w ciemności) odpowiednią ilość roztworu różu bengalskiego (stężenie w
próbce powinno wynosić 10 mM)
- pobrać próbkę zerową (nienaświetlaną)
- rozpocząć naświetlanie lampą ksenonową przez filtr zielony, pobrać próbki po 5 i 15
minutach

- 250 µl próbki pobierać do probówek Eppendorf zawierających 400 µl mieszaniny
ekstrakcyjnej (chloroform:metanol 2:1) i wytrząsać przez minutę. Po odwirowaniu
przy pomocy pipety pasteurowskkiej odessać górną warstwę wodną i odrzucić. Dolną
warstwą chloroformową przenieść do suchej probówki i wysuszyć w strumieniu
azotu. Przechowywać w zamrażarce.

3. Analiza próbek.

- do probówki z wysuszoną próbką dodać 55 ml alkoholu izopropylowego i
wymieszać; 20 ml roztworu wstrzyknąć przy pomocy strzykawki Hamiltona do pętli
injektora chromatografu
- warunki rozdziału: - kolumna Beckman ODS Ultrasphere 3 mm, 4,6 mm x 7 cm;

- faza ruchoma (odtlenowana przez przedmuchiwanie argonem)
- 72% metanolu, 8% izopropanolu, 11% aceto-nitrylu, 9%
wody z 1 mM NaClO

4

i 10 mM octan amonu

- przepływ 1,5 ml/min
- detekcja - detektor elektrochemiczny przy potencjale -150
mV, detektor absorpcyjny ustawiony na 212 nm.

Część II:

Detekcja rodnika hydroksylowego metodą hydroksylacji kwasu
salicylowego

Wstęp

Rodnik hydroksylowy jest jedną z najbardziej reaktywnych spośród wszystkich

znanych cząsteczek chemicznych. Powstaje głównie w procesie radiolizy wody oraz
w katalizowanej przez zredukowane jony żelaza reakcji rozkładu nadtlenku wodoru, zwanej
reakcją Fentona. Stała szybkości reakcji tego rodnika z większością substancji jest rzędu
10

9

–10

10

M

-1

s

-1

. Ze względu na krótki czas życia rodników hydroksylowych, ich stężenie w

badanych układach jest zbyt niskie, by można je było wykryć metodami bezpośrednimi, np.
przy pomocy standardowej spektroskopii EPR lub konwencjonalnymi metodami
spektrofotometrycznymi. Dlatego w badaniach procesów generowania i oddziaływania
rodników hydroksylowych wykorzystuje się metody pośrednie, w których mierzy się ilość
nie samych rodników lecz produktów ich reakcji z innymi związkami. Do najczęściej
stosowanych metod należą: pułapkowanie spinowe oraz pomiar produktów hydroksylacji
związków aromatycznych np. tyrozyny lub salicylanu.

W reakcji ze związkami aromatycznymi rodniki hydroksylowe tworzą

charakterystyczne hydroksy–pochodne. W reakcji z kwasem salicylowym, która przebiega ze
stałą szybkości 1,6 x 10

10

M

-1

s

-1

, powstają głównie trzy związki: katechol, kwas

2,3–dwuhydroksybenzoesowy i kwas 2,5–dwuhydroksybenzoesowy (Rys. 5).

Dwie główne pochodne, 2,3– i 2,5–DHB mogą być rozdzielone i oznaczone ilościowo przy
pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną lub
absorpcyjną. Metoda ta z powodzeniem może być stosowana nawet w badaniach in vivo.
Pacjentom wystarczy podawać aspirynę i analizować ich płyny ustrojowe. Pewnym
ograniczeniem metody jest fakt, że 2,5–DHB może być produkowany przy udziale
cytochromu P–450 w normalnym metabolizmie kwasu salicylowego. Tak więc jedynie
2,3–DHB jest względnie specyficzną miarą ilości generowanych rodników hydroksylowych.
Wzrost ilości 2,3–DHB obserwowano miedzy innymi u ludzi z reumatoidalnym zapaleniem
stawów oraz u szczurów traktowanych adriamycyną – lekiem mogącym uczestniczyć
w cyklach redoksowych.

