3. Elementy
technologii
liposomowej
Liposomy, jak już wspomniano (s. 58), są zamkniętymi strukturami uzyskiwany-
mi podczas hydratacji fosfolipidów. Możliwość ich powstawania wynika z wyjąt-
kowo korzystnych wartości HLB fosfolipidów jako amfifilów oraz kształtu ich
cząsteczek, dzięki czemu większość fosfolipidów preferuje tworzenie agregatów
dwuwarstwowych. Już podczas pierwszych badań przy użyciu najprymitywniej-
szych liposomów, czyli wielowarstwowych pęcherzyków (zwanych też ręcznie
wytrząsanymi liposomami), stwierdzono, iż struktury te są w stanie zamykać
i przechowywać roztwory solutów. Ponieważ skład błony liposomalnej można
łatwo zmieniać, dlatego też początkowo liposomy stanowiły jeden z głównych
układów modelowych w badaniach nad właściwościami i strukturą błon biologi-
cznych. Z czasem model ten zaczął ulegać coraz dalej idącym zmianom i obecnie
skład błon liposomowych coraz bardziej zbliża się do składu błon naturalnych.
Liposomy tworzy się nie tylko z różnych typów, ale i klas lipidów, wbudowuje
w ich błony Sterole, a także funkcjonalne cząsteczki białek błonowych. Liposomy
służą nawet do badań, w których śledzi się izolowane procesy przebiegające
w organellach, a nawet komórkach. Badania nad liposomami jako modelowymi
błonami biologicznymi zaowocowały również wielością metod pozwalających na
otrzymywanie różnorodnych rodzajów liposomów. Te poszukiwania coraz to
nowych technik uzyskiwania liposomów wynikały z faktu, że nie znaleziono
jeszcze sposobu uzyskiwania uniwersalnego liposomu. Jedne techniki są proste,
lecz umożliwiają otrzymywanie liposomów składających się z wielu koncentry-
cznie zamkniętych przedziałów wodnych, inne natomiast dają wprawdzie twory
otoczone tylko jedną dwuwarstwa, lecz o zbyt małych w porównaniu do komórki
rozmiarach. Jeszcze innym powodem kontynuacji prac nad liposomami, które
przekształciły się w oddzielną gałąz
badań zwaną technologią liposomową, była
chęć praktycznego wykorzystania zdolności zamykania solutów w strukturach
utworzonych z naturalnych składników błon biologicznych, a więc obojętnych
immunologicznie. Głównymi celami technologii liposomowej są:
- Opracowanie postępowania umożliwiającego wprowadzanie solutów do
wnętrza komórek w sposób ukierunkowany i kontrolowany. Tymi solutami mogą
być np. przeciwciała, antygeny, fragmenty kwasów nukleinowych, a nawet całe
chromosomy. Wprowadzanie tego typu solutów umieszczonych w strukturach
zamkniętych typu liposomu zapobiega m.in. niepożądanym reakcjom ubocznym
i równocześnie chroni je przed np. degradacją, której ulegałyby podczas bezpo-
3. l. Techniki preparacji liposomów 91
średniego podawania. Jednym z efektów badań nad wprowadzaniem solutów do
komórek za pośrednictwem zamkniętych struktur błonowych było stwierdzenie,
że również cienie erytrocytów mogą być używane do tego celu.
- Opracowania takich technologii, dzięki którym dawki leków normalnie
toksycznych w stanie wolnym mogłyby ulec obniżeniu przy zachowaniu tej samej
lub wyższej skuteczności. Z drugiej strony niezmiernie ważnymi zagadnieniami
są: poprawienie farmakodynamiki leków podawanych w liposomach, uczynienie
liposomów niewykrywalnymi przez system makrofagów oraz opracowanie meto-
dy przechowywania liposomów w stanie nie zmienionym przez odpowiednio
długi okres czasu.
