1. Opisz dam i dcm metylację.

Metylacja dam polega na związaniu grupy metylowej do adeniny w sekwencji GATC, natomiast
metylacja dcm na metylowaniu wewnętrznej cytozyny w sekwencji CCA/TGG. Jeżeli wymienione
sekwencje są częścią sekwencji rozpoznania restryktazy lub enzym rozpoznaje i tnie bezpośrednio
taką sekwencję, to fakt możliwości ich metylacji ma swoje konsekwencje (np. w przypadku DNA
otrzymywanego w komórkach E. coli dam+ i dcm+) ze względu na wrażliwość danego enzymu na tego
typu metylację substratu.

2. Kryteria doboru enzymów restrykcji w klonowaniu molekularnym fragmentów DNA.



sekwencja rozpoznania enzymu w obrębie plazmidu i miejsca przecięcia (dla niektórych

enzymów mogą znajdować się poza miejscem rozpoznania);



ilość fragmentów DNA, które chcemy otrzymać w wyniku trawienia (niewielka liczba – należy

użyć enzymu rozpoznającego dłuższe sekwencje);



rodzaj końców powstających po trawieniu enzymem restrykcyjnym (lepkie lub tępe) i

konieczność ich modyfikacji;



wrażliwość na metylację substratu pochodzącego ze szczepów dzikich;

3. Omówić enzymy modyfikujące końce fragmentów DNA stosowane w metodach inżynierii
genetycznej.



fragment Klenowa polimerazy DNA I - tworzenie tępych końców przez wypełnianie cofniętych

końców 3'



polimeraza DNA T4 - tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych końców 3' lub

wypełnianie cofniętych końców 3'



kinaza polinukleotydowa T4 - fosforylacja końców 5'



nukleaza mung bean - tworzenie tępych końców przez usuwanie jednoniciowych lepkich

końców



alkaliczna fosfataza - usuwanie grup fosforanowych z końców 5'



terminalna deoksynukleotydylo transferaza (TDT) - tworzenie homopolimerowych ogonów

na końcach fragmentów

4. Opisz mechanizm odpowiedzialny za możliwość łatwej identyfikacji kolonii bakteryjnych
zawierających plazmidy rekombinantowe w przypadku klonowania fragmentów DNA do wektora
pBR322

Plazmid pBR322 niesie dwa geny markerowe: amp

r

i tet

r

(kodują oporność komórek na ampicylinę

tetracyklinę), w obrębie których znajdują się sekwencje rozpoznania dla różnych enzymów
restrykcyjnych. Jeśli wprowadzi się gen targetowy w gen amp

r

, to dojdzie do jego przerwania jego

ciągłości. Zatem komórki rekombinantowe będą oporne jedynie na tetracyklinę. W celu łatwej
identyfikacji transformowane komórki wysiewa się na podłoże zawierające tetracyklinę – komórki,
które na nim wyrosły zawierają nieuszkodzony gen tet

r

. Następnie kolonie z szalki z tetracykliną

przenosi się, np. metodą replik, na podłoże zawierające ampicylinę – kolonie, które wyrosły na tym
podłożu zawierają plazmid niezrekombinowany, natomiast te które wyrastają prawdopodobnie są
poszukiwanymi rekombinantami.

5. Wymień zalety i wady klonowania „na lepko” fragmentów DNA trawionych jednym enzymem
restrykcyjnym do wektorów plazmidowych.



liniowe DNA plazmidu wektora należy traktować fosfatazą alkaliczną;



plazmidy rekombinantów mogą zawierać tandemowe kopie obcego DNA;



miejsca restrykcyjne przy połączeniu między plazmidem a obcym DNA są zwykle

zachowywane;



obcy DNA może być wklonowany w każdej orientacji;



wysoka wydajność ligacji lepkich końców.

6. Wektory do przygotowywania bibliotek genomowego DNA

Wektory do przygotowania bibliotek genomowych charakteryzują się:



ogromnym potencjałem stabilnego utrzymywania dużych fragmentów DNA (50 – 1000 kpz),

w kolejnych pokoleniach klonu gospodarza (wysoka stabilność strukturalna i segregacyjna
wektora);



możliwością selekcji i identyfikacji rekombinantów;



względnie łatwą izolacją z organizmu gospodarza.

Wyróżnia się dwie grupy systemów do klonowania używanych do konstruowania bibliotek
genomowych:

1. systemy wykorzystywane do wykonania wstępnej mapy fizycznej;
2. systemy konieczne do precyzyjnej analizy, ułatwiające wykonanie mapy genetycznej.

Ad.1. Spośród wektorów tej grupy czołową rolę odgrywają tzw. sztuczne chromosomy:



BAC (Bacterial Artificial Chromosome) – sztuczny chromosom bakteryjny, niskokopijny (1-2) o

dużej pojemności (maksymalnie 300 kpz), zawierający elementy kontroli, regulacji replikacji
oraz segregacji z episomu F E. coli



PAC (P1 derived Artificial Chromosome) – sztuczny chromosomom oparty na replikonie

bakteriofaga P1, również niskokopijny, o niskiej pojemności (do 300 kpz), zawierający ori
plazmidowy i lityczny bakteriofaga P1 E. coli oraz system do pozytywnej selekcji
rekombinantów;



YAC (Yeast Artificial Chromosome) – sztuczny chromosom drożdżowy, niskokopijny o bardzo

dużej pojmnności (1400 kpz), jest liniową cząsteczką DNA posiadającą autonomiczny origin
replikacji, centromer i telomery, wadą tego wektora jest duża częstość powstawania chimer,
insertów powstałych z połączenia z dwóch lub większej ilości fragmentów nie sąsiadujących
ze sobą na genomie; kolejną istotną słabością tego systemu jest trudność z izolacją YAC
spośród innych chromosomów drożdżowych oraz mało wydajna transformacja.

Ad. 2. Do wektorów tej grupy należą systemy do klonowania heterologicznego w komórkach E.coli,
łączące w sobie cechy plazmidowego wektora i systemu do pakowania w główki bakteriofagów
(obecność elementów cosN lub pac):



kosmidy – wysokokopijne plazmidy oparte na replikonie ColE1 lub pMB1, zawierające

sekwencję cosN, rozpoznawaną w procesie pakowania DNA in vitro w główki bakteriofaga l;



fosmidy – udoskonalone pochodne kosmidów, zachowujące ich cechy z wyjątkiem rodzaju

replikonu, który w tym przypadku pochodzi z plazmidu F, co obniża ich liczbę kopii do 1-2,



pacmidy – zawierające sekwencję pac, istotną podczas pakowania DNA w główki

bakteriofaga P1, sekwencję loxP, istotną do po-transdukcyjnej Cre-zależnej cyrkularyzacji

wektora, oraz dwa alternatywne replikony P1, plazmidowy (niskokopijny, 1-2 kopie), do
stabilnego utrzymywania wektora i lityczny (wysokokopijny, 10-20 kopii), do amplifikacji
wektora. System zaopatrzono ponadto w element pozytywnej kontroli rekombinantów, w
postaci genu sacB. którego produkt powoduje efekt letalny bakterii rosnących na podłożu z
5% sacharozą.

Ogromną zaletą tych systemów jest bardzo wydajny sposób wprowadzania DNA do komórek
bakteryjnych gospodarza, ale ich ograniczeniem jest maksymalna wielkość fragmentu DNA możliwa
do upakowania w główce: 45 kpz dla faga l i 100 kpz dla P1. Z racji podwyższonej liczby kopii
kosmidów, wektory te uważa się za niestabilne strukturalnie (35% rekombinacji), co zostało w dużej
mierze już wyeliminowane fosmidach.

7. Białka (lub wektory) termostabilne , otrzymywanie, własności i zastosowanie.

Białka termostabilne są to białka, które wykazują najlepsze właściwości, np. katalityczne, w
ekstremalnych warunkach termicznych (w wysokich lub niskich temperaturach). Otrzymuje się je
metodami inżynierii genetycznej. Pierwszym etapem jest skrining środowiskowy w poszukiwaniu
mikroorganizmu produkującego interesujące białko, następnie taki produkt izoluje się, bada
dokładnie jego właściwości, sekwenecjonuje i określa gen odpowiedzialny za jego ekspresję. Po
identyfikacji genu należy go wyizolować z organizmu dzikiego i wklonować do autonomicznego
wektora, który transformuje się do mikroorganizmu producenckiego. Następnie identyfikuje się
otrzymane rekombinanty i określa ekspresję interesującego białka (w celu dobrania jak najlepszego
szczepu). Obecnie metodami inżynierii genetycznej otrzymano wiele białek termostabilnych, m.in.: β
– galaktozydazy hydrolizujące wiązania β – 1,4 – glikozydowe, które maja zastosowanie w przemyśle
do produkcji mleka o obniżonej zawartości laktozy. Innym przykładem takich enzymów są
termostabilne polimerazy Pwo i Pfu, które są zdolne do katalizowania reakcji syntezy DNA w
wysokich temperaturach – mają one zastosowanie w reakcji PCR. Metodami inżynierii genetycznej
otrzymano również termostabilne białka SSB (białka wiążące jednoniciowy DNA), które są niezbędne
w procesie replikacji, stymulują polimerazę DNA oraz biorą udział w rekombinacji i naprawie DNA.
Znalazły one zastosowanie m.in. jako „wzmacniacz” w reakcji PCR i multiplex PCR

8. Wyjaśnij rolę plazmidu pLysS w systemie ekspresji Tabora-Studiera. Opisz wpływ lizozymu na
poziom ekspresji białek rekombinantowych. Czy obecność tego plazmidu wywiera istotny wpływ
na poziom ekspresji klonowanego genu? Odpowiedź uzasadnij.

Do prawidłowego funkcjonowania systemu Tabora – Studiera niezbędna jest obecność polimerazy
RNA faga T7, której synteza w komórce gospodarza indukowana jest obecnością IPTG. Plazmid pLysS
w tym systemie niesie gen kodujący lizozym faga T7, którego zadanie polega na inaktywacji
pojedynczych cząsteczek polimerazy fagowej, powstających przed indukcją. Ponadto obecny w
komórce lizozym, dzięki zdolności do do hydrolizowanie wiązań β – 1,4 – glikozydowych w
peptydoglikanie ściany komórkowej bakterii, ułatwia późniejsza lizę komórek (po naruszeniu
struktury błony w pierwszych etapach izolacji) i uwolnienie z nich pożądanego produktu białkowego.
Ekspresja genu niesionego przez plazmid pLysS zachodzi w komórce na stałym niskim poziomie, więc
nie ma wpływu na poziom ekspresji genu docelowego białek rekombinantowych po indukcji IPTG,
ponieważ powstaje wtedy bardzo dużo polimerazy fagowej.

9. Naszkicować reakcję katalizowaną przez polimerazę DNA tworzenia wiązania fosfodiestrowego
między nicią DNA z trójfosforanem nukleozydu adeninowego

10. Od czego zależy właściwe ustalenie temperatury dołączania primerów w reakcji PCR?

Ustalenie temperatury dołączania primerów w reakcji PCR zależy od ich temperatury topnienia (T

m

),

która musi być niższa od temperatury dysocjacji/wydłużania. Na wartość T

m

ma wpływ długość

startera (im dłuższy tym jest ona większa) oraz jego skład (startery bogate w pary GC mają wyższą
T

m

), dlatego ważna jest optymalizacja jego długości i składu zasad.

11. Od czego zależy wydajność polimerazy Taq?

Wydajność syntezy DNA polimerazą Taq zależy głównie od:



stężenia enzymu;



temperatury (optymalizacja szybkości syntezy i czasu półtrwania enzymu);



efektywnego stężenia jonów Mg

2+

;



struktury drugorzędowej matrycy;



stężenia dNTP.

12. Wymienić i omówić najbardziej czułe na zmiany temperatury elementy reakcji PCR



denaturacja DNA – zachodzi w temp. 94 – 95

0

C, zbyt niska temperatura mogłaby

spowodować niepełną denaturację DNA, a w konsekwencji uniemożliwienie przyłączenia się
starterów;



przyłączenie primerów – zachodzi w temp. ~52

0

C i zależy od T

m

primerów, zbyt niska

temperatura przyłączania może spowodować niespecyficzną hybrydyzację starterów z
wieloma miejscami w genomie, charakteryzującymi się tylko częściową komplementarnością;



wydłużanie primera katalizowane przez polimerazę termostabilną, której szybkość działania i

czas półtrwania jest zależny od temperatury (dla polimerazy Taq temp. wynosi ok. 72

0

C), za

niska temperatura prowadzenia reakcji spowalnia szybkość syntezy, natomiast za wysoka
obniża czas półtrwania enzymu;

13. Wymienić i omówić inhibitory reakcji PCR



zbyt wysokie stężenie MgCl

2

(10 mM) hamuje aktywność polimerazy Taq w 40 – 50%;



obecność jonów jednowartościowych – przekroczenie 75 mM KCl daje wyraźny efekt

hamujący;



detergenty jonowe – stosowane są do lizy komórek i denaturacji białek w trakcie izolacji DNA,

wykazano, że obecność jonowych detergentów w reakcji PCR hamuje działanie polimerazy
Taq już przy niewielkim stężeniu, np. 0,1% SDS całkowicie hamuje aktywność enzymu;



obecność proteinazy K – enzym ten stosowany jest do lizy komórek i izolacji DNA, jego

aktywność w mieszaninie reakcyjnej PCR może bardzo szybko zdegradować proteolitycznie
polimerazę Taq, dlatego ważne jest całkowite inaktywowanie proteinazy K;



śladowe ilości fenolu w próbce, problem ten można wyeliminować usuwając ślady fenolu

pochodzącego z ekstrakcji fenolowej przez końcową ekstrakcję DNA mieszaniną chloroform-
alkohol izoamylowy (49:1). Następnie DNA precypituje się z etanolem i solą, a resztki soli
usuwa się przez przemywanie sprecypitowanego DNA 70-80% etanolem.



stężenie DMSO powyżej 10% wpływa hamująco na polimerazę DNA – DMSO jest dodawane

do mieszaniny w celu wyeliminowania zjawiska tworzenia struktur drugorzędowych przez
primery;

14. Wymienić i omówić wzmacniacze reakcji PCR

- DMSO - eliminuje tworzenie się struktur drugorzędowych przez primery, obniża T

m

o 5-6 C,

powoduje lepszą denaturację matrycowego DNA

- glicerol - lepsza denaturacja DNA, eliminacja tworzenia się drugorzędowych struktur
primerów i DNA, stabilizuje polimerazę
- formamid - poprawia wierność, powtarzalność, czułość i specyficzność reakcji PCR
- glikol polietylenowy - zwiększa efektywność amplifikacji DNA
- detergent Tween 20 - niweluje niekorzystne działanie SDS

15. Krótko omówić zasady różnicowego i multipleksowego PCR

- różnicowy PCR



Podstawą różnicowego PCR jest możliwość amplifikacji genu targetowego i

fragmentu odnośnikowego w tej samej probówce reakcyjnej.