W trakcie ćwiczenia rodniki hydroksylowe będą generowane w napędzanej

askorbinianem reakcji Fentona. Do układu dodawany będzie w różnych stężeniach
konkurencyjny zmiatacz rodników hydroksylowych N-acetylo-cysteina (NAC).

Wykonanie ćwiczenia

Roztwory:

1 mM Fe-EDTA
Salicylan sodowy 50 mM
Kwas askorbinowy 5 mM

NAC 10 mM w 10 mM buforze fosforanowym pH 7,4
Nadtlenek wodoru 50 mM

Aparatura:

Chromatograf cieczowy wysokociśnieniowy +

detektor elektrochemiczny lub
absorpcyjny

Łaźnia wodna z chłodzeniem
Spektrofotometr
Wytrząsarka laboratoryjna
Oświetlacz ksenonowy + filtr zielony
Butla z azotem lub argonem + reduktor

Kolejne czynności:

Próbka doświadczalna o objętości 0,5 ml zawierać powinna reagenty w następujących
stężeniach:

Fe-EDTA 0,1 mM
Salicylan 2 mM
Askorbinian 0,5 mM
H

2

O

2

2 mM

NAC - próbki zawierające 0, 0,5 , 2 i 5 mM

Pozostałą do 0,5 ml objętość należy uzupełnić wodą. Proszę pamiętać, że stężenie buforu w
każdej próbce musi być jednakowe. Po zmieszaniu reagentów w probówce próbkę należy
inkubować przez 15 minut, a następnie wstrzyknąć 20 µl do pętli injektora chromatografu.
Na podstawie rozdziału roztworu standardów - 2,3- i 2,5-DHB o znanym stężeniu należy
obliczyć stężenia pochodnych w badanych próbkach. Rozdział będzie przeprowadzony na
kolumnie firmy Beckman (250 mm x 4,6 mm), z fazą stacjonarną Nucleosil C18 5

F. Faza

ruchomą jest bufor: kwas cytrynowy (30 mM)/ octan sodu (27 mM) pH=4,7; prędkość
przepływu 2ml/min. Pochodne kwasu salicylowego wykrywać można używając detektora
elektrochemicznego przy potencjale roboczym 600 mV lub absorpcyjnego przy długości fali
310 nm.

Opracowanie wyników
Część I. W sprawozdaniu proszę krótko opisać doświadczenie, narysować schemat systemu
do HPLC stosowanego podczas ćwiczenia oraz przedstawić liczbowo i porównać między

sobą intensywności pików odpowiadających poszczególnym pochodnym po różnych czasach
naświetlania. Z jakim typem reakcji fotouczulanych mamy do czynienia ?

Część II. W sprawozdaniu proszę przedstawić na wykresie zależność stężenia pochodnych
salicylanu powstałych w reakcji od stężenia NAC. Na podstawie wykresu i stałej szybkości
reakcji rodnika hydroksylowego z salicylanem proszę oszacować stałą szybkości reakcji
rodnika hydroksylowego z NAC.

Literatura obowiązkowa (kolokwium):

1.

“Analiza instrumentalna w biochemii” Skrypt pod red. A. Kleina i A. Kozika, wstęp
do rozdziału poświęconego chromatografii cieczowej, str. 90-103, UJ 1989

2.

Bartosz G. “Druga twarz tlenu”. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1995.
podrozdziały: 1.3.3-5, 1.5.3-5, 1.7.1-5, 1.9.1

Literatura uzupełniająca (dla zainteresowanych)

3.

Bartosz G. “Druga twarz tlenu”. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa (cała
książka).

4.

Witkiewicz Z. “ Podstawy chromatografii”, WNT Warszawa 1995.

5.

Grootveld M., Halliwell B. “Aromatic hydroxylation as a potential measure of
hydroxyl radical formation in vivo”, Biochem J 237, 499-504, 1986.

6.

Korytowski W., Bachowski G. J., and Girotti W. “Analysis of cholesterol and
phospholipid hydroperoxides by HPLC with mercury drop electrochemical detection”
Analytical Biochem. 213, 111-119, 1993.

7.

Valenziano D. P. “ Photomodification of biological membranes with emphasis on
singlet oxygen mechanisms” Photochemistry and Photobiology 46, 147-160, 1987.