Instrukcja do Warsztatów (Ćwiczenie 3)

Rozdział białek metodą filtracji żelowej

i wyznaczanie ilości białka metodą Lowry’ego

CEL ĆWICZENIA:
Do rozdziału białek różniących się masą cząsteczkową zastosowano filtrację żelową.
W wyniku rozdziału uzyskano dwie frakcje o różnych czasach retencji. Celem ćwiczenia jest
oznaczenie stężenia białka w zebranych frakcjach przy zastosowaniu metody Lowry’ego.

ODCZYNNIKI I APARATURA:

1. Wzorzec białka 20mg% BSA (Bovine Seminal Albumin)
2. 2% Na

2

CO

3

w 0.1 M NaOH

3. 2% CuSO

4

4. 5% C

4

H

4

O

6

KNa • 4 H

2

O (uwodniony winian sodowo-potasowy)

5. 2N odczynnik Folina-Ciocalteu
6. Spektrofotometr do pomiarów w zakresie widzialnym

CZĘŚĆ I
Wykonanie krzywej wzorcowej

1. Przygotowanie odczynnika Lowry’ego do oznaczeń: do 15 ml 2% Na

2

CO

3

w 0.1 M

NaOH dodać 0.3 ml 5% C

4

H

4

O

6

KNa•4H

2

O (uwodnionego winianu sodowo-potasowego).

Dobrze wymieszać a następnie dodać 0.3 ml 2% CuSO

4.

2. Przygotowanie odczynnika Folina-Ciocalteu: 2N roztwór odczynnika Folina-Ciocalteu

rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 2:1 (woda:odczynnik). Potrzebna do
wykonania ćwiczenia końcowa objętość tego odczynnika wynosi 1.5 ml.

3. Zasada oznaczania:

•

•
•

w 9 probówkach przygotować odpowiednią objętość odczynnika Lowry’ego wg tabeli
dodać odpowiednie ilości wzorcowego roztworu 20mg% BSA
dobrze wymieszać i odczekać 10 minut.

Nr

Objętość

odczynnika Lowre’go [

µl]

Objętość

20mg% BSA [

µl]

1.

90 + 1000

10

2.

80 + 1000

20

3.

70 + 1000

30

4.

65 + 1000

35

5.

60 + 1000

40

6.

55 + 1000

45

7.

50 + 1000

50

8.

45 + 1000

55

9. 1100

ŚLEPA PRÓBA

po 10 minutach do każdej probówki dodać po 100

µl przygotowanego wcześniej

odczynnika Folina-Ciocalteu

•

•
•

•

dobrze i energicznie wymieszać, odczekać 15 minut
po tym czasie zmierzyć absorbancję próbek przy długości fali równej

λ=660 nm

względem próby ślepej
wyniki oznaczeń zanotuj w poniższej tabeli:

Nr Absorbancja

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

CZĘŚĆ II
Oznaczenie stężenia białka w zebranych frakcjach

1. Stosując te same procedury co w części I przygotuj cztery probówki i odpowiednie

odczynniki.

2. Wykonaj analizę dla trzech próbek białka o nieznanym stężeniu (pamiętaj o próbce

referencyjnej). Wyniki zanotuj w tabeli:

Nr

Nazwa próbki

Objętość

próbki

[

µl]

Objętość

odczynnika

Lowry’ego [

µl]

Objętość

odczynnika

Folina [

µl]

Absorbancja

1. przed

rozdziałem

2

98 + 1000

100

2. I frakcja

6

94 + 1000

100

3. II frakcja

3

97 + 1000

100

OPRACOWANIE WYNIKÓW I DYSKUSJA:

Na podstawie odczytanych wartości absorbancji dla roztworów BSA 20mg% wykreślić

krzywą wzorcową (zależność stężenia od absorbancji).

Korzystając z otrzymanej krzywej wzorcowej i odczytanych absorbancji dla trzech

badanych próbek (przed rozdziałem, I frakcja, II frakcja) odczytać zawartość białka w
badanej próbce i obliczyć stężenie białka podając je w mg/ml.

LITERATURA:

1. Lowry O. H., N. J. Rosebrough A.L. Farr, Randall R. J. “Protein measurement with the Folin-Phenol

reagents”, J. Biol. Chem., 193 (1951), 265-275

2. Dubin A, Turyna B. „Praktikum z biochemii dla studentów biologii i biotechnologii” IBM UJ 2001
3. Kłyszejko – Stefanowicz L. „Ćwiczenia z biochemii”, PWN 1999
4. L. Stryer „Biochemia”, PWN 1999 i nowsze wydania
5. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W. „Biochemia Harpera”, Wydawnictwo

Lekarskie PZWL, 2002