3.1. Techniki preparacji liposomów
W odpowiedzi na potrzeby uzyskiwania określonego typu liposomów wymaga-
nych dla konkretnych zastosowań, w okresie ostatniej dekady metody preparacji
różnych typów liposomów uległy szybkiemu rozwojowi. Wartość metody lub
kombinacji metod zależy przede wszystkim od potrzeb badacza i zakładanego
sposobu ich wykorzystania. Pewne metody są bardziej użyteczne dla jednych
celów, podczas gdy inne dla drugich. Ocena różnych metod opierająca się na
klasyfikacji i zastosowaniach różnorodnego typu liposomów będzie podana poni-
żej. Jeszcze innym kryterium jest stwierdzenie, czy dana metoda nadaje się
szczególnie dla skali laboratoryjnej (1-100 ml liposomów o stężeniu 10-100
mg/ml), skali półprodukcyjnej (do 10l zawiesin o stężeniu 100-300 mg/ml), czy
też skali produkcji przemysłowej (ponad 10l o stężeniu do 400 mg/ml).
Mimo wielkiej liczby rozmaitych technik preparacji uzyskiwane liposomy
można podzielić na trzy główne grupy:
1. liposomy wielowarstwowe (MLV),
2. małe jednowarstwowe liposomy (SUV),
3. duże jednowarstwowe liposomy (LUV).
ad l. Jeżeli nie ma ograniczeń czy też preferencji w stosunku do rozmiarów
i budowy, wielowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne w przypadkach
zamykania solutów lipofilowych lub też wtedy, gdy efektywność zamykania
roztworów wodnych nie jest istotna. Na skalę laboratoryjną odpowiednią techniką
jest klasyczna metoda hydratacji cienkiego filmu lipidowego (opisana już w po-
przednim rozdziale), która może być uzupełniona  wymiarowaniem" uzyskanych
liposomów przez przeciskanie ich przez filtry membranowe o porach określonej
średnicy. Gdy chodzi o większą skalę produkcji liposomów, należy stosować inne
postępowania, takie jak liofilizacja, suszenie rozpylonej zawiesiny, czy też
wstrzykiwania wraz z odparowywaniem rozpuszczalnika. Jeżeli wymagana jest
wysoka zdolność enkapsulacyjna rozpuszczalnych w wodzie solutów, należy roz-
3. Elementy technologii liposomowej 92
MLV
1 mikrometr
04-10
1.8-7 l/mol
LUV
0.05-1.0
2.4 - 3.1 l/mol
SUV
002-003
0.23 - 0.8 l/mol
Rys. 24. Główne typy liposomów i ich
podstawowe parametry
ważyć zastosowanie następujących metod: (a) odparowywania fazami odwróco-
nymi, (b) metodę zamrożeniowo-rozmrożeniową lub dehydratacyjno-rehydrata-
cyjną w połączeniu z wymiarowaniem lub (c) wymiarowania, homogenizacji czy
też wstrzykiwania i odparowywania rozpuszczalnika. Metoda (c) jest szczególnie
przydatna do preparacji większych ilości liposomów (do objętości l 1).
ad 2. Dla pewnych zastosowań wąski zakres rozmiarów i wysoki stosunek
powierzchni do objętości małych jednowarstwowych liposomów czyni je bardzo
przydatnymi, szczególnie gdy nie jest wymagana wysoka wydajność enkapsulacji
wodorozpuszczalnych solutów. Do ich preparacji na skalę laboratoryjną stosuje
się dezintegrację ultradz
więkami, prasę Frencha lub wstrzykiwanie roztworów
etanolowych. Wybór pomiędzy tymi metodami zależy od dostępności sprzętu
oraz istotności obecności w preparatach resztkowych (7-10%) ilości etanolu.