Taka równoczesna amplifikacja ilościowo określonego fragmentu odnośnikowego i

fragmentu o nieznanej liczbie kopii w jednej probówce może posłużyć do ilościowego
określenia sekwencji targetowej.

- multipleksowy PCR



Metoda ta pozwala na równoczesną amplifikację kilku regionów genomu w jednej

probówce przy zastosowaniu różnych par primerów.



Taka równoczesna amplifikacja więcej niż jednego regionu DNA w jednej mieszaninie

reakcyjnej obniża koszty eksperymentów, oszczędza pracę i czas, a także zmniejsza
ryzyko kontaminacji.



Ta odmiana techniki PCR znalazła szerokie zastosowanie, np. do wykrywania

czynników zakaźnych, diagnostyki chorób genetycznie uwarunkowanych, wykrywania
różnego typu mutacji.

16. Jak zamplifikować DNA o nieznanej sekwencji.



Możliwość specyficznej amplifikacji DNA zależy od tego czy znamy jego sekwencję

nukleotydową. Często jednak dysponujemy matrycowym DNA, którego sekwencja
nukleotydowa jest całkowicie nieznana, a dysponujemy tylko znajomością sekwencji
nukleotydowej pokrewnych genów pochodzących z innych gatunków. W takich
sytuacjach jednak amplifikacja PCR jest również możliwa przy zastosowaniu
zdegenerowanych primerów oligonukleotydowych (tzw. primery uniwersalne).



Inną strategią jest zaprojektowanie primerów na podstawie znajomości sekwencji

aminokwasowej peptydów lub białek. To podejście napotyka trudności ze względu na
zdegenerowanie kodu genetycznego (większość aminokwasów jest kodowana przez
więcej niż jeden kodon). Stąd, primery projektowane na podstawie sekwencji
aminokwasowej powinny być w pełni redundentne. Z tego też względu na ogół
stosuje się krótkie primery, np. stosunkowo krótki primer złożony z 15 nukleotydów
ma już 512 różnych permutacji.



Pewnym rozwiązaniem w amplifikacji nieznanych sekwencji jest zastosowanie

uniwersalnej zasady jaką jest inozyna, którą można podstawić w miejscach
okupowanych przez 3 lub 4 różne zasady. Inozyna jest zasadą purynową, naturalnie
występującą w rzadko występującym nukleotydzie pewnych rodzaji tRNA i ma
zdolność parowania z wszystkimi czteroma podstawowymi zasadami (A, C, G, T). Nie
zaleca się stosowania inozynowych nukleotydów przy końcu 3' primera.



Zastosowanie wysoce zdegenerowanych primerów do reakcji PCR nie wymaga

żadnych specyficznych warunków reakcji, chociaż obniżenie temperatury dołączania
primerów może być konieczne w niektórych przypadkach.

17. Krótko opisać jedną z możliwych metod tworzenia mutacji punktowych techniką PCR
Stosując PCR można wytworzyć delecję, jak również mutację punktową. Najpierw projektuje się parę
starterów, które mają sekwencję zmienioną w stosunku do matrycy poddawanej mutacji i których
sekwencje na odcinku co najmniej 20 nukleotydów są komplementarne. Jeśli DNA, który ma być
mutowany, jest zawarty w standardowym wektorze, zawierającym standardowe miejsca dla
starterów (takie jak miejsca promotorowe dla polimeraz SP6 i T7 w wektorze pGEM), to mogą być
one wykorzystywane w kombinacji z
mutagennymi starterami. Przeprowadza się wtedy dwie oddzielne reakcje PCR: jedną z
zastosowaniem startera SP6 i tzw. "odwróconego" startera, dzięki czemu amplifikuje się 5' fragment
insertu i drugą, z zastosowaniem startera "wprost" i startera dla polimerazy T7 do amplifikacji 3'
fragmentu insertu. Po oczyszczeniu 2 produktów PCR, zmieszaniu i kolejnej amplifikacji z udziałem
starterów SP6 i T7 powinien powstać produkt w postaci zmutowanej cząsteczki o pełnej długości.
Nastąpi to wtedy, kiedy
nić 5' połączy się komplementarnym fragmentem na zasadzie hybrydyzacji z nicią 3' i zacznie
wydłużać.

18. Wymienić metody klonowania produktów PCR do wektora plazmidowego i wskazać

uzasadniając najbardziej efektywną.



klonowanie do wektorów ciętych enzymami tnącymi na tępo



klonowanie do wektorów ciętych enzymami tnącymi na lepko

Najbardziej efektywną metodą jest klonowanie do wektorów ciętych enzymami tnącymi na lepko, w
szczególności klonowanie kierunkowe osiągane przez użycie 2 różnych enzymów. Można również
usunąć grupę fosforanową zapobiegając łączeniu się 2 lepkich końców wektora w całość.

19. Inicjacja replikacji chromosomu E.coli
Chromosom E. coli posiada jedno origin replikacji. Inicjacja rozpoczyna się od oriC, czyli origin of
Chromosomal replication. Sekwencja ta jest posiada region bogaty w AT, DnaA box, GATC
metylowane miejsca. Białka DnaA podłączają się do DnaA box i otwierają region bogaty w pary AT.
Podłączają się helikazy które rozdzielają obie nici DNA, tworząc dwa widełki replikacyjne. Białka
wiążące pojedyńczą nić stabilizują pojedyncze nici DNA, do których podłącza się polimeraza.

20. Inicjacja transkrypcji z promotora procariotycznego
Promotory transkrypcji
Są to sekwencje DNA, które "promują" ekspresję genów. Dokładniej wskazują miejsce inicjacji
transkrypcji. Znajdują się zwykle „w górę” od miejsca, gdzie zaczyna się faktyczna transkrypcja genu.
Zasady w sekwencji promotora są numerowane w stosunku do miejsca startu transkrypcji.
U Prokariota składają się z: sekwencji -35, przerwy 16-18pz, sekwencji -10 (TATA, Pribnowa).

Dla wielu genów bakteryjnych, istnieje korelacja między tempem transkrypcji, a zgodnością sekwencji
konsesusoowej. Różnice między promotorami różnych genów decydują o różnej wydajności
transkrypcji i biorą udział w jej regulacji.

RNA polimeraza składa się z czynnika sigma (σ) i rdzenia (podjednostki α

2

ββ’). Holoenzym ten

podłącza się luźno do DNA. Przemieszcza się po nici DNA, dopóki nie napotka regionu
promotorowego. Kiedy to się stanie czynnik sigma rozpoznaje sekwencję -35 i -10. W ten sposób
powstaje zamknięty kompleks. Następnie formowany jest otwarty kompleks, kiedy TATAAT box ulega
rozwinięciu. Tworzy się krótki odcinek RNA w otwartym kompleksie oraz następuje uwolnienie sigma
faktora – znak końca inicjacji transkrypcji.

21. Inicjacja translacji



U prokariotów
Inicjacja translacji wymaga mRNA, małej i dużej podjednostki rybosomu, czynników inicjacji
translacji (3), GTP jako źródła energii, oraz inicjatorowego aminoacylo-tRNA (ze związanym
aminokwasem formylometioniną). Czynnik IF3 jest inicjatorem podłączenia się podjednostki
30S do mRNA. Zachodzi podłączenie podjednostki 30S poprzez sekwencję Sine-Dalgarno,
która jest komplementarna do 16S rRNA. Czynnik IF2 promuje wiązanie się inicjatorowego
tRNA. Po podłączeniu dochodzi do uwolnienia obu czynników (IF3 i IF2) i dochodzi do
podłączenia podjednostki 50S. W rybosomie są trzy miejsca, w których może znajdować się
tRNA: miejsce A, przez które wchodzi aminoacylo-tRNA (z wyjątkiem pierwszego aminoacylo-
tRNA - fMet-tRNA, które wchodzi przez miejsce P), miejsce P, gdzie tworzy się peptydylo-
tRNA, oraz miejsce E, przez które tRNA opuszcza rybosom po oddaniu aminokwasu.
Utworzenie się kompleksu 70S jest znakiem końca inicjacji.



U eukariotów
U eukariontów tworzenie kompleksu inicjacyjnego jest podobne do tego u bakterii, z tym, że
wymagane są dodatkowe czynniki (zwane eIF). Inicjatorowym tRNA jest tRNA

met

(związany

raczej z metioniną niż formylometioniną). Kodonem startowym jest zwykle AUG. Zwykle
pierwsze AUG po 5 'Cap. Ponieważ sekwencje AUG występują także w środku nici, kodon
starterowy powinien się czymś wyróżniać. Sekwencja konsensusu dla optymalnego
rozpoznawania kodonu startowego wygląda następująco (Są to zasady Kozaka):

Inicjację translacji u eukariotów można podsumować w następujący sposób:

 czynniki inicjacji wiążą się do 5 'cap w mRNA
 są połączone przez kompleks składający się z podjednostki 40S, tRNA

met

i innych

czynników inicjacji

 cały kompleks przemieszcza się wzdłuż mRNA i szuka kodonu start
 gdy znajdzie AUG to 40S podjednostka się z nim wiąże
 dołącza się podjednostka 60S
 tworzy to kompleks inicjacji 80S

22. Klonowanie molekularne do plazmidów serii pUC
Plazmidy z serii pUC zawierają gen oporności na ampicylinę oraz sekwencje regulatorowe i N-
końcowy fragment β-galaktozydazy (O-operon, P-promotor oraz pierwsze 58 aminokwasów genu
lacZ – α-peptyd).
Identyfikacja kolonii bakteryjnych zawierających plazmidy rekombinowane w przypadku klonowania
fragmentów DNA do wektorów z serii pUC opiera się ona na porównaniu barwy otrzymanych kolonii.
Kolonie rekombinowane są koloru białego. Kolonie nierekombinowane są niebieskie. Plazmidy z serii
pUC posiadają N-końcową resztę genu B-galaktozydazy (LacZ). Miejsce rozpoznania dla enzymów
restrykcyjnych znajduje się w obrębie tego genu. Wklonowanie inseratu powoduje przerwanie
ciągłości genu, przez co zawarty w podłożu substrat (X-gal) nie jest hydrolizowany – zmiana ramki
odczytu. Dodatkowo plazmidy z serii pUC posiadają gen oporności na ampicylinę (amp), który jest
dodatkowym markerem selekcyjnym. Wyrosną tylko te kolonie, które posiadają plazmid, ponieważ
wyjściowe szczepy, przed transformacją, nie posiadały oporności na ten antybiotyk. Wyrosną tylko
kolonie zawierające plazmid pUC. W przeciwieństwie do identyfikacji kolonii bakteryjnych
zawierających wektory z serii pBR 322, ta identyfikacja jest jednoetapowa.

23. Sposoby amplifikacji nieznanego DNA metodą PCR (to co w pytaniu 16)
24. Zasady postępowania w konstrukcji szczepionek DNA



Wybranie bakteryjnego ori replikacji

 zapewnia dużą liczbę kopii plazmidowego DNA w komórce bakteryjnej



Dobranie prokariotycznego markera selekcyjnego

 umożliwia łatwą identyfikację komórek bakteryjnych transformowanych

DNA plazmidowym



Wektor posiada miejsce wielokrotnego klonowania (MCS)

 umożliwia łatwe wprowadzenie genu kodującego antygen w obręb DNA

plazmidowego



Wektor posiada elementy regulujące transkrypcję w organizmach eukariotycznych

 silne promotory pochodzenia eukariotycznego lub wirusowego

 eukariotyczne lub wirusowe terminatory transkrypcji zapewniające

poliadenylację mRNA

25. DNA szczepionki ( zalety i wady w por. z innymi szczepionkami)

ZALETY:



wywołują zarówno humoralną jak i komórkową odpowiedź immunologiczną



uzależniona od rodzaju kodowanego antygenu



uzależniona od poziomu ekspresji antygenu w komórce docelowej



brak możliwości wywołania infekcji



zawierają geny kodujące określone antygeny białkowe lub sekwencje kodujące

determinanty antygenowe



Możliwość stosowania jako szczepionki skojarzone lub poliwalentne

 kilka plazmidów kodujących różne antygeny
 jeden plazmid kodujący kilka antygenów



Możliwość dostarczania DNA do organizmu różnymi sposobami



Łatwa formulacja szczepionek

 brak konieczności stosowania adiuwantów, substancji konserwujących i

stabilizujących



Stabilność termiczna

 liofilizowane lub sprecypitowane DNA można bardzo długo

przechowywać w temperaturze pokojowej



Niski koszt produkcji

 możliwość produkcji dużych ilości plazmidowego DNA w komórkach

bakteryjnych

 łatwa i tania procedura oczyszczania plazmidowego DNA - liza alkaliczna

WADY:



możliwość wywołania choroby autoimmunologicznej:

- indukcja produkcji autoprzeciwciał skierowanych przeciwko komórkom, w których
następuje biosynteza obcego antygenu



możliwość integracji DNA plazmidowego z ludzkim DNA

26. Metody iniekcji szczepionek DNA



domięśniowo (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej)

 wydajność dostarczania DNA wzrasta, jeżeli jest podawane do

regenerujących się mięśni



śródskórnie (iniekcja; DNA w roztworze soli fizjologicznej)



dożylnie (iniekcja, DNA wewnątrz liposomów)



przez błony śluzowe
 donosowo; DNA w roztworze soli fizjologicznej, w postaci aerozolu
 doustnie; mikrokapsułki z biodegradowalnych polimerów zawierające DNA



przez skórę

 skaryfikacja; DNA w roztworze soli fizjologicznej
 dostarczanie za pomocą pistoletu genowego, cząsteczki złota opłaszczone DNA

(DNA dostarczane bezpośrednio do wnętrza komórek)

27.

