1

ĆWICZENIE 3

U

NIERUCHAMIANIE GLUKOZAMYLAZY NA CHITYNIE

Glukoamylaza (EC 3.2.1.3) jest egzoamylazą, która prowadzi rozkład wiązania

α-(1,4) – glikozydowego od nieredukującego końca łańcucha skrobi, odszczepiając cząsteczki
glukozy; a ponadto zdolna jest do hydrolizy wiązania α-(1,6) glikozydowego
w amylopektynie (reakcja przebiega jednak wielokrotnie wolniej). Z technologicznego punktu
widzenia należy do amylaz scukrzających, obok niektórych α-amylaz i β-amylaz.

Przemysłowa synteza glukoamylazy jest prowadzona przez pleśnie Aspergillus niger

NRRL 337, Aspergillus awamori i Aspergillus foetidus. Pierwsze technologie produkcji
glukoamylazy pojawiły się na początku lat 50. Roczna światowa produkcja wynosi kilka ton
w postaci proszku, najwięcej produkuje się jej jednak w postaci roztworu zawierającego kilka
procent enzymu. Przy użyciu glukoamylazy rocznie produkuje się kilkanaście milionów ton
hydrolizatów skrobiowych. Glukoamylaza jest często używana w mieszaninie z α-amylazą
i izomerazą glukozową, szczególnie przy produkcji syropów wysokofruktozowych ze skrobi.
Obecnie w Polsce jedynym producentem preparatów amylolitycznych są Zakłady Przemysłu
Owocowo-Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle.

Chityna jest polisacharydem obojętnym z grupy homoglikanów, zbudowanym

z cząsteczek N-acetyloglukozaminy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi w długie
i nierozgałęzione łańcuchy. Fragment łańcucha chityny przedstawiono na poniższym rysunku.

Łańcuchy chityny ułożone równolegle w pęczki i połączone wiązaniami wodorowymi tworzą
mikrofibryle, podobnie jak celuloza, co nadaje im znaczną wytrzymałość. W efekcie chityna
pełni rolę substancji podporowej w ścianach komórek niektórych grzybów i glonów. Jest
także głównym składnikiem strukturalnym pancerzyków stawonogów. Chityna jest bardzo
odporna na działanie czynników chemicznych; można przeprowadzić