ad 3. Duże jednowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne do wydajne-
go zamykania rozpuszczalnych w wodzie solutów z powodu preferującej objętość
przestrzeni wodnej wartości stosunku objętości do powierzchni. Liposomy tego
typu są również pożądane do rekonstytucji białek błonowych, a także badań nad
przepuszczalnością i fuzją błon. Do rekonstytucji białek błonowych najczęściej
stosowane są metody usuwania detergentów, podczas gdy najbardziej wydajną
metodą uzyskiwania wysokiego stopnia zamykania rozpuszczalnych w wodzie
solutów, w tym makrocząsteczek, jest metoda odparowywania fazami odwróco-
nymi. Metody te uzupełnia się kalibrowaniem uzyskanych liposomów. Gdy pro-
ces ten wykonywany jest pod wysokim ciśnieniem, przy dużych stężeniach lipidu
i przy stosowaniu filtrów błonowych o małej średnicy porów, uzyskiwane liposo-
my są nie tylko homogenne w wielkości, ale również posiadają wysoką zdolność
enkapsulacyjną.
Powstawanie pęcherzyków liposomalnych opisują dwa główne modele: model
3.1 Techniki preparacji liposomów 93
 pączkowania" oraz model  fuzji fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej".
W modelu  pączkowania" pęcherzyki powstają w czasie stopniowego uwadnia-
nia suchych fosfolipidów. Suche, cienkie warstewki fosfolipidów posiadają stru-
kturę warstwową identyczną z dwuwarstwa; podczas uwadniania roztwór wodny
wnika pomiędzy poszczególne dwuwarstwy powodując ich rozdzielanie i powsta-
wanie pączkujących zaczątków pęcherzyków, podobnych do obserwowanych
w echinocytozie (echinocytoza - proces tworzenia wypustek błony plazmatycznej
nadających krwinkom jeżopodobny kształt). Pęcherzyki podczas mechanicznego
wytrząsania hydratowanego fosfolipidu odrywają się, a jako że powstały z wielu
warstw suchego fosfolipidu, stają się wielowarstwowymi liposomami. Poddanie
tych pęcherzyków drganiom rezonansowym ultradz
więków powoduje dalsze
odpączkowywanie małych, jednowarstwowych pęcherzyków. Podobnie  homo-
genizujące" i reorganizujące działać będzie przeciskanie dużych pęcherzyków
przez małe pory filtrów membranowych. W modelu  fuzji fragmentów dwuwar-
stwy fosfolipidowej" intermediatem, niezależnie od techniki stosowanej do uzy-
skania finalnych liposomów są mniej lub bardziej płaskie fragmenty dwuwarstwy,
z których dopiero na drodze fuzji powstają zamknięte pęcherzyki, których wiel-
kość zależy od wtórnej ich obróbki. Na Rys. 25 przedstawiono schemat klasyfika-
cji różnych metod preparacyjnych pęcherzyków liposomalnych opracowany
zgodnie z założeniami omawianego modelu.
Poniżej zostaną przedstawione niektóre z procedur stosowanych do uzyskania
różnego rodzaju pęcherzyków liposomalnych. Do charakterystyki uzyskanych
preparatów stosuje się m.in. określanie wartości tzw. objętości zamkniętej (captu-
red volume) definiowanej jako objętość roztworu wodnego zamknięta przez daną
ilość lipidu i jest wyrażana w litrach/mol lipidu całkowitego oraz tzw. wydajność
zamykania (encapsulation efficiency) definiowana jako część roztworu, która jest
zamknięta w liposomach. Ten drugi parametr jest wprost proporcjonalny do stę-
żenia lipidu w preparacie liposomowym.
Materiały, odczynniki i roztwory:
chloroformowe roztwory lecytyny, cholesterolu, fosfatydyloetanolaminy, fosfa-
tydyloseryny, kwasów tłuszczowych i innych lipidów o stężeniu 60 źmoli/ml;
roztwór związku barwnego do określania parametrów zamykania w liposomach
(zob. dośw.  Samoorganizacja fosfolipidów");
10% roztwór Tritonu X-100;
eter etylowy;
etanol absolutny;
napęczniały żel Sephadex G-50 lub G-75.
Sprzęt:
wyparka próżniowa;
dezintegrator ultradz
więkowy;
ekstruder liposomowy;
azot w butli.