Szczepionki białkowe i atentowane

Szczepionki to produkty farmakologiczne pochodzenia biologicznego zawierające jeden lub więcej
czynników wywołujących reakcję układu immunologicznego. W lecznictwie stosuje się je w celach
profilaktycznych oraz leczniczych.

Białkowe- Antgeny lub epitopy antygenów danego patogenu albo też egzotoksyny. Wykorzystują
fakt, że do wywołania reakcji immunologicznej wystarczą jedynie pewne elementy strukturalne
patogenu. Uzyskiwane są w różnych systemach ekspresyjnych (bakteryjnych czy roślinnych). Peptydy
najczęściej połączone są z nośnikiem białkowym lub w postaci białek fuzyjnych, co chroni przed
strawieniem. W skład tych szczepionek wchodzą m. in. białka otoczki wirusów lub polisacharydy
otoczek bakteryjnych. Egzotoksyny trzeba unieszkodliwiać działając na nie formaldehydem, aby
straciły właściwości toksyczne.
Wady:



wymagają dawek przypominających,



słabsza immunogenność



nie trzeba hodować mikroorganizmów chorobotwórczych w celu izolacji antygenów

szczepionkowych

Zalety:



Zmniejszone ryzyko powikłań



Brak możliwości wywołania choroby



Niska odczynowość



Nie wymagają adiuwantów



Atenuowane- zawiera żywe drobnoustroje (wirusy lub bakterie) pozbawione właściwości
chorobotwórczych(wirulentnych). Atenuacja jest procesem polegającym na wielokrotnym
pasażowaniu określonego szczepu, namnażanego w nietypowych warunkach.
Wady:



Może nastąpić rewersja do formy zjadliwej



Może zwierać śladowe ilości antygenów z podłoża hodowlanego (zarodków kurzych lub

zakażonych wirusem linii komórkowych)

Zalety:



W wyniku szczepienia dochodzi do namnażania się drobnoustroju w organizmie- symulacja

naturalnego zakażenia, więc pobudzenie odpowiedzi komórkowej i humoralnej.



Są bardziej immunogenne, dają większą odporność

28.

Korzyści ze stosowania szczepionek DNA

Szczepionka DNA to zazwyczaj kolisty plazmid zawierający geny kodujące antygeny konkretnych
patogenów, przeciwko którym chcemy uzyskać odporność. Wszczepiony do ciała pacjenta prowadzi
do ekspresji genów, które zawiera, produkcji białek i wywołania odpowiedzi immunologicznej, dając
dzięki temu odporność przeciwko konkretnym antygenom.
Konstrukcja szczepionek genowych



pobranie z patogenu genu, który koduje antygen



„wklejenie” tego genu do wektora plazmidowego metodami inżynierii genetycznej

Szczepionki DNA dają możliwość syntezy łańcuchów złożonych z szeregu różnych epitopów, które są
zbyt długie, by uzyskać je na drodze syntetycznej

Zalety:



są bezpieczne



wywołują silną odpowiedź immunologiczną – wystarczy jedna dawka szczepionki



mogą wywoływać odporność na różne szczepy tego samego patogenu



mogą zapewnić odporność przeciwko kilku szczepom patogenów jednocześnie



są przydatne w uodparnianiu niemowląt - zawodzą tu tradycyjne szczepionki

(immunoglobuliny pochodzące od matki wiążą drobnoustroje ze szczepionek)



łatwa i tania produkcja



możliwość dostarczania w różnymi sposobami

(domięśniowo, śródskórnie(iniekcja),dożylnie (kompleksy DNA-lipid; iniekcja), przez błony
śluzowe, donosowo (w postaci aerozolu), doustnie (mikrokapsułki z biodegradowalnych
polimerówzawierające DNA), przez skórę, kuleczki złota opłaszczone DNA (bezpośrednio do
wnętrza komórek)



są trwałe, termo stabilne



nie ma możliwości wywołanie infekcji

Wady:



nie są efektywne przeciwko antygenom zawierającym reszty cukrowcowe, ponieważ mogą

kodować jedynie polipeptydy, nie są więc bardzo efektywne przeciwko wszystkim
patogenom



możliwość integracji DNA plazmidowego z ludzkim DNA



możliwość wywołania choroby autoimmunologicznej – indukcja produkcji autoprzeciwciał

skierowanych przeciwko kom., w których następuje biosynteza obcego antygenu

29.

Regulacja ekspresji genów w operonie laktozowym

E. coli normalnie produkuje



-galaktozydazę. Produkcja jest pod kontrolą operonu laktozowego (the

lac operon). Wszystkie geny są pod kontrolą jednego promotora.
Istnieją dwie odrębne jednostki transkrypcyjne:
1. Rzeczywisty operonu lac:



elementy DNA

Promotor- Wiąże polimerazy RNA
Operator - wiąże białka represora lac (między -5 i+21)
CAP- site Wiąże Catabolite Activator Protein (CAP)



genów strukturalnych ( których zorganizowanie daje produkt policistronowy mRNA)

lacZ -Koduje b-galaktozydazy

o Enzymatycznie rozszczepia laktozę i analogi
o konwertuje laktozę do allolaktozy (izomer)



Lac Y – koduje permeazę laktozową

o białka błonowego wymagane do transportu laktozy



Laca A- Koduje transacetylazy

o Kowalencyjnie modyfikuje laktozę i analogi
o Funkcjonalna konieczność nie jest do końca wyjaśniona

2. Gen lacI



Nie jest częścią operonu lac



Miejsce operatorowe O

lac

(28pz o sekwencji palindromowej)



Ma swój własny promotor- promotor i



Konstytutywna ekspresja na dość niskim poziom



Koduje lac represor



Lac represor funkcjonuje jako białkowy tetramer (dopasowuje się do palindromowej

sekwencjo O

lac

)



Do represji operonu laktozowego jest potrzeba tylko niewielka ilość białka



Tylko niewielka ilość białka jest potrzebna do powstrzymania operonu lac

W obecności laktozy:

Przy braku laktozy:

System warunkuje szybki wzrost stężenia beta-
galaktozydazy. Induktorem może być laktoza lub
IPTG. Po dodaniu laktozy beta-galaktozydza
konwertuje ją do allolaktozy, która jest
właściwym induktorem i wiąże się do represora i

system utrzymuje stały niski poziom beta-
galaktozydazy. Laktoza nie blokuje represora,
wiąże się on zatem do miejsca operatorowego
uniemożliwiając tym samym związanie się
polimerazy RNA, brak transkrypcji.

redukuje jego powinowactwo do operatora lac.
Zatem polimeraza RNA może się przyłączyć do
promotora i rozpocząć transkrypcję genów.
Promotor P

lac

nie jest silnym promotorem, nie ma silnej sekwencji -35. Do wydajnej transkrypcji

wymagają białka aktywującego- receptorowego białka cAMP (CRP=CAP). Glukoza zmniejsza
zawartość cAMP w komórce, wtedy CRP wiąże się z cAMP i taki kompleks wiąże się do Promotora lac
tuż powyżej miejsca wiązania polimerazy RNA. Przyłączenie CRP wzmacnia transkrypcję 50 krotnie.

30.

Budowa tRNA

transportujący RNA − najmniejsza cząsteczka (74-95nt) RNA, której zadaniem jest przyłączanie
wolnych aminokwasów w cytoplazmie i transportowanie ich do rybosomów, gdzie wykorzystywane
są w translacji. Każdy aa może być transportowany przez jeden, a niektóre przez kilka różnych tRNA.
Kompleks tRNA-aminokwas nosi nazwę aminoacylo-tRNA. Jest 20 rodzajów tRNA.
Cząsteczka tRNA:



drugorzędowa struktura przyjmuje kształt czterolistnej koniczyny/kształt palczasty. Ramiona

są dwuniciowe w postaci spiralnie skręconej, a na końcach znajdują się jednoniciowe pętle.
Część fragmentów jest jednakowa we wszystkich tRNA, część jest różna-decyduje o
specyficzności.



ma 3 pętlowe regiony zmienne



na końcu 3’ nici region akceptorowy CCA



ma pętlę antykodonową- najważniejsze miejsce pod względem pełnionej funkcji- -

odpowiedzialna za rozpoznanie i związanie z kodonem w mRNA. Rozpoznaje
komplementarny tryplet nukleotydów tworzących kodon, na cząsteczce mRNA (w taki sposób
następuje odczyt informacji genetycznej).

Oprócz normalnych nukleotydów U, G i C zawiera też zmodyfikowane nukleotydy, może ich być
nawet 60. Zasady rzadkie znajdują się przede wszystkim we fragmentach jednoniciowych.
Zmodyfikowane zasady to: I = inosine, mI = methylinosine, T = ribothymidine, UH

2

= dihydrouridina,

m

2

G = dimethylguanosine,

= pseudouridine

tRNA odgrywają bezpośrednią rolę w rozpoznawaniu kodonów w mRNA. tRNA transportuje aa na
rybosomy. Wiązanie aa przez tRNA ma miejsce poprzez antykodon- sekwencję komplementarną do
kodonów w mRNA.

Struktura trzeciorzędowa wiąże się z dodatkowymi elementami składowymi. Formuje ją 9 wiązań
wodorowych tzw. trzeciorzędowych. Składa się w literę” L”.

31.

Klonowanie kierunkowe DNA do plazmidu pBR322

Klonowanie kierunkowe osiągane jest poprzez użycie końców lepkich, ale 2 różnych! (w
przeciwieństwie do klonowania niezdefiniowanego w kierunku wstawiania insertów- w końce tępe
lub dwa lepiej identyczne).

Klonowanie kierunkowe:
jednokierunkowe ‘tandemy genowe’(czyli powielone te same geny, pozwala to zwielokrotnić
ekspresję) z użyciem enzymów: restrykcyjnych
CTCGG

GAATTC

TCGGG

EcoRI

AvaI

Klonowanie kierunkowe w przypadku pBR322 będzie wymagało użycia enzymu trawiącego na lepko
w konkretnym miejscu pBR322. W zależności, gdzie chcemy wklonować insert taki enzym
wybierzemy najpierw. Przykładowo w genie kodującym tetracyklinę jest miejsce rozpoznania dla
enzymu BamHI, który tworzy lepkie końce G/GATCC (jednocześnie zyskujemy możliwość łatwiej
identyfikacji rekombinantów dzięki utracie oporności na tetracyklinę). Następnie działamy wg
schematu przedstawionego wyżej- DNA Pol I, dodajemy linker dla enzymu nie występującego w
plazmidzie bBR322 (np. sekwencję dla MstII CC/TNAGG lub dla NotI GC/GGCCGC) i ligujemy ligazą
faga T4. Tym sposobem uzyskujemy dwie sekwencje dające w bliskiej odległości różne lepkie końce.

32.

Sposoby klonowania produktów PCR uzyskanych za pomocą polimerazy Taq

(to pytanie raczej nie jest do końca dobrze)
Polimeraza Taq
Źródłem enzymu są bakrterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E.coli. Enzym jest
funkcjonalnie podobny do DNA polimerazy I z E.coli. Cenną jego właściwością jest termostabilność w
zakresie temperatur 37-94

o

C, a optimum wykazuje przy 90

o

C.

5’ 3’ DNA-zależna polimeraza DNA, wymaga do aktywności matrycy ssDNA oraz primera DNA lub
RNA z końcem 3’OH.
5’  3’ egzonukleaza, degraduje od 5’P końca dsDNA lub hybryd DNA-RNA.
Zastosowanie:

 Amplifikacja przez PCR
 W sekwencjowaniu DNA metodą Sangera
 W genomowym ‘footprintingu”

Przy klonowaniu tą polimeraza należy uważać, gdyż nie posiada ona aktywności korektorskiej, czyli
egzonukleolitycznej w kierunku 3’ 5’. Popełnia więc on sporo błędów. Enzym ten nie pozostawia
tępych końców, często na końcu 3’ dodaje jedną lub dwie A.

33.Enzymy restrykcyjne klasy II s charakterystyka i zastosowanie

Zastosowanie w inżynierii genetycznej mają tylko te z klasy II. Enzymy należące do klasy II są
aktywowane in vitro przez Mg2+, a substratem jest dwuniciowy DNA, który posiada
kilkunukleotydową (zwykle 4-8nt) sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym.
Enzymy klasy IIS- inaczej sziftery. Przecięcie obu nici zachodzi w pobliżu sekwencji specyficznie
rozpoznawanej, a produktem hydrolizy jest standardowo DNA z końcem 3’OH oraz 5’P.
Enzymy należące do klasy IIS rozpoznają sekwencje asymetryczne i trawią poza sekwencją
rozpoznania w ściśle zdefizniowanej odległości 1-20 pz. Ze względu na asymetryczny charakter
sekwencji podlega ono modyfikacji przez dwie różne metylazy specyficzne dla obu nici.

KLASA IIS
MboII (Moraxella bovis)

GAAGA(N)

8/7

SfaNI (Streptococcus faecalis ND547)

GCATC(N)

5/9

FokI

GGATGN

9/13

Zastosowanie:



Tworzenie specyficznych delecji



Użyteczne w analizie restrykcyjnej

34. PCR w badaniach epidemiologicznych

Diagnostyka molekularna, oparta o metody analizy materiału genetycznego (w tym techniki PCR),
znajduje szerokie zastosowanie do różnicowania mikroorganizmów, np. w badaniach
epidemiologicznych zakażeń szpitalnych. Wszędzie tam gdzie jest to możliwe i opłacalne, diagnostyka
klasyczna zostaje zastąpiona lub uzupełniona przez amplifikację charakterystycznego dla patogenu
fragmentu DNA w tzw. diagnostyce molekularnej.
Dzięki technice PCR uległa zwiększeniu czułość i specyficzność badań diagnostycznych.
Wprowadzenie do diagnostyki medycznej PCR uprościło również procedury badawcze umożliwiając
ich automatyzację i powstanie szeregu handlowo dostępnych testów.

Badania epidemiologiczne obejmują:



Różnicowanie lub inaczej typowanie mikroorganizmów, które ma ogromne znaczenie w

mikrobiologii medycznej.



Służy ono badaniu ich epidemiologii, czyli m. in. ekologicznych zachowań drobnoustrojów i

dróg ich rozprzestrzeniania.



Określanie unikalnych cech organizmów za pomocą typowania umożliwia badanie kolonizacji

i zakażeń szpitalnych, a także pozwala na wyznaczanie powiązań filogenetycznych między
mikroorganizmami.



Wyniki takich badań mogą być podstawą do wprowadzenia środków zapobiegawczych i

działań sanitarnych, mających ograniczyć rozprzestrzenianie się zakażeń szpitalnych i
związanej z nimi lekooporności.

Metody genotypowe najczęściej stosowane do badań epidemiologicznych to:



Rybotypowanie



elektroforeza pulsacyjna genomu ciętego rzadko tnącymi enzymami restrykcyjnymi (PFGE)



ustalanie sekwencji nukleotydowej specyficznego regionu w genomie, różne odmiany

techniki PCR fingerprinting najważniejsze.

Cechy efektywnej metody typowania szczepów:

• Wysoki stopień dyskryminacji

• Powtarzalność

• Zdolność do typowania wszystkich szczepów

• Prosta w użyciu

• Szybkość

• Mało kosztowna

• Wystandaryzowana

I. Analiza restrykcyjna chromosomalnego DNA połączona z elektroforezą pulsową (RFLP-

PFGE)

Technika ta polega na poddaniu nienaruszonego totalnego DNA genomowego trawieniu
enzymatycznemu z zastosowaniem restryktaz. Liczba i wielkość otrzymanych fragmentów DNA
determinowana jest przez długość sekwencji rozpoznawanej przez określony enzym restrykcyjny oraz
charakter trawionego DNA (% zawartości par zasad GC w stosunku do AT).



W wyniku trawienia otrzymujemy fragmenty DNA o wielkościach od ok. 0.5 kpz do 1000 kpz.



Rozdziału otrzymanych fragmentów restrykcyjnych dokonuje się w agarozowej elektroforezie

pulsowej (ang. PFGE – Pulsed Field Gel Elektrophresis).



Analiza polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych możliwa dzięki elektroforezie

pulsowej powoli staje się metodą standardową w epidemiologii szpitalnej.

WADY:



Trudna w wykonaniu, kosztowna, wymaga skomplikowanej aparatury i zachowania stałych

warunków analizy.



Częste zachodzenie i pokrywanie się fragmentów DNA o zbliżonej wielkości, co powoduje, iż

otrzymany obraz elektroforetyczny staje się trudny do interpretacji.



Otrzymane wzory restrykcyjne mogą również zostać zafałszowane przez fragmenty

pochodzące z plazmidowego DNA, izolującego się łącznie z DNA chromosomalnym.

ZALETY:



Wszystkie szczepy są typowalne.



Pozwala na

całkowitą dyskryminację
szczepów bakteryjnych

II. RYBOTYPOWANIE



W związku z funkcją rybosomów w każdym organizmie, a także ich kompleksową naturą,

geny kodujące rRNA, ułożone w operon rrn, obecne są we wszystkich organizmach
bakteryjnych i są wysoko konserwowane ewolucyjnie.



Geny te odpowiedzialne są za syntezę 16S, 23S i 5S rRNA. Ich wysoka konserwacja przejawia

się w sekwencji nukleotydowej, a także w strukturze pierwszo- i drugorzędowej.



Geny kodujące poszczególne rodzaje rRNA rozdzielone są regionami polimorficznymi, które

charakteryzują się wysokim zróżnicowaniem pod względem sekwencji i wielkości.

Te cechy genów rDNA czynią z nich dobry molekularny zegar do studiów nad pokrewieństwem
filogenetycznym, nawet odległych od siebie organizmów.

Różnicowanie bakterii z zastosowaniem metod rybotypowania można przeprowadzić przy użyciu
różnych technik, głównie: z wykorzystaniem metod hybrydyzacyjnych lub PCR.
Metody oparte o hybrydyzacje:
rrn RFLP (RFLP zhybrydyzowanego z sondą rDNA (rrn loci)):



Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.



Elektroforeza i transfer rozdzielonych fragmentów DNA na filtr.



Hybrydyzacja z sondą komplementarną do rDNA.

Oparte na technice PCR:
ITS PCR (Polimorfizm długości produktów PCR)



PCR regionu zmiennego między rrs-rrl rDNA



Elektroforetyczny rozdział produktów PCR



Obserwacja produktów wybarwionych bromkiem etydyny w świetle UV

ARDRA (RFLP produktów amplifikacji regionów operonu rrn)



Amplifikacja określonego fragmentu operonu rrn:

-

regionu zmiennego pomiędzy genami kodującymi 16S i 23S rRNA,

-

regionu zmiennego wewnątrz genu kodującego RNA,

-

regionu zawierającego geny kodujące 16S i 23S rRNA oraz fragment polimorficzny

pomiędzy nimi,
- regionu zawierającego geny kodujące tRNA.



Trawienie otrzymanych produktów enzymamirestrykcyjnymi.



Elektroforetyczny rozdział produktów PCR.



Obserwacja produktów wybarwionych bromkiem etydyny w świetle UV.



PCR regionu zawierającego gen kodujący 16S rRNA



Sekwencjonowanie otrzymanych produktów PCR.

III. Amplifikacja znanych regionów genomu połączona z analizą restrykcyjną (PCR/RFLP)



Jako cel molekularny w łańcuchowej reakcji polimerazy stosuje się fragment DNA specyficzny

dla danego gatunku lub kilku gatunków spokrewnionych o podobnym znaczeniu klinicznym.



Uzyskane produkty amplifikacji można następnie poddać trawieniu enzymami restrykcyjnymi.

W wyniku restrykcyjnego cięcia produktów PCR otrzymuje się specyficzny polimorfizm
długości fragmentów restrykcyjnych dla danego DNA (RFLP).



Połączenie obu technik (PCR i RFLP) pozwala na różnicowanie blisko spokrewnionych

organizmów lub szczepów. Wybór odpowiedniej restryktazy jest podyktowany przez
charakter produktu amplifikacji.

IV. PCR fingerprinting



Istnieje wiele różnorodnych metod PCR fingerprinting, ale zasadniczo ich wspólnym celem

jest powielenie polimorficznego regionu DNA w reakcji PCR z zastosowaniem odpowiednio
dobranych starterów.



Jedna ż metod PCR fingerprinting wykorzystuje istnienie repetytywnych sekwencji w

genomach mikroorganizmów (bakterii, grzybów i pasożytów). Sekwencje te charakteryzują
się określoną długością i są szeroko rozpowszechnione w genomie. U bakterii zostały one
najwcześniej wykryte i dobrze scharakteryzowane dla Escherichia coli i Salmonella
typhimurium. Przykładem tego typu sekwencji są REP (ang. Repetitive Chromosomal
Elemets) o długości 38 pz i ERIC (ang. Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) o
długości 124-127 pz, występujące u bakterii Gram ujemnych.

V. AFLP (ang. Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP, łączy w sobie dwie metody:RFLP i selektywną amplifikację PCR



Strategia metody złożona jest z czterech podstawowych etapów:



trawienie totalnego DNA komórkowego z zastosowaniem dwóch racjonalnie dobranych

enzymów restrykcyjnych;



reakcja ligacji otrzymanych fragmentów z odpowiednio zaprojektowanymi adaptorami;



selektywna amplifikacja produktów ligacji z zastosowaniem dwóch starterów

homologicznych do sekwencji adaptor-miejsce restrykcyjne;



elektroforeza produktów amplifikacji i autoradiografia otrzymanych rozdziałów

elektroforetycznych.

W odróżnieniu od metod rybotypowania i analizy RFLP produktów PCR, AFLP opiera się na analizie
całego genomu bakteryjnego.
Zaletami metody AFLP są powtarzalność i wysoki stopień dyskryminacji badanych organizmów.

AFLP okazała się niezmiernie przydatnym narzędziem taksonomicznym ze względu na możliwość
komputerowej analizy otrzymanych wyników oraz stworzenia na ich podstawie komputerowej bazy
danych.

Jednakże, AFLP nie jest użyteczna w szybkiej identyfikacji szczepów, ale jest niezmiernie przydatna w
studiach dotyczących fundamentalnych pytań odnośnie pokrewieństwa klonalnego szczepów.

Zadaniami na najbliższą przyszłość dla bakteriologii klinicznej wydają się być:
(1) wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych i nowych podłóż wybiórczych dla szybkiej
identyfikacji bakterii endemicznych (wywołujących zakażenia szpitalne), a także szybkich testów
różnicujących z ustaleniem wzorca oporności;
(2)

stworzenie ośrodków referencyjnych zajmujących się drobnoustrojami mającymi zasadnicze

znaczenie w zakażeniach szpitalnych (ustalanie genotypów szczepów endemicznych);
(3) wprowadzanie nowych technik mikrobiologicznych służących do bezpośredniego wykrywania
drobnoustrojów z materiałów diagnostycznych w rutynowej praktyce (np., PCR);

(4) badania technikami genetyki molekularnej izolatów w celu identyfikacji szczepów
endemicznych występujących w szpitalu (regionie).

35. Enzymy restrykcyjne

Enzymy restrykcyjne=endonukleazy restrykcyjne=restryktazy. Po raz pierwszy zostały wyizolowane z
bakterii ponad 30 lat temu. Są izolowane z bakterii lub sinic. Wchodzą w skład systemu modyfikacji-
restrykcji bakterii. Przeprowadzają sekwencyjnie zależną hydrolizę wiązań fosfodiestrowych w
obrębie obu nici DNA w efekcie czego następuje przecięcie cząsteczki DNA. Otrzymywane fragmenty
DNA nie są losowe, ale w każdym prążku na żelu po elektroforezie znajdują się cząsteczki DNA o
identycznej sekwencji nukleotydowej. Z reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA.
Istnieją jednak wyjątki - tzw. izoschizomery - enzymy izolowane z różnych organizmów, ale
rozpoznające te same sekwencje. Zdarza się także, że dwa enzymy wytwarzają takie same lepkie
końce, mimo rozpoznawania różnych sekwencji DNA. Umożliwia to klonowanie DNA strawionego
jednym enzymem w wektorze strawionym innym, dającym takie same lepkie końce.
Najpopularniejsze pary enzymów pozostawiających komplementarne końce to:

• BamHI

G’GATC’C

• BglII

A’GATC’T

• BstYI (XhoII) G/A’GATC’C/T
• BclI

T’GATC’A

• Sau3AI

‘GATC’



W wyniku trawienia restryktazami powstające końce mogą być lepkie lub tępe (gdy nacięcia

w obu niciach leżą naprzeciwko siebie).

tępe końce - nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane z
komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu;
lepkie końce - 3` lub 5`ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone przez niesymetryczne
cięcie, komplementarne do podobnych tworzonych w innych cząsteczkach DNA przez te same
enzymy restrykcyjne niezależnie od źródła DNA, co pozwala na łączenie DNA w reakcji ligacji nawet
bardzo różniących się gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.



Stosuje się specyficzne nazewnictwo. Pierwsza litera oznaczają przynależność rodzajową,

druga i trzecia gatunkową bakterii, z której wyizolowano enzym, kolejna odnosi się do
szczepu lub typu, a koleje to numer enzymu z danego szczepu, np. EcoRI- Escherichia coli
szczep RI.

Na podstawie liczby i organizacji wchodzących w ich skład podjednostek, wymagań dotyczących
kofaktorów , mechanizmu enzymatycznego, specyficzności rozpoznawanej sekwencji, regulacji
ekspresji genów kodujących enzymy dzielimy na trzy grupy: I, II, III.

I- Ich aktwność in vitro zależy od ATP, S-adenozynometioniny i Mg2+, substratratem jest

dwuniciowy DNA zawierające zdefiniowaną sekwencję kilkunastunukleotydową, którą
enzym rozpoznaje i nacina obie nici w pewnej odległości.

II- Do tej grupy należą enzymy: białka proste w postaci dimerów i tetramerów (odpowiadające

im metylazy to białka monomeryczne) aktywowane są in vitro przez Mg2+, substratem
jest dwuniciowy DNA zawierający kilkunukleotydową (4-, 6-, 8-nukleotydową) sekwencje

specyficzną, przecięcie zachodzi w jej obrębie (lub w jej pobliżu- klasa IIS). Aktywność
metylazy i endonukleazy rozdzielone są między dwa białka. Są najważniejsze w inż. gen.!

KLASA II
Tępe końce

HaeI (Haemophilus aegyptus)

GG/CC

SmaI (Serratia marcescens)

CCC/GGG

Lepkie końce

EcoRI (Escheriachia coli)

G/AATTC

HindIII (Haemophilus influenzae)

A/AGCTT

BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H)

G/GATCC

III- Aktywowane przez Mg2+ i ATP, pewne ich własności katalityczne ujawniają się w obecności

S-adenozylometioniny, ale nie jest ona niezbędna do katalitycznej reakcji.

Aktywność restryktaz zależy także od stężenia soli NaCl z buforu do trawienia.
Zastosowanie w inżynierii genetycznej mają tylko te z klasy II. Do tej pory poznano łącznie 3500
restryktaz klasy II i IIS wykazujących 241 sekwencji rozpoznania. Stanowi to 98% wszystkich
poznanych restryktaz. Wszystkie enzymy pozostawiają po trawieniu gr. P na 5’końcu i gr.OH na
3’końcu. Sekwencje rozpoznania dla restryktaz mają zwykle strukturę palindromiczną- co oznacza, że
sekwencja czytana z obu nici jest jednakowa.
Specyficzne metylotransferazy odpowiadające enzymom klasy II wymagają jako kofaktora S-
adenozynometioniny (metylofransferazy są to białka monomeryczne). Wynika to z mechanizmu ich
działania: po replikacji powstaje DNA, w którym nić macierzysta posiada metylację, a nić potomna
nie.
Stosowane są w inżynierii genetycznej, a zwłaszcza w technice rekombinowania i klonowani
molekularnego.



Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie 1mg DNA faga

lambda (około 50 kb) w czasie 1 godz. w temperaturze 37°C.

Dokładniej typy:

TYP I
Jest najbardziej skomplikowanym systemem, złożonym z trzech podjednostek strukturalno-
funkcjonalnych:

• Podjednostka S – rozpoznaje sekwencję DNA
• Podjednostka M – modyfikuje DNA
• Podjednostka R – aktywność restrykcyjna
• Podjednostki S i M tworzą

m6

A-metylazę DNA o stechiometrii M

2

S

1

, która rozpoznaje i

modyfikuje DNA w obrębie określonej sekwencji

• Kompleks 3 podjednostek R

2

M

2

S

1

jest enzymem restrykcyjnym (wymaga ATP) gdy napotka

niezmodyfikowany DNA

• Cięcie następuje w różnych niezdefiniowanych odległościach od miejsca rozpoznania, zwykle

kilkaset do kilku tysięcy par zasad

TYP II
W zdefiniowanych warunkach posiadają wysoką specyficzność rozpoznawanej sekwencji.