3. Elementy technologii liposomowej 94
P
CHERZYK LIPOSOMOWY
(fuzja)
dwuwarstwowe fragmenty fosfolipidowe
narastanie dwuwarstw bezpośrednie tworzenie w
rozbicie wcześniej
przez zmianę czasie pęcznienia
istniejących
rozpuszczalności
w zawiesinie
fosfolipidów w zawiesinie
fosfolipidowej
poprzez usuwanie
dwuwarstw
na szablonie chemicznie
chemiczne
mechaniczne
elektrostatyczne fazy organicznej ko-rozpuszczalnika
ultradz
więki zmiany pH dodanie krótko- metody jony topografia indukowana
łańcuchowych wstrzykiwania chaotropowe powierzchni
fosfolipidów roztworów
prasa Frencha usunięcie odparowanie detergentów
jonów wapnia fazami
odwróconymi
przeciskanie
przez filtry
membranowe
intensywne
mieszanie
Rys. 25. Klasyfikacja różnych metod preparacyjnych pęcherzyków liposomalnych opracowana
zgodnie z założeniami modelu tworzenia pęcherzyków przez fuzję fragmentów dwuwarstwy
fosfolipidowej
3.1.1. Efekt stosowanej techniki preparacyjnej
na pojemność liposomów
a) Klasyczne wielowarstwowe liposomy (MLV)
(wg Bangham A. D., de Gier J., Greville G. D., Chem. Phys. Lipids l (1967) 225-246)
Postępowanie:
" W kolbce okrągłodennej do wyparki poj. 50-100 ml umieścić l ml roztworu
lecytyny i odparować rozpuszczalnik do uzyskania cienkiego, suchego filmu
lipidowego; kolbkę umieścić w eksykatorze próżniowym nad CaCl2 na
2 godz.
" Dodać do kolbki l ml roztworu barwnika i zawiesić lipid przez energiczne
3.1. Techniki preparacji liposomów 95
wstrząsanie zawartości do chwili zawieszenia całości fosfolipidu i uzyskania
jednorodnej mlecznej zawiesiny.
" Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w sposób opisany na końcu tej części
rozdziału.
b) Wielowarstwowe liposomy o zwiększonej pojemności.
Technika zamrożeniowo-rozmrożeniowa (FAT-MLV)
(wg Hope M. J , Bally M B., Mayer L. D., Janoff A. S., Culhs P. R., Chem. Phys. Lipids. 40
(1986)89-107)
Postępowanie:
" Przygotować wielowarstwowe liposomy w sposób opisany powyżej (pkt 1).
" Zawiesinę liposomów przenieść do plastikowej probówki i poddać ją 7-10
cyklom zamrażania w mieszaninie suchego lodu (stały CO2) z acetonem i roz-
mrażania w ciepłej (ok. 400C) wodzie.
" Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.
c) Wielowarstwowe liposomy
otrzymywane przez dehydratację-rehydratację
(wg Shew R. L., Deamer D. W., Biochim. Biophys. Acta 816 (1985) 1-10)
Postępowanie:
" Przygotować MLV w sposób opisany w pkt. l.
" Liposomy poddać procesowi liofilizacji.
" Suchy materiał po zliofilizowaniu rehydratować przez delikatne wytrząsanie
z l ml wody destylowanej.
" Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.
d) Małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV)
(wg Papahadjopoulos D., Miller N., Biochim. Biophys. Acta 135 (1967) 624-638)
Postępowanie:
" Przygotować MLV w sposób opisany w pkt. l.
" Umieścić uzyskane liposomy w cienkościennej probówce plastikowej i pod-
dać działaniu ultradz
więków w dezintegratorze lub w zaadaptowanej myjce
ultradz
więkowej przez okres konieczny do uzyskania klarownej próbki.
W przypadku dezintegratora stosować cykle - 3 min. dezintegracji, 5 min
przerwy.
" Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.