• Dają powtarzalne produkty trawienia endonukleolitycznego
• Nie wymagają ATP i S-adenozylo-L-metioniny, a jedynie jonów Mg
• Aktywności metylazy i endonukleazy rozdziolone są między dwa odrębne białka kodowane

przez różne geny

• Rozpoznają krótkie najczęściej palindromiczne sekwencje 4-8 pz i trawią DNA w obrębie

sekwencji rozpoznania lub w pewnej ściśle określonej odległości od niej

Wyróżnia się podtypy lub klasy w obrębie rodziny II:
• II S (monomery w roztworze; rozpoznają asymetryczną sekwencję; cięcie w zdefiniowanej

odległości od sekwencji rozpoznawanej, 1-20 pz; np. FokI – GGATGN

9/13

• II E (rozpoznawane dwie sekwencje: w efektorze allosterycznym i właściwej sekwencji ciętej,

np. NaeI – GCG/CGC)

• II F (homotetramer, rozpoznaje dwie sekwencje, trawienie jednoczesne obu miejsc, np.

NgoMIV – G/CCGGC

• II T (heterodimer, rozpoznawana sekwencja asymetryczna, sekwencja palindromiczna, np.

Bpu10I – CC/TNAGG

• II G (aktywność R i M w jednym łańcuchu polipeptydowym, cięcie poza sekwencją

rozpoznania, stymulacja przez SAM, np. Eco57I - CTGAAGN

14/16

)

• II B (trawienie po obu stronach rozpoznawanej sekwencji, aktywność R i M w jednym

Łańcuchu polipeptydowym, np. BcgI – NN/N

10

CGAN

6

TGCN

10

/NN)

• II M (rozpoznawana sekwencja zmetylowana, np. DpnI – G

m

A/TC)

TYP III

• Zbudowany z 2 podjednostek: M – modyfikującej i R – restrykcyjnej, występujących w

stechiometrii R2M2

• Enzymy rozpoznają 5-6 pz, nie wykazujące symetrii wewnętrznej i trawią w odległości około

25 pz od miejsca rozpoznania

• Wymagają do aktywności ATP i S-adenozylo-L-metioniny

36. Systemy restrykcji i modyfikacji bakterii

System modyfikacyjno-restrykcyjny ten stanowi zabezpieczenie bakterii przed obcym DNA, np.
pochodzącym z wirusów. Zakłada, że w komórkach bakterii istnieją dwa enzymy, z których jeden jest

endonuklezą rozpoznającą i przecinającą DNA w obrębie specyficznych sekwencji nukleotydowych
lub przy nich, podczas gdy drugi rozpoznaje te same sekwencje i modyfikuje je w taki sposób, by je
chronić przed atakiem nukleolitycznym. Obcy DNA jest atakowany i niszczony przez restryktazy, a
DNA gospodarza nie podlega restrykcji.

Enzymy restrykcyjne rozpoznają specyficzne

kilkunukleotydowe sekwencje w obrębie obcego DNA i przecinają je. Powstające w ten sposób liniwe
cząsteczki są następnie efektywnie degradowane przez egzonukleazy. Macierzyste DNA jest
zabezpieczane przed degradacja przez system metyzacji, przez specyficzną enzymatyczną
modyfikację. Przeprowadzają ją metylotransferazy DNA, które dokonują metyzacji zasad
odpowiednio do N6-metyloadeniny, 5-metylocytozyny, N4-metylocytozyny. Metylacja zachodzi
specyficznie w obrębie rozpoznawanej sekwencji przez komórkowe restryktazy. Egzogenne DNA
niezmetylowane podlega degradacji.
W komórce istnieją dwa enzymy rozpoznające sekwencję palindromiczną DNA:
a) restryktaza (np. EcoRI)
b) metylaza (np.EcoRI)
oba enzymy rozpoznają tę samą sekwencję: restryktazą tnie DNA w jej obrębie (tworzą się lepkie
końce); metylaza natomiast etyluje adeninę występującą w tej sekwencji. Jeśli sekwencje zawiera
zmetylowaną adeninę (A

Me

), miejsce to nie jest już podatne na działanie rstryktazy.

Np. u E.coli.
Metylaza Dam kodowana przez gen dam przenosi grupę metylową z S-adenozynometioniny na
pozycję N6 reszty adeniny w sekwencji GATC. Druga metylaza kodowana przez gen dcm- metylaza
Dcm, metyluje wewnętrzną cytozynę w sekwencji CCAGG i CCTGG. Metylacja metylazą Dam lub Dcm
powoduje zahamowanie cięcia przez pewne endonukleazy restrykcyjne, których sekwencja jest
identyczna z ta rozpoznawaną przez metylazy.

37. Tworzenie delecji z wykorzystaniem enzymów II
Nie mam pomysłu na to pytanie.

38. Enzymy użyteczne w analizie restrykcyjnej DNA

analiza restrykcyjna- metoda polegająca na specyficznym rozcinaniu, za pomocą enzymów
restrykcyjnych, długich cząsteczek DNA na fragmenty nadające się do różnego rodzaju manipulacji:
sporządzanie map fizycznych genomów, izolacji i identyfikacji genów, sekwencjonowania DNA,

porównywania DNA z różnych organizmów, rekombinowania i klonowania genów lub fragmentów
genów, diagnostyki chorób genetycznych, nowotworowych, infekcyjnych, w transplantologii do
uzgadniania zgodności tkankowej, w medycynie sądowej.

Podział na grupy:

• enzymy należące do grupy "regularnych 6t-ek", np.: EcoRI, BamHI, BglII, PstI, HindIII
• enzymy należące do grupy rozpoznających kilka specyficzności, np.: HincII - GT[PyPu]AC,

AccI, AvaII, AflIII

• enzymy należące do grupy rozpoznających nieciągłe sekwencje palindromowe, np.:

BglI (GCCNNNN'NGGC), BstXI (CGANNNNN'NTGG)

• enzymy rozpoznające specyficzną sekwencję, lecz przecinające DNA poza nią ("shiftery", klasa

lI S), np.: FokI GGATGNNNNNNNNN(9)’ MboII GAAGANNNNNNNN(8)’

CCTACNNNNNNNNNNNNN(13)’ CTTCTNNNNNNN(7)’

39. Enzymy restrykcyjne – izoschizomery i neoschizomery

Izoschizomery- dwa różne enzymy restrykcyjne (z różnych szczepów) rozpoznające takie same
sekwencje i tnące je w jednakowy sposób. Spośród nich ten, który został wyizolowany jako pierwszy
nazywamy prototypem. Np. Enzym BamHI produkuje końce GATCC (rozpoznaje sekwencję GGATCC),
zaś enzym BglII, wytwarzający takie same "lepkie końce", rozpoznaje sekwencję AGATCC.
Np.:

SphI

GCATG’C

BbuI

GCATG’C

Neoschizomery- enzymy restrykcyjne rozpoznające takie same sekwencje, lecz trawiące je w
odmienny sposób. Uniemożliwia to łączenie (ligację) końców, więc podczas planowania ligacji nie
można tego przeoczyć!
Np.:

Acc65I G’GTACC

KpnI

GGTAC’C

SmaI

CCC’GGG

XmaI

C’CCGGG

BbeI

GGCGC’C

EheI

GGC’GCC

KasI

G’GCGCC

NarI

GG’CGCC

40. Problem dam/dcm metylacji DNA w komórkach E.coli

Jeżeli sekwencje GATC lub CC A/T GG są częścią sekwencji rozpoznawanej, bądź enzym rozpoznaje i
przecina taką sekwencję bezpośrednio, to fakt ten ma swoje konsekwencje, jeśli DNA jest
otrzymywane w komórkach E.coli dam+ dcm+. W związku z metyzacją adeniny w sekwencji GATC
(dam) i wewnętrznej cytozyny w sekwencji CC A/T GG (dcm) w dzikich szczepach E.coli, należy brać
pod uwagę wrażliwość danego enzymu restrykcyjnego na tego typu metyzację substratu. Jeżeli zatem
sekwencje GATC lub CC A/T GG nakładają się na sekwencje rozpoznawane, należy wiedzieć, że nie
każde istniejące na danym DNA miejsce restrykcyjne dla odpowiedniego enzymu będzie cięte.

41. Warunki trawienia a niespecyficzna aktywność (star activity)



Jeśli przeprowadza się trawienie w warunkach znacznie odbiegających od optymalnych dla
danego enzymu, ot często zdarza się, że obserwujemy niespecyficzne cięcia.



Dzieje się tak, ponieważ w tych warunkach enzym rozpoznaje sekwencje różniące się od
sekwencji specyficznej (kanonicznej), np. o jedną zasadę.



W przypadku EcoRI, dla którego sekwencją kanoniczną jest GAATTC takie zmienione
przecinane sekwencje to np. CAATTC, GAATTG, GTATTC itp.

Do czynników mogących wywołać rozluźnioną specyficzność enzymu zalicza się:



Stężenie glicerolu powyżej 5%,



Obecność DMSO, etanolu, glikolu etylenowego,



Zbyt niską siłę jonową mieszaniny reakcyjnej,



Zbyt wysokie pH,



Obecność innych niż Mg

2+

jonów dwuwartościowych metali (np. Mn, Cu, Zn, Fe, Co, Ca),



Zbyt wysokie stężenie enzymu w próbce.

42. Tworzenie nowych miejsc restrykcyjnych przez łączenie końców DNA

Nowe miejsca restrykcyjne w zrekombinowanym DNA mogą powstawać w miejscu ligacji naturalnych
końców DNA bądź po wypełnieniu ich fragmentem Klenowa polimerazy DNA I:
powstanie nowego miejsca przypadkowo:

• SspI/ClaI (Klenow) - A

AT/CGAT

odtworzone ClaI (

ATCGAT

)

• ClaI (Klenow)/SspI -

ATCG/AT

T

odtworzone ClaI

• EcoRV/ClaI (Klenow) - G

AT/CGAT

odtworzone ClaI dam-zależne (gATCGAT)

• EcoRI (Klenow)/PvuII -

GAATT/C

TG

odtworzone EcoRI (GAATTC)

powstanie nowego miejsca w sposób zamierzony:

• (np. w sytuacji konieczności zlikwidowania starego miejsca restrykcyjnego i wykreowanie

nowego [uzupełnianie fragmentem Klenowa polimerazy DNA I]:

• EcoRI/EcoRI -

GAATT/AATTC

XmnI (

GAANNNNTTC

)

• HindIII/HindIII - AA

GCT/AGC

TT

NheI (

GCTAGC

)

• TaqI/TaqI -

TCG/CGA

NruI (

TCGCGA

)

43. Omówić polimerazy DNA stosowane w metodach inżynierii genetycznej
1. DNA Polimeraza I (polimeraza Kornberga)

Enzym posiada 3 różne aktywności:



DNA polimerazy,



Egzonukleazy 3’-5’ (aktywność korektorska)



Egzonukleazy 5’-3’.

W reakcji z dwuniciowym DNA (dsDNA) i przy nadmiarze DTP aktywność egzonukleazy 3’-5’ jest
zwykle maskowana przez aktywność polimerazy 5’-3’.
Właściwości:



5’-3’ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do swojej aktywności matrycy
jednoniciowego DNA (ssDNA) i startera DNA lub RNA z końcem 3’-OH.



5’-3’ egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybrydy DNA/RNA od końca
5’-P.



3’-5’ egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA) od
końca 3’-OH.

Zastosowanie:



Znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation)



Synteza nici cDNA w połączeniu z RNaząH.

2. DNA Polimeraza I (fragment Klenowa)

Źródłem tego enzymu jest produkt proteolizy polimerazy Kornberga subtilizyną. Enzym ten jest także
otrzymywany z rekombinanta E.coli syntetyzującego to białko ze zmienionego genu polA. Nie posiada
aktywności 5’-3’ egzonukleazy.
Właściwości:



5’-3’ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do swojej aktywności matrycy
jednoniciowego DNA (ssDNA) i startera DNA lub RNA z końcem 3’-OH.



3’-5’ egzonukleaza, degradująca dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy DNA (ssDNA) od
końca 3’-OH.

Zastosowanie:



Wypełnianie i znakowanie dwuniciowego DNA (dsDNA) z 5’ jednoniciowy, lepkim końcem.



Znakowanie ssDNA metodą wydłużania startera (ang. random priming)



Synteza drugiej nici cDNA



Synteza komplementarnej nici w mutagenezie miejscowo-specyficznej



Synteza sond ssDNA



Znakowanie DNA metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick translation)

3. DNA Polimeraza faga T4

Źródłem tego enzymu są bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli syntetyzujący to
białko z sklonowanego genu polimerazy T4. Brak jej aktywności egzonukleazy 5‘-3'. Więc jest
funkcjonalnie podobny do fragmentu Klenowa, przy czym polimeraza T4 posiada bardziej aktywną
egzonukleazę 3‘-5'.
Właściwości:



5‘-3' DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA
(ssDNA) i starter DNA lub RNA z końcem 3'-OH.



3‘-5' egzonukleaza, degradująca od końca 3'-OH dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy
DNA (ssDNA).

Aktywność 3’-5' egzonukleazy polimerazy DNA T4 umożliwia enzymowi przeprowadzać reakcje
wymiany z cząsteczkami dsDNA posiadającymi tępe lub 3' wiszące końce.
Zastosowanie:



Wypełnianie i znakowanie dwuniciowego DNA (dsDNA) z 5' jednoniciowym, lepkim końcem



Znakowanie dsDNA przez reakcję wymiany



Wypełnianie luk w DNA w mutagenezie miejscowo-specyficznej z krótkimi oligonukleotydami



Wykrywanie dimerów tyminowych

4. DNA Polimeraza faga T7

Źródłem tego enzymu są bakterie E. coli zakażone fagiem T7. DNA polimeraza faga T7 jest dimerem
złożonym z produktu genu 5 faga T7 (84 kDa) i tioredoksyny E. coli. Produkt genu 5 posiada
aktywność polimerazy/egzonukleazy, a białko E. coli ściśle wiąże kompleks z matrycą DNA,
zapobiegając wczesnej dysocjacji podczas syntezy komplementarnej nici. Enzym ten jest
funkcjonalnie podobny do fragmentu Klenowa, lecz charakteryzuje się szybszym stopniem syntezy
DNA (300 nt/s).
Właściwości:



5‘-3‘ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA
(ssDNA) oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'-OH.



3‘-5' egzonukleaza, degradująca od końca 3'-OH dwuniciowy DNA (dsDNA) lub jednoniciowy
DNA (ssDNA).

Zastosowanie:



Używany alternatywnie z fragmentem Klenowa, szczególnie w tych przypadkach, które
wymagają dużej szybkości syntezy i dobrego wiązania z matrycą.

5. DNA Polimeraza Taq

Źródłem tego enzymu są bakterie Thermus aquaticus YT1 lub rekombinant E. coli. Enzym ten jest
funkcjonalnie podobny do DNA polimerazy I E. coli. Cenną jego właściwością jest termostabilność w
zakresie temperatur od 37°C do 94°C, a optimum działania wykazuje przy 80°C.
Właściwości:



5‘-3‘ DNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy jednoniciowego DNA
(ssDNA) oraz startera DNA lub RNA z końcem 3'-OH



5‘-3' egzonukleaza, degradująca od końca 5'-P dwuniciowy DNA (dsDNA) lub hybryd DNA-
RNA.

Zastosowanie:



Amplifikacja DNA przez łańcuchową reakcję polimery (ang. Polimerase Chain Reaction - PCR)



W sekwencjonowaniu DNA metodą Sangera

6. Odwrotne transkryptazy:

Źródłem są kurczęta zainfekowane wirusem AMV (ang. Avian Myeloblastosis Virus) lub rekombinant
E. coli z wklonowanym genem AMVpol.
Odwrotna transkryptaza AMV jest to białko dimeryczne złożone z podjednostek o masach
cząsteczkowych 62 i 94 kDa. Mała podjednostka jest proteolitycznym produktem dużej podjednostki.
Właściwości:



5‘-3' DNA- lub RNA-zależna polimeraza DNA, wymagająca do aktywności matrycy
jednoniciowego DNA (ssDNA) lub jednoniciowego RNA (ssRNA) oraz startera DNA lub RNA z
końcem 3'-OH.



5’-3’ i 3’-5’ aktywność egzonukleazy, specyficznej dla RNA w hybrydzie DNA/RNA.



Aktywność DNA endonukleazy.

Zastosowanie:



Synteza pierwszej nici cDNA



Sekwencjonowanie RNA



Sekwencjonowanie DNA, szczególnie dla regionów bogatych w G+C



Szukanie drugorzędowych struktur RNA



Znakowanie 3' końców fragmentów DNA

44. Omówić polimerazy RNA stosowane w metodach inżynierii genetycznej
1. RNA Polimeraza E.coli

Holoenzym polimerazy RNA izolowanej z E. coli składa się z 4 podjednostek: 2a, b i b'. Jest on zdolny
do elongacji transkryptów, lecz nie do wydajnej inicjacji transkrypcji. Dla inicjacji transkrypcji
potrzebna jest piąta podjednostka - s.
Właściwości:



DNA-zależna polimeraza RNA rozpoznaje różne sekwencje promotorowe podobne do
sekwencji consensus i syntetyzuje RNA aż do sekwencji terminatorowej.

Zastosowanie:



Transkrypcja genów z właściwych promotorów in vitro



Synteza znakowanego RNA

2. RNA Polimeraza faga SP6

Źródłem enzymu są bakterie Salmonella typhimurium LT2 zakażone fagiem SP6 lub rekombinant E.
coli. Promotor SP6 jest bardzo wydajny i specyficznie rozpoznawany przez polimerazę SP6. Wektory
zawierające promotor SP6 mogą syntetyzować mikrogramowe ilości RNA. Polimeraza SP6 nie kończy
syntezy przy nacięciach matrycy.
Właściwości:



DNA-zależna polimeraza RNA, wysoce specyficzna w stosunku do promotora SP6.

Zastosowanie:



Produkcja antysensownego RNA;



Synteza mRNA w translacji in vitro,



Otrzymywanie znakowanego RNA;



Sekwencjonowanie RNA

3. RNA Polimeraza faga T3

Źródłem enzymu jest rekombinant E. coli zawierający plazmid z wklonowanym genem polimerazy
RNA T3 pod kontrolą promotora lacUV5. Enzym jest bardzo specyficzny do promotorów T3.
Właściwości:



DNA-zależna polimeraza RNA, wysoce specyficzna w stosunku do promotora T3.

Zastosowanie:



Synteza transkryptów RNA pod kontrolą promotora T3, zastosowanie podobne jak RNA
polimerazy SP6.

4. RNA Polimeraza faga T7

Źródłem enzymu jest rekombinant E. coli zawierający plazmid z wklonowanym genem RNA
polimerazy T7 pod kontrolą promotora lacUV5. Enzym jest bardzo specyficzny dla promotorów T7.
Wektor zawierający promotor T7 może być zastosowany do otrzymania 30 mg transkryptu RNA z 1
mg DNA matrycowego w ciągu 30 min.

Właściwości:



DNA-zależna polimeraza RNA, wysoce specyficzna dla promotora T7.

Zastosowanie:



Synteza transkryptów RNA z sekwencji ligowanych pod kontrolę promotora T7, zastosowanie
podobne do RNA polimerazy SP6.

45. Omówić nukleazy
1. Nukleaza Bal31

Źródłem są bakterie Alteromonas espejiana Bal31. Jest to zewnątrzkomórkowa nukleaza, wysoce
zależna od sekwencji, w dużych rozcieńczeniach jest funkcjonalna tylko aktywność endonukleazy dla
jednoniciowego DNA (ssDNA).
Właściwości:



3'—>5' egzonukleaza, która progresywnie usuwa nukleotydy z końca 3'-OH
cząsteczek ssDNA lub dsDNA mających zarówno kohezyjne jak i tępe końce. (1)



Endodeoksyrybonukleaza z dużą specyficznością dla ssDNA. (2)



Kombinacja aktywności (1) i (2) dająca enzymowi Bal31 możliwość progresywnego skracania
cząsteczek dsDNA.



Niewydajna rybonukleaza.

Zastosowanie



Kontrolowane cięcie cząsteczek dsDNA usuwające zbędne sekwencje przed klonowaniem



Tworzenie zachodzących subklonów do sekwencjonowania DNA



Mapowanie restrykcyjne



Mapowanie drugorzędowych struktur DNA

2. Nukleaza SI

Źródłem jest Aspergillus oryzae. Enzym jest glikozylowanym, cynkowym metaloproteidem, wysoce
termostabilnym.
Właściwości:



Endonukleaza specyficzna dla ssDNA, bardziej aktywna dla ssDNA, niż ssRNA

Zastosowanie:



Analiza hybryd DNA-RNA (mapowanie nukleazą SI) w celu lokalizacji intronów i miejsc
terminacji transkrypcji



Usuwanie lepkich końców w celu tworzenia cząsteczek z tępymi końcami



Otwieranie struktur "szpilki od włosów" (ang. hairpins) tworzonych podczas syntezy cDNA

3. Nukleaza Mung Bean

Źródłem jest fasola Vigna radiata. Funkcjonalnie nukleaza Mung Bean podobna jest do nukleazy SI,
lecz cechuje się o wiele mniejszą aktywnością do tworzenia nacięć w dsDNA i cięcia nienaruszonej nici
naprzeciw nacięcia.
Właściwości:



Endonukleaza specyficzna dla ssDNA, bardziej aktywna dla ssDNA niż ssRNA

Zastosowanie:



Stosowana alternatywnie w stosunku do nukleazy SI, gdy cięcie dwuniciowych cząsteczek
stanowi problem



Stosowana do usuwania lepkich końców dwuniciowego DNA

4. Nukleaza PI

Źródłem jest Penicillium citrinum. Nukleaza PI jest glikozylowanym, cynkowym metaloproteidem.
Właściwości:



Niespecyficzna fosfodiesteraza, działająca zarówno jako endonukleaza jak i egzonukleaza.
Jest bardziej aktywna w stosunku do ssDNA i ssRNA, lecz wykazuje również znaczącą
aktywność wobec dsDNA i dsRNA

Zastosowanie:



W sekwencjonowaniu RN A.



Możliwość alternatywnego wykorzystania zamiast nukleazy SI lub Mung Bean do cięcia
ssDNA lub ssRNA, jednak z powodu wysokiej aktywności w stosunku do dsDNA lub dsRNA
jest mało użyteczna do tych celów.

5. Rybonukleaza A

Źródłem jest trzustka wołowa. Jest to bardzo aktywna i stabilna. Większość preparatów jest
zanieczyszczona DNazami, które mogą być inaktywowane przez gotowanie w 100°C przez 15 min.
RNaza A jest nieglikozylowaną formą standardowej rybonukleazy trzustkowej.
Właściwości:



Endorybonukleaza, przecinająca fosfodiestrowe wiązanie 3’ przy pirymidynach. Nie wykazuje
żadnej aktywności w stosunku do DN

Zastosowanie:



Usuwanie RNA z preparatów DNA



Mapowanie punktowych mutacji w DNA i RNA

6. Rybonukleaza H

Źródłem jest rekombinantowy szczep E. coli zawierający plazmid z genem RNazy H. Rybonukleaza H
jest to białko monomeryczne.
Właściwości:



Endorybonukleaza, specyficzna do RNA w hybrydach DNA-RNA

Zastosowanie:



Synteza komplementarnej nici cDNA



Usuwanie ogonów poli(A) z mRNA



Wykrywanie hybryd DNA-RNA



Badanie starterów RNA w syntezie DNA



Miejscowo-specyficzne cięcie hybrydyzowanego RNA z krótkimi oligonukleotydami

7. Deoksyrybonukleaza I

Źródłem jest trzustka wołowa. Jest to glikoproteid, zwykle otrzymywany jako mieszanina
izoenzymów.
Właściwości:



Endodeoksyrybonukleaza, degradująca ssDNA i dsDNA przez preferencyjne cięcie 5‘
pirymidyn, dająca mono- i oligonukleotydy o przeciętnej wielkości 4 nt.

Zastosowanie:



Wprowadzanie nacięć do dsDNA przed znakowaniem metodą przesunięcia pęknięć (ang. nick
translation)



Eksperymenty typu ochrony przed cięciem DNazą i "footprinting„ w celach lokalizacji miejsc
wiązania białek z DNA



Usuwanie DNA podczas preparowania RNA



Wykrywanie regionów transkrypcyjnie aktywnych w chromatynie



Usuwanie matrycy DNA po transkrypcji in vitro



Tworzenie zachodzących na siebie subklonów w sekwencjonowaniu DNA

8. Nukleaza S7

Źródłem są bakterie Staphylococcus aureus. Nukleaza S7 jest aktywna zarówno w stosunku do DNA
jak i RNA. W przypadku DNA wykazuje preferencje do ssDNA i regionów dsDNA bogatych w pary AT.
Właściwości:



Endonukleaza, aktywna w stosunku do DNA i RNA, zarówno jedno- jak i dwuniciowego

Zastosowanie:



Przygotowanie mRNA-zależnej syntezy białek z lizatów króliczych retikulocytów



Trawienie chromatyny w celu przygotowania nukleosomów

9. Endonukleaza T7

Źródłem są bakterie E, coli zakażone fagiem T7 lub rekombinant E. coli eksprymujący gen 3 faga T7.
Endonukleaza T7 jest to specyficzny do ssDNA enzym, aktywny w neutralnym i zasadowym pH. Ma on
słabą aktywność wobec dsDNA (1% aktywności w porównaniu z aktywnością do ssDNA).
Właściwości:



Endonukleaza, specyficzna dla ssDNA

Zastosowanie:



Badanie złożonych struktur dsDNA



Eksperymenty typu "footprinting" do lokalizacji miejsc wiązania białek z DNA

10. Egzonukleaza I

Źródłem są bakterie E. coli. Egzonukleaza I jest to białko monomeryczne.
Właściwości:



3‘-5' egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla ssDNA

Zastosowanie:



Badanie aktywności helikaz DNA



Endonukleolityczne cięcie ssDNA

11. Egzonukleaza VII

Źródłem są bakterie E. coli HMS 137. Egzonukleaza ta atakuje zarówno końce 5' jak i 3' ssDNA
tworząc w wyniku cięcia oligonukleotydy.
Właściwości:



3‘-5' i 5‘-3' egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna do ssDNA

Zastosowanie:



Mapowanie egzonów. Egzonukleaza VII nie posiada aktywności endonukleolitycznej, może
więc być stosowana w mapowaniu transkryptów w celu odróżnienia pętli ssDNA od

wiszących ssDNA w hybrydach DNA-RNA. Egzonukleaza VII nie ma zastosowania dla tępo
zakończonych fragmentów dsDNA.

12. Egzonukleaza III

Źródłem są bakterie E. coli BE 257 lub SR 80 z termicznie indukowalnym genem sklonowanym w
plazmidzie. Egzonukleaza III jest to białko monomeryczne o wielu aktywnościach. Egzonukleaza jest
nieaktywna w stosunku do ssDNA lub dsDNA z lepkimi końcami 3' wielkości 4 nt lub więcej.
Właściwości:



3‘-5' egzodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla dsDNA z końcami 3'-OH;



3’ fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3’ ssDNA lub dsDNA;



Endodeoksyrybonukleaza, specyficzna dla nukleotydów w których zasada purynowa lub
pirymidynowa została nacięta;



Endorybonukleaza, specyficzna do RNA w hybrydach RNA-DNA.