3. Elementy technologii liposomowej 96
e) Małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV),
metodą wstrzykiwania roztworów etanolowych
(wg Batzri S., Korn E. D., Biochim. Biophys. Acta 298 (1973) 1015-1019)
Opisana metoda jest równie efektywna, jak ultradz
więki, ale szybsza i bezpiecz-
niejsza (unika się oksydacji lipidów w czasie sonikowania). Uzyskane SUV w za-
leżności od składu lipidowego mają średnice 20-60 nm.
Materiały:
10-30 mM roztwory lipidów w czystym etanolu.
Sprzęt:
l ml strzykawka Hamiltona z cienką igłą umieszczona w aparacie do infuzji;
naczynie szklane o średnicy ok. 2 cm i poj. ok. 15 ml otoczone płaszczem termo-
statującym;
mieszadło magnetyczne z mieszadełkiem o wielkości odpowiedniej do naczynia
szklanego;
statyw z łapą.
Postępowanie:
" 250-750 źl etanolowego roztworu fosfolipidów wstrzykiwać szybko i równo-
miernie do naczynia zawierającego 10 ml odpowiedniego roztworu wodnego
utrzymywanego w temperaturze wyższej od temperatury przejścia fazowego
żel-ciekły kryształ używanego lipidu oraz intensywnie mieszanego. Końcowe
stężenie etanolu nie może przekroczyć 7.5% (v/v).
" Etanol z gotowej zawiesiny usunąć przez 2-3-krotną dializę wobec l-litro-
wych porcji buforu. Uzyskane pęcherzyki można w razie potrzeby zagęszczać
w aparacie Amicon przy użyciu błony XM-100A o odpowiedniej średnicy.
W ten sposób można uzyskać preparaty o stężeniu 80-100 mM lipidu liposo-
mowego. W czasie ultrafiltracji należy stosować intensywne mieszanie. Straty
liposomów w tym procesie nie przekraczają 2%.
" Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.
f) Preparacja dużych jednowarstwowych liposomów (LUVET)
(wg Hope M. J., Bally M. B., Webb G., Cullis P. R., Biochim. Biophys. Acta 812 (1985)
55-65)
Postępowanie umożliwia uzyskanie dużych jednowarstwowych i o określonych
wymiarach liposomów bez stosowania detergentów czy rozpuszczalników orga-
nicznych. Liposomy mają dużą wydajność zamykania i dobrze określoną średni-
cę; są szczególnie przydatne do badań wiązania białek metodami stosującymi
wirowania.
3.l. Techniki preparacji liposomów 97
Materiały i odczynniki:
zawiesina FAT-MLV liposomów (zob. pkt 2);
suchy lód;
aceton.
Sprzęt:
ekstruder liposomowy;
filtry membranowe z poliwęglanu - Nucleopore (400-100 nm pory);
butla z azotem.
Postępowanie:
" Przygotować ekstruder do pracy (zob. instrukcja obsługi).
" Zawiesinę FAT liposomów przepuścić 10-krotnie przez pory błony kalibrują-
cej ich rozmiary.
" Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.
g) Duże jednowarstwowe liposomy,
metodą odparowywania faz odwróconych
(wg Szoka F., Papahadjopoulos D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75(1978)4194-4198)
Postępowanie:
" Umieścić l ml roztworu lipidu w kolbie do wyparki i odparować chloroform.
" Lipid rozpuścić w 6 ml mieszaniny chloroformu z eterem izopropylowym
(1:2) lub w 6 ml eteru etylowego i przenieść do zlewki poj. 50 ml, dodać 3 ml
roztworu wodnego barwnika (doprowadzić pH roztworu do 7.4).
" Zlewkę umieścić w myjce ultradz
więkowej wypełnionej ogrzaną do ok. 400C
wodą i poddać działaniu ultradz
więków przez 5-10 min do utworzenia mlecz-
nej emulsji.
" Uzyskaną emulsję przenieść do kolbki o poj. 100 ml i umieścić w wyparce
(łaz
nia wyparki wypełniona wodą o temperaturze ok. 500C).
" Odparowywać rozpuszczalnik z emulsji zwiększając próżnię w aparacie sto-
pniowo, gdyż emulsja wykazuje tendencję do silnego pienienia się i  zarzuca-
nia".
" Po osłabnięciu pienienia zwiększyć próżnię do maksimum (ok. 2.5 x l04 Pa)
i kontynuować odparowywanie jeszcze przez 5 min.
" Przenieść liposomy do oddzielnego naczynia i oznaczyć w nich wielkość obję-
tości zamkniętej.
3. Elementy technologu liposomowej 98
3.1.2. Duże jednowarstwowe liposomy
 obciążone" sacharozą, metodą solubilizacji
detergentem niejonowym i dializy
(wg Mimms L. T., Zampighi T., Nozaki Y., Tanford C., and Reynolds J. A., (1981)
Biochemistry 20 (1081) 83-841)
Jedno- lub kilkuwarstwowe duże (średnica 150-300 nm) pęcherzyki fosfolipido-
we tworzy się poprzez solubilizację fosfolipidów w łatwo usuwalnym, tzn. chara-
kteryzującym się wysokim CMC, łagodnym detergencie, takim jak dezoksycho-
lan lub oktyloglukozyd. Następnie usuwa się detergent metodą dializy lub sącze-
nia molekularnego na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-50. Uzyskane
pęcherzyki lipidowe wypełnione są roztworem, w którym zrównoważona jest
kolumna. Technikę tę można stosować do rekonstytucji błon z wyizolowanych
białek i lipidów, do analizy oddziaływań białek i innych związków z błonami.
Materiały i roztwory:
roztwory chloroformowe lipidów;
150 mM NaCl, l mM EGTA w 10 mM buforze Tris-HCl, pH 7.5;
ten sam bufor zawierający 300 mM sacharozę.
Postępowanie:
" 10 mg lipidów np. fosfatydylocholina/cholesterol 9:1, po dokładnym odparo-
waniu rozpuszczalnika organicznego rozpuścić w 0.5 ml buforu do rekonsty-
tucji zawierającym 300 mM sacharozę oraz 30 mg/ml oktyloglukozyd (n-okty-
lż-�-D-glukopyranozyd) lub 15 mg/ml dezoksycholan sodowy.
" Całość nanieść na kolumnę wypełnioną żelem Sephadex G-50 (medium,
l x 25 cm) zrównoważoną buforem do rekonstytucji zawierającym 300 mM
sacharozę. Chromatografię prowadzić najlepiej w 4�C z szybkością wypływu
0.2-0.5 ml/min. Frakcje zawierające pęcherzyki lipidowe charakteryzują się
znaczną mętnością i mogą być rozpoznane bez użycia spektrofotometru.
" Aby usunąć roztwór znajdujący się poza pęcherzykami należy połączone
frakcje zawierające pęcherzyki rozcieńczyć dziesięciokrotnie w buforze do
rekonstytucji (bez sacharozy) i odwirować przy 30 000 x g.
3.2. Oznaczanie objętości
zamkniętej w liposomach
Postępowanie:
" Przygotować kolumnę o rozmiarach 10-15 x 300-500 mm wypełnioną napę-
czniałym żelem Sephadex G-50 i zrównoważyć ją roztworem, w którym był
rozpuszczony barwnik zamykany w liposomach.
3 2. Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach 99
" Nanieść na kolumnę badaną zawiesinę liposomów i, po jej całkowitym wnik-
nięciu do żelu, eluować kolumnę czystym roztworem do chwili wymycia
liposomów.
" Z zawiesiny uwolnionych od nie zamkniętego w nich barwnika liposomów
pobrać dwie jednakowej wielkości próbki. W jednej oznaczyć ilość lipidu
poprzez fosfor, a do drugiej dodać równą objętość 10% Tritonu X-100, zmie-
szać i zmierzyć jej absorbancję przy długości fali równej E stosowanego
max
barwnika. Oznaczyć również absorbancję (po odpowiednim rozcieńczeniu)
roztworu barwnika używanego do eksperymentów. Objętość zamkniętą obli-
czyć wg wzoru:
objętość zamknięta (l/mole lipidu) =
[lipid] w l ml liposomów
Wyniki przedstawić w formie tabeli porównującej preparaty uzyskane różny-
mi metodami.