Zastosowanie:



Tworzenie zachodzących na siebie subklonów w sekwencjonowaniu DNA;



Znakowanie tępych końców dsDNA, w połączeniu z działaniem fragmentu Klenowa;



Delecje sekwencji terminalnych w fragmentach dsDNA, w połączeniu z działaniem
endonukleazy specyficznej do ssDNA;



Techniki mutagenezy

46. Omówić kinazy polinukleotydowe i alkalicznej fosfatazy

1. Fosfataza alkaliczna
Źródłem jest jelito cielęce (fosfataza CIP, ang. Calf Intestine Phosphatase) lub E. coli (fosfataza BAP,
ang. Bacterial Alkaline Phosphatase). Jest to dimeryczny glikoproteid, złożony z dwóch identycznych
podjednostek. Zawiera cztery atomy cynku na cząsteczkę. CIP może być inaktywowany termicznie
przez inkubację w 68°C, natomiast BAP jest w tych warunkach stabilny. BAP jest również oporny na
ekstrakcję fenolową.
Właściwości:



5' fosfataza, usuwająca 5' grupę fosforanową z ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA, z
deoksyrybonukleotydotrifosforanów i rybonukleotydotrifosforanów

Zastosowanie:



Defosforylacja dsDNA w celu uniemożliwienia autoligacji



Defosforylacja DNA i RNA do znakowania końców 5‘ za pomocą kinazy polinukleotydowej T4



Jako składnik w systemie immunodetekcji

2. Kinaza Polinukleotydowa T4
Źródłem są bakterie E. coli zakażone fagiem T4 lub rekombinant E. coli. Kinaza polinukleotydowa jest
tetramerem, złożonym z identycznych podjednostek. Aktywność fosfatazy jest wyrażana w stosunku
do ssDNA i dsDNA, ssRNA i dsRNA i również 3'- deoksyrybonukleotydomonofosforanów i 3'-
rybonukleotydomonofosforanów.
Właściwości:



5' kinaza, przenosząca g-fosforan z ATP na koniec 5'-OH cząsteczek ssDNA, dsDNA, ssRNA lub
dsRNA



3' fosfataza, usuwająca grupy fosforanowe z końców 3' cząsteczek ssDNA, dsDNA, ssRNA lub
dsRNA

Zastosowanie:



Znakowanie końców 5' DNA lub RNA, szczególnie przed reakcjami sekwencjonowania
metodą Maxama-Gilberta, enzymatycznym sekwencjonowaniem RNA, mapowaniem
restrykcyjnym i " footprintingem"



Fosforylowanie syntetycznych oligonukleotydów



Usuwanie grup fosforanowych z końców 3'.

47. Topoizomerazy
1. DNA topoizomeraza I

Źródłem enzymu jest trzustka cielęca. DNA topoizomeraza I jest pojedynczym polipeptydem.
Właściwości:



Typ I topoizomeraz relaksuje superzwinięte DNA przez nacięcie pojedynczej nici w szkielecie
cukrowo-fosforanowym. Aktywność topoizomerazy I jest także odpowiedzialna za:

(1) tworzenie kolistych katenatów dsDNA,
(2) wiązanie cząsteczek ssDNA z końcami 5'-OH innej cząsteczki ssDNA lub cząsteczki dsDNA.

Zastosowanie:



Badanie budowy nukleosomów;



Badanie struktur DNA wyższego rzędu

2. DNA topoizomeraza II (DNA gyraza)

Źródłem tego enzymu są bakterie Micrococcus luteus. DNA topoizomeraza II jest białkiem
multimerycznym, złożonym z identycznych podjednostek. Do swej aktywności wymaga ATP.
Właściwości:



Typ II topoizomeraz wprowadza negatywne superskręty do CCC DNA poprzez nacięcie dwóch
nici i następnie ponowne połączenie wiązaniem fosfodiestrowym

Zastosowanie:



Wprowadzanie superskrętów do plazmidów i innych cząsteczek CCC DNA.

48. Białka wiążące się z DNA
1. Białko wiążące się z jednoniciowym DNA (SSB)

Źródłem są bakterie E. coli, a także ich rekombinant. SSB jest białkiem tetramerycznym, złożonym z
identycznych podjednostek. Wiąże się kooperatywnie z ssDNA , lecz nie z dsDNA.
Zastosowanie:



Techniki mutagenezy



Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej



Badanie aktywności DNA helikazy, w połączeniu z działaniem egzonukleazą I



Stymulacja przejścia genomów fagowych z ssDNA do dsDNA



Stymulacja aktywności DNA polimerazy

2. Białko genu 32 faga T4

Źródłem są bakterie E. coli zakażone potrójnym mutantem faga T4, defektywnym dla genów 33, 35 i
58-61, a także nadprodukujący rekombinant E. coli. Produkt genu 32 jest białkiem wiążącym się z

ssDNA, stymulującym aktywność DNA polimerazy T4 (5-10 razy). Białko to wiąże się również do
ssRNA, lecz z 10-1000 razy niższą efektywnością.
Zastosowanie:



Stymulacja aktywności DNA polimerazy T4 w replikacji matrcy ssDNA



Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej



Techniki miejscowo-specyficznej mutagenezy



Rozpoznawanie uszkodzonego DNA

3. Białko RecA

Źródłem są bakterie E. coli lub jej rekombinant. Białko RecA jest wymagane w homologicznej
rekombinacji genetycznej i w systemach naprawy DNA.
Właściwości:



Białko wiążące się z ssDNA



DNA-zależna ATPaza

Zastosowanie:



Techniki mutagenezy



Uwidacznianie ssDNA w mikroskopii elektronowej



Do rzadkiego i precyzyjnego cięcia dużych cząsteczek DNA metodą trawienia w "Pięcie
Achillesa" (ang. Achilles' Heel Cleavage)

49. Główne cechy wektora plazmidowego

Wektorem służącym do klonowania DNA może być taki element genetyczny, który ma zdolność do
namnażania się, po wprowadzeniu do komórki biorcy. Wektory powinny ponadto:



zawierać geny, tzw. markery selekcyjne, nadające komórkom gospodarza łatwy do
testowania fenotyp, np. oporność na antybiotyk,



posiadać unikalne miejsca rozpoznawane przez enzym/enzymy restrykcyjne w
obrębie rejonów, w które można wprowadzić obcy DNA, bez naruszenia zdolności
wektora do replikacji i możliwości selekcji zrekombinowanych cząsteczek,



być zdolny do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu
szczepach, to znaczy mieć tzw. mały zakres gospodarza oraz nie posiadać zdolności
koniugacyjnych.

50. pBR322

Jeden w pierwszych opracowanych wektorów plazmidowych.
Posiada dwa geny oporności na antybiotyki: amp

r

oraz tetA. Jeśli badany fragment DNA zostanie

wprowadzony do sekwencji kodującej jednego z genów oporności gen ten zostanie inaktywowany
przez inercję i obecność zrekombionowanego produktu będzie można ustalić na podstawie oporności
transformowanych komórek na antybiotyki.
Wysoka liczba kopii, funkcjonuje tylko w E.coli, łatwo go przenieść na inne E.coli.

51. Plazmid typu ColE1



Wielokopijny plazmid (liczba kopii plazmidu w komórce wynosi 15-20)



Plazmid mający wąski zakres gospodarzy (tylko w Enterobacteriaceae)



Duży plazmid uzyskany z badań klinicznych izolatów E.coli



Funkcje replikacji nie są kodowane na plazmidzie



Używa funkcji z genów żywiciela
- Polimerazy DNA I i III, DNA - zależna polimeraza RNA, itp.



Plazmidy mogą funkcjonować w przypadku braku bieżącej syntezy białek



ColE1 replikony:

Więc co się stanie, jeśli zmiany RNA I lub rop?
Zmniejszenie negatywnej regulacji RNA II

Rop protein (63 amino acids)

RNA II

RNA I

rop gene

Direction of DNA replication

-500 -300 -100 ori 100 300 500

RNAse H

Processing

Więcej RNA II dostępne
Więcej replikację plazmidu

52. Wektory o szerokim zakresie gospodarzy

Szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych znalazły plazmidy o specjalnych cechach
replikonu, pozwalających na propagację plazmidu w szerokim spektrum gospodarzy bakteryjnych
(ang. broad-host-range plasmids). Do tej grupy należy np. replikon RK2 (z białkiem inicjatorowym
TrfA kodowanym na plazmidzie), który dzięki dużej tolerancji jeśli chodzi o wymagania co do reszty
białek replikacyjnych dostarczanych przez gospodarza bakteryjnego, może się replikować zarówno w
E. coli jak i innych bakteriach Gram-ujemnych takich jak: Salmonella typhimurium, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas putida, Alcaligenes eurotropus, Azotobacter vinelandii, Azotobacter
xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Caulobacter crescentus, Acinetobacter calcoaceticus,
Rhodopseudomonas sphaeroides. Oczywiście uzyskiwana liczba kopii plazmidu w poszczególnych
gatunkach bakterii jest różna.

53. WEKTORY DO EKSPRESJI GENÓW (NADPRODUKCJI BIAŁEK)

Wektory te umożliwiają ogromną nadprodukcję białek (stanowiącą od kilku do kilkudziesięciu

procent ogólnej masy białek w komórce) wykorzystując właściwości wyselekcjonowanych, dobrze
regulowanych i bardzo silnych promotorów.

Istnieją dwa możliwe podejścia regulacji ekspresji badanego genu:



fuzje genowe transkrypcyjne - gen przeznaczony do ekspresji posiada własny rejon RBS i

sekwencję kodującą (wektor dostarcza silnego promotora);



fuzje genowe translacyjne - gen przeznaczony do ekspresji musi być najczęściej produktem

amplifikacji PCR, z przekształconym początkiem sekwencji kodującej, w taki sposób aby po
przecięciu enzymem NdeI (CATATG) lub NcoI (CCATGG) pasował w istniejącą na plazmidzie
ramkę odczytu. Tak jest jeśli fuzja dotyczy pierwszego kodonu inicjatorowego AUG. Powstaje
wtedy białko niezmienione, dzikiego typu. Wektor w tego typu fuzjach dostarcza zatem
promotor i rejon RBS, wraz z kodonem inicjatorowym ATG. Pozycje sekwencji SD i ATG
narzucają jedyną możliwą ramkę odczytu.

- Inaczej jest jeśli do utworzenia fuzji genowej wykorzystamy inne miejsce restrykcyjne, położone w
miejscu wielokrotnego klonowania (MCS).
- Miejsce to położone jest za kodonem inicjatorowym, ale umożliwia klonowanie, w którym
sekwencja kodująca genu zachowa właściwą sobie ramkę odczytu.
- Powstaje wtedy białko fuzyjne, z dodatkowymi aminokwasami na N- lub C-końcu. Ma to miejsce
zwłaszcza, kiedy przeprowadzamy fuzje z różnego typu ogonkami peptydowymi (ang. tag),
oferowanymi nam przez dany wektor.

Wykorzystanie tego typu możliwości znajduje zastosowanie głównie w ułatwianiu



oczyszczania produktów białkowych (dotyczy to m.in. peptydów fuzyjnych His-tag, S-tag) lub



ich identyfikacji przy pomocy specyficznych przeciwciał (dotyczy to m.in. peptydów fuzyjnych

T7-tag, S-tag).

- W wektorach ekspresyjnych powinno się unikać sytuacji, kiedy gen oporności na antybiotyk ma
własny stosunkowo silny promotor lub jest w tej samej orientacji co gen główny.
- Tworzy to sytuację współzawodnictwa między dwoma promotorami, co w efekcie prowadzi do
ograniczenia produkcji białka rekombinacyjnego (głównego) i dwukrotnego spadku jej wydajności
kosztem niepotrzebnego zwiększenia poziomu białka oporności na antybiotyk.

To że poziom białka dającego antybiotykooporność zwykle jest i tak nadmierny pokazuje przykład b-
laktamazy. Produkcja tego białka osiągana z plazmidu pBR322 pozwala na wzrost bakterii w
obecności 5 mg Ap na ml pożywkj (!). W przypadku plazmidu pUC wzrost bakterii jest możliwy w
obecności ponad 20 mg antybiotyku na mililitr pożywki!


54. WEKTORY WYSPECJALIZOWANE

Cechy budowy dobrych wektorów:

1. rodzaj replikonu umożliwiający dużą liczbę kopii plazmidu, im więcej tym lepiej;
2. występowanie wielu unikalnych miejsc restrykcyjnych zgrupowanych w określonym obszarze

plazmidu zwanym MCS lub miejscem wielokrotnego klonowania, im więcej tym lepiej;

3. obszar MCS powinien być ograniczony specyficznymi promotorami dla wydajnych polimeraz

RNA takich jak: polimeraza RNA T7, SP6 lub T3. Można to wykorzystać do otrzymania dużych
ilości specyficznego transkryptu klonowanego fragmentu DNA w reakcji in vitro;

4. wektor może posiadać dodatkowe ori replikacji dla jednego z fagów filamentarnych (M13,

f1), w celu potencjalnego wykorzystania plazmidu do otrzymywania DNA w formie
jednoniciowej, kolistej matrycy, z przeznaczeniem do reakcji sekwencjonowania czy
miejscowo-specyficznej mutagenezy;

5. wektor powinien posiadać elementy genetyczne wykorzystywane do selekcji rekombinantów.

55. ZJAWISKO NIEZGODNOŚCI PLAZMIDÓW – z neta

Bakterie mogą posiadać jednocześnie kilka typów plazmidów. Jednak nie wszystkie rodzaje
plazmidów mogą współistnieć w komórce bakteryjnej, o czym decyduje ich przynależność do
określonej grupy niezgodności Inc (incompatibility), stanowiącej istotny element charakterystyki
plazmidów.


Plazmidy można podzielić na grupy niezgodności (incompatibility). Grupa niezgodności składa się z
plazmidów, które nie są zdolne do wspólnego utrzymania się w tej samej linii komórkowej. Plazmidy
należące do tej samej grupy niezgodności są zazwyczaj blisko spokrewnione i wykazują co najmniej
częściową homologię DNA. W zjawisku niezgodności plazmidowej najważniejszą rolę odgrywa
regulacja replikacji. Jeżeli system kontrolujący replikację rozpoznaje dwa plazmidy jako identyczne,
plazmidy te są niezgodne. W przypadku gdy plazmid występuje w 1-2 kopiach na komórkę,
mechanizm jest następujący: po jednym cyklu replikacyjnym plazmidu system regulacyjny
uniemożliwia zapoczątkowanie następnego cyklu, dopóki nie nastąpi podział komórkowy. Dlatego
też, każda z komórek siostrzanych może dziedziczyć tylko jeden z dwóch plazmidów należących do tej
samej grupy niezgodności. W tej sytuacji drugi plazmid zostaje bardzo szybko wyeliminowany z linii
komórkowej. Drugim systemem odgrywającym rolę w zjawisku niezgodności jest system regulujący
dokładne rozdzielanie plazmidów do komórek potomnych. Gdy dwa plazmidy są rozpoznawane przez
ten system jako identyczne, wtedy tylko jeden z nich będzie dokładnie rozdzielony pomiędzy komórki
siostrzane, a rozdzieleniem drugiego będzie rządził przypadek. Końcowym efektem w tym przypadku
będzie również utrata jednego z plazmidów.