3.2.1. Wpływ składu lipidowego
na objętość zamkniętą
Postępowanie:
" Zmieszać odpowiednie ilości roztworów lipidów dla uzyskania mieszanin
o podanym poniżej stosunku molowym:
1. PC
2. PC - Chol 90:10
3. PC - Chol 70:30
4. PC - PS 50:50
5. PC - l8:0 FA 80:20
6. PC - l8:0 FA 50:50
" W kolbkach do wyparki umieścić po l ml tych mieszanin i odparować z nich
rozpuszczalnik.
" Do każdej mieszaniny dodać po l ml roztworu barwnika i przygotować z nich
liposomy metodą FAT-MLV (zob. pkt 2).
" Oczyścić uzyskane preparaty od nie zamkniętego barwnika poprzez sączenie
na kolumnie z żelem Sephadex i oznaczyć objętość zamykania uzyskanych
liposomów. Wyniki przedstawić w tabeli.
3. Elementy technologii liposomowej l00
3.3. Określanie trwałości
i stabilności liposomów
Użyteczność wprowadzania wodorozpuszczalnych leków w postaci zamkniętej
w liposomach, tak in vivo, jak in vitro, zależy istotnie od stabilności nośnika
liposomowego, tj. szybkości, z jaką zamknięte w liposomie rozpuszczone w roz-
tworze wodnym cząsteczki (leki, enzymy itp.) będą wyciekać w zależności od
warunków zewnętrznych. Jest to szczególnie istotne w trakcie opracowywania
nowych technologii, gdzie np. stabilne in vitro w roztworach soli liposomy okazu-
ją się całkowicie niestabilne w obecności surowicy lub też odwrotnie. Do badania
stabilności liposomów używa się metod, w których oznacza się poziom wycieku
cząsteczek markerowych zamkniętych w liposomach. Takimi cząsteczkami mogą
być enzymy, związki drobnocząsteczkowe znakowane izotopowe, a także niektó-
re barwniki fluorescencyjne. Poniżej przedstawimy metodę badania stabilności
liposomów przy użyciu karboksyfluoresceiny (CF).
3.3.1. Uwalnianie karboksyfluoresceiny
jako miernik stabilności liposomów
(wg Weinstein J. N., Ralston E., Leserman L. D., Klausner R. D., Dragsten P., Henkart P.,
Blumenthal R., w: Liposome Technology (Gregonadis G. red.) CRC Press, Boca Raton,
1984, vol. III, s. 183-204)
Zasada metody opiera się na zjawisku tzw. samowygaszania fluorescencji. Pewne
barwniki fluorescencyjne tracą zdolność do fluorescencji, gdy znajdują się w roz-
tworze w odpowiednio wysokich stężeniach. Tak więc fluorofor zamknięty w li-
posomach w takich stężeniach będzie emitował jedynie kilka procent światła z tej
ilości, którą emituje po uwolnieniu i rozcieńczeniu w otaczającym medium, czy
też cytosolu komórki. Autorzy wykazali, że dobrze rozpuszczalny w wodzie
fluorofor, 5(6)-karboksyfluoresceina (CF) zamknięta w liposomach w stężeniu
100-200 mM, praktycznie nie fluoryzuje, tak że cała obserwowana fluorescencja
zawiesiny liposomów pochodzi od cząsteczek fluoroforu uwolnionych z wnętrza
pęcherzyków do środowiska. Te właściwości karboksyfluoresceiny stały się pod-
stawą w badaniach nie tylko stabilności liposomów, ale i do określania ich objęto-
ści zamykania, interakcji liposomów z komórkami, właściwości barierowych
błon liposomalnych, a także procesów fuzji.