56. WEKTORY WAHADŁOWE

Wektory wahadłowe (ang. shuttle vectors). Są to plazmidy zawierające dwa różne origin replikacji,
specyficzne dla organizmów niespokrewnionych, często dość odległych ewolucyjnie (np. dla bakterii
Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, oraz dla bakterii i drożdży, lub dla bakterii i wirusa
eukariotycznego). Umożliwia to prowadzenie prac konstrukcyjnych nad pochodnymi plazmidu w
bakteriach E. coli, a następnie jego wykorzystanie poprzez niezależną replikację (a także ekspresję
specyficznych białek) w organizmie docelowym.











57. SYSTEM TABORA-STUDIERA DO EKSPRESJI GENÓW

Obecnie jednym z najwydajniejszych systemów ekspresji w bakteriach jest układ Tabora-Studiera.

1. Geny docelowe klonowane są do wektorów serii pET (ang. plasmid for Expression by T7 RNA
polymerase) pod kontrolę silnego promotora faga T7, nie rozpoznawanego przez bakteryjną

polimerazę RNA. Pojawienie się w komórce polimerazy RNA fafa T7 powoduje transkrypcję, a
następnie translację genu targetowego z promotora faga T7.

2. Gospodarz bakteryjny posiada wprowadzony do chromosomu gen kodujący polimerazę RNA faga
T7 (T7 gene 1) pod kontrolą promotora lac, rozpoznawanego przez bakteryjną polimerazę RNA.
Transkrypcja z promotora lac jest indukowana przez IPTG. Pomiędzy promotorem, a genem
kodującym polimerazę RNA T7 znajduje się sekwencja operatorowa, wiążąca białko represorowe,
które blokuje inicjację transkrypcji. Dopiero po związaniu represora z IPTG, co prowadzi do utraty
powinowactwa białka do miejsca operatorowego, może rozpocząć się transkrypcja genu polimerazy
fagowej.

3. Pojedyncze cząsteczki polimerazy RNA T7, które mogą powstać przed indukcją, są inaktywowane
przez lizozym faga T7, którego gen jest wprowadzony do komórek bakteryjnego gospodarza wraz z
plazmidem pLysS.

Ekspresja genu lizozymu zachodzi w komórce na stałym, niskim poziomie, więc nie ma wpływu na
poziom ekspresji genu docelowego po indukcji systemu przez IPTG, bo wtedy powstaje bardzo dużo
polimerazy fagowej. Lizozym T7 posiada ponadto zdolność hydrolizowania wiązań β-1,4-
glikozydowych w peptydoglikanie ściany komórkowej bakterii, co ułatwia późniejszą lizę komórek i
uwolnienie z nich żądanego produktu białkowego. Ponieważ cząsteczki lizozymu znajdują się
wewnątrz komórek gospodarza i nie mogą przedostać się przez błonę komórkową do warstwy
peptydoglikanu, liza komórek bakteryjnych zachodzi dopiero po naruszeniu struktury błony w
początkowych etapach zabiegów prowadzących do izolacji białek. Komórki gospodarza bakteryjnego
posiadają ponadto zmutowane geny lon i ompT kodujące proteazy. Zabezpiecza to powstające białko
przed degradacją w trakcie procesu oczyszczania. System Tabora-Studiera został skonstruowany
głównie do wydajnej produkcji białek toksycznych dla komórek gospodarza E. coli BL21(DE3) pLysS.
Dzięki temu ekspresja klonowanych genów zachodzi w ściśle określonym przez eksperymentatora
czasie, po indukcji systemu przez IPTG. W początkowej fazie następuje namnożenie komórek w
hodowli do odpowiedniej gęstości, a dopiero w następnym etapie indukuje się produkcję białek,
które mogą spowodować śmierć komórek gospodarza. W przypadku, gdy produkt klonowanego genu
nie jest toksyczny dla komórek bakterii, zwykle jego biosynteza spowalnia wzrost komórek i w efekcie
końcowa wydajność produkcji jest niższa. Używając systemu ekspresji Tabora-Studiera eliminuje się
ten problem. Dodatkowo, po namnożeniu hodowli można blokować ekspresję genów gospodarza
przez dodanie do pożywki rifampicyny, antybiotyku, który selektywnie inaktywuje bakteryjną
polimerazę RNA, a nie działa na fagową, co dodatkowo zwiększa poziom ekspresji klonowanego
genu.

58. WYMAGANIA GENETYCZNE GOSPODARZA BAKTERYJENEGO W KLONOWANIU MOLEKULARNYM

Transformacja E.coli i selekcja pożądanych klonów:

• wzrost E. coli do fazy logarytmicznej, optymalne dla komórek kompetentnych
• ekspozycja CaCl

2

, utrzymywana w temp. -70°C, następnie szok cieplny 42°C

E. coli host cell characteristics:

• No native restriction endonucleases –

brak natywnych/rodzimych ograniczeń

endonukleaz

• Generally unable to exchange DNA with other E. coli (RecA-) -

generalnie niezdolny

do wymiany DNA z inną E.coli (RecA-)

• Do not encode for the endA1 endonuclease –

nie koduje endonukleazy endA1

59. EKSPRESJA GENU

Transkrypcja jest enzymatyczną syntezą RNA na matrycy DNA. Jest to pierwszy etap procesu ekspresji
genów, który ostatecznie prowadzi do syntezy białka kodowanego przez gen. Transkrypcja jest
katalizowana przez polimerazę RNA, wymagającą obecność matrycy dsDNA i prekursorów
rybonukleotydów: ATP, GTP, CTP, UTP. Synteza zawsze zachodzi w ustalonym kierunku od końca 5’
do 3’. Zwykle jedna z nici DNA jest transkrybowana. Nić która jest aktualnie transkrybowana nazywa
się nicią matrycową (antysensowną), a drugą nić nicią sensowną.

Inicjacja

W procesie inicjacji polimeraza RNA wiąże się z dsDNA i inicjuje transkrypcję w miejsu zwanym
promotorowym. Promotory są sekwencjami DNA znajdującymi się na początku genu, od strony 5’,
przed regionem kodującym.
Aby matrycowa nić mogła brać udział w parowaniu zasad, DNA musi ulec lokalnemu rozpleceniu.
Rozplatanie zaczyna się w miejscu promotorowym, z którym wiąże się polimeraza RNA. Następnie
polimeraza inicjuje syntezę nici RNA w specyficznym miejscu, zwanym miejscem startu – miejscem
inicjacji.

Elongacja

Polimeraza RNA wiąże kowalencyjnie rybonukleotydy z końcem 3’ tworzącego się łańcuch RNA. A
zatem polimeraza RNA wydłuża powstający łańcuch w kierunku 5’→3’. W trakcie procesu enzym
przesuwa się wzdłuż antysensownej nici DNA (matrycy) w kierunku 3’→5’. W trakcie przesuwania się
enzymu, DNA ulega miejscowemu rozpleceniu. Nici DNA rozdzielają się, eksponując nić matrycową,
co umożliwia tworzenie par z zasadami rybonukleotydów i kowalencyjnie przyłączenie
rybonukleotydów do końca 3’ rosnącego łańcucha RNA. Za polimerazą tworzy się ponownie struktura
helisy. Polimeraza prowadzi tę reakcję z szybkością ok. 40 zasad/s w 37

o

C.

Terminacja

Czyli dysocjacja kompleksu transkrypcyjnego i zakończenie syntezy RNA, odbywa się w miejscu
specyficznej sekwencji DNA, określanym jako miejsce terminacyjne.

Ekspresja genu u prokariota

I eukariota

Z NETA

Ekspresja genu (

ang.

gene expression) – proces, w którym

informacja genetyczna

zawarta

w

genie

zostaje odczytana i przepisana na jego produkty, które są

białkami

lub różnymi formami

RNA

.

Przebieg tego procesu różni się nieco pomiędzy

bakteriami

i

eukariotami

. U bakterii geny są zwykle

zorganizowane w grupy genów zwane

operonami

(np.

operon laktozowy

), które są regulowane jako

grupa i przepisywane na zawierający kilka genów mRNA.
U eukariotów regulacja oraz przepisywanie na mRNA odnosi się do pojedynczego genu. Proces ten
zachodzi w kilku etapach (Eukariota, w uproszczeniu, dla genu kodującego białko):
- zainicjowanie

transkrypcji

genu przez

czynniki transkrypcyjne

- synteza

pre-mRNA

przez

polimerazę RNA

-

obróbka posttranskrypcyjna

, dzięki której powstaje dojrzały

mRNA

- transport mRNA z jądra komórkowego do

cytoplazmy

- rozpoznanie mRNA przez

rybosom

i

translacja

białka

- degradacja mRNA
-

fałdowanie białka

(nabywanie

struktury trzeciorzędowej białka

)

-

modyfikacje posttranslacyjne

, np.

glikozylacja

,

fosforylacja

- przemieszczenie białka do właściwej pozycji (np. błony komórkowej, mitochondrium, etc.) (może
poprzedzać poprzedni proces)
- funkcjonowanie białka – często najbardziej długotrwały i praktycznie jedyny etap w którym
uwidacznia się biologicznie,

fenotypowo

, informacja genu.

- degradacja białka

60. OPERONY I REGULATORY

- operon lac – pyt. 29 IG

- operon ara

• Innym operonem E.coli, który uczestniczny w metabolizmie cukru jest operon ara (arabiona)
• Zawiera:

o 3 geny strukturalne zaangażowane w metabolizm arabinozy

 araB, araA, araD

o pojedynczy promotor, P

BAD

o miejsce CAP, które wiąże catabolite (kataboliczne?) białko aktywatora

• Gen araC sąsiaduje z operonem ara

o Posiada swój własny promotor, P

C

o Koduje białko regulatorowe , AraC
o AraC może być związane do trzech różnych miejsc operatora

 określa araI, araO

1

i araO

2

• białko AraC wiąże się do wszystkich trzech operatorów

– dimer AraC związany z araO

1

hamuje transkrypcję genu araC

• To utrzymuje niski poziom białka AraC

– monomer AraC związany z araO

2

i araI

tłumi (repress) operon ara

• Wiążą się ze sobą (przez pętlę DNA) I blokują dostęp RNA pol do P

BAD

• Arabinoza wiąże się do białek AraC

– Interakcja pomiędzy białkami AraC w araO

2

i araI jest uszkodzona

• To powoduje przerwanie pętli DNA

– Kolejne białko AraC wiąże się do araI

• Ten dimer AraC w araI aktywuje transkrypcję

ar
a
O

1

- operon trp

• Operon trp bierze udział w biosyntezie aminokwasu tryptofanu

– Geny trpE, trpD, trpC, trpB i trpA kodują enzymy zaangażowane w biosyntezę

tryptofanu

– Geny trpR i trpL są zaangażowane w regulację

• trpR  koduje białko represora trp

– funkcje w represji

• trpL  koduje krótkie peptydy nazwane Leader peptide

– funkcje w osłabianiu

• Osłabienie/tłumienie u bakterii występuje z powodu sprzęgania transkrypcji I translacji
• Podczas osłabienia, transkrypcja dopiero się zaczyna, ale zostanie przerwana zanim całe

mRNA zostanie utworzone

– Fragment DNA, nazywany attenuator, jest ważny w ułatwianiu tego zakończenia
– W przypadku gdy, operon trp In the case of the trp operon, transkrypacja kończy się

niedługo po regionie trpL

– W ten sposób tłumienie hamuje dalszą produkcję tryptofanu
– Fragment operonu trp bezpośrednio za operatorem odgrywa kluczową rolę w

tłumieniu

– Pierwszym genem w operonie trp jest trpL

• Koduje krótkie peptydy nazywane Leader peptide

• Dlatego, tworzenie 3-4 macierzystej pętli prowokuje RNA pol do zakończenia transkrypcji na

końcu genu trpL

• Warunki, które sprzyjają tworzeniu się 3-4 macierzystej pętli polegają na translacji trpL mRNA
• Trzy możliwe scenariusze:

– 1. Brak translacji
– 2. Niski poziom tryptofanu
– 3. Wysoki poziom tryptofanu

Represor operonu tryptofanowego, kodowany przez gen trpR, jest produkowany w sposób ciągły.
Gdy w komórce brak jest tryptofanu represor pozostaje nieaktywny i nie blokuje
on transkrypcji genów struktury. W komórce występuje w postaci dimerów. Gdy stężenie tryptofanu
w komórce wzrasta, jego cząsteczki łączą się z nieaktywnym represorem. Następuje wówczas zmiana
konformacji represora, dzięki czemu staje się on aktywny (tryptofan jest tu korepresorem). Aktywny
represor

blokuje

operator,

co

uniemożliwia

związanie

się polimerazy

RNA zDNA i

prowadzenie transkrypcji genów operonu tryptofanowego (jest to więc system reprymowalny). Stan
taki utrzymuje się tak długo, aż stężenie tryptofanu w komórce się zmniejszy. Tryptofan jest stale
potrzebny w komórce, zatem kiedy go zabraknie, nieaktywny represor nie wiąże się z operatorem,
dzięki czemu geny operonu tryptofanowego ulegają transkrypcji.

Synteza łańcucha RNA rozpoczyna się od lidera. Sekwencja liderowego RNA zawiera wydajne miejsce
wiązania rybosomu. Produktem translacji liderowego RNA jest oligopeptyd, którego funkcja polega
na określaniu stężenia dostępnego tryptofanu i regulowaniu terminacji transkrypcji. Pomiędzy
sekwencją liderową a pierwszym genem struktury znajduje się atenuator, pełniący funkcję w regulacji
transkrypcji. Zawiera on krótką sekwencję palindromową G-C,po którym następuje osiem
cząsteczek adenozyny. Taka sekwencja ośmiu adenozyn transkrybowana daje na RNA osiem
cząsteczek uracylu. Kombinacja ta umożliwia utworzenie przez mRNA strukturę spinki do włosów,
czyli działa ona jak skuteczny terminator transkrypcji.