Materiały i roztwory:
roztwory chloroformowe lipidów (30 mM);
5(6)-karboksyfluoresceina (CF), (MW 377, Ex 490, Em 520);
0.14 M NaCl w 10 mM buforze Hepes (lub Tris-HCl) pH 7.4;
10% roztwór Tritonu X-100;
3.3. Określanie trwałości i stabilności liposomów 101
10 mM bufor Tris-HCl, pH 7.4;
6 M NaOH;
napęczniały w buforze Tris-HCl, pH 7.4, żel Sephadex LH 20.
Oczyszczanie karboksyfluoresceiny
" 7.5 g CF umieścić w zlewce o poj. 50 ml, umieścić w łaz
ni wodnej (45-50�C)
ustawionej na mieszadle magnetycznym i powoli przy stałym mieszaniu oraz
kontrolowaniu pH pehametrem dodawać 6 M NaOH tak, by nie przekroczyć
pH 7.5 i uzyskać całkowite rozpuszczenie fluoroforu (ok. 10 ml).
" Uzyskany roztwór CF nanieść na szczyt wypełnionej żelem Sephadex LH 20
zrównoważonej buforem Tris-HCl kolumny (25 x 400 mm) i eluować 10 mM
buforem Tris-HCl o pH 7.4, zbierając 2 ml frakcje. Barwnik wypływa zwykle
we frakcjach 8-10, co określa się przez badanie fluorescencji 20-krotnie roz-
cieńczonych próbek.
" Stężenie barwnika w połączonych frakcjach określić używając współczynnika
ekstynkcji molowej E487= 7.5 x l04, rozcieńczyć buforem do stężenia 100 mM.
" Pozostałe na kolumnie zanieczyszczenia wymyć przez jej przemycie kolejno
5 obj. układów: etanol/bufor (1:1), etanol, etanol/chloroform (1:1), chloro-
form, a następnie powrócić do buforu stosując te same roztwory, lecz w od-
wrotnej kolejności.
Przygotowanie liposomów do badań
" Z roztworów lipidów przygotować mieszaniny zawierające:
1. ĄC (60 źmoli);
2. PC (30 źmoli) - Chol (30 źmoli);
3. PC (30 źmoli) - PS (30 źmoli).
" Odparować rozpuszczalnik i przygotować w sposób opisany wcześniej liposo-
my (FAT-MLV) w 2 ml roztworu CF.
" Oddzielić liposomy od nie zamkniętej w nich karboksyfluoresceiny przez
sączenie molekularne na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-50 i eluo-
wanej 0.14 M NaCl w 10 mM buforze Tris-HCl pH 7.4.
3.3.2. Badanie wpływu surowicy
na trwałość liposomów
Postępowanie:
" W kuwecie spektrofluorymetru umieścić 2 ml roztworu zawierającego suro-
wicę o różnych rozcieńczeniach w 0.14 M NaCl - 10 mM Tris-HCl pH 7.4,
odczekać na ustabilizowanie temperatury (42�C).
" Włączyć rejestrator i rozpocząć rejestrację zmian fluorescencji.
" Do kuwety wstrzyknąć 10 źl liposomów z CF i rejestrować wzrost fluorescen-
cji przez 10 min.
3. Elementy technologii liposomowej 102
" Dla wyznaczenia całkowitej fluorescencji CF zamkniętej w liposomach
wstrzyknąć do kuwety 10 źl roztworu Tritonu X-100. Detergent spowoduje
uwolnienie pozostałej w nich CF. Uzyskany poziom fluorescencji będzie
określać 100% możliwej do uzyskania w danych warunkach fluorescencji.
" Przeprowadzić w identyczny sposób pomiary uwalniania CF z liposomów
w roztworach zawierających wzrastające stężenia surowicy.
" Powtórzyć doświadczenie używając liposomów o innym składzie lipidowym.
Uzyskane wyniki przedstawić w postaci zależności czasowej procentu uwal-
niania CF z liposomów inkubowanych w obecności różnych stężeń surowicy.
W podobny sposób można badać też wpływ temperatury na stabilność liposo-
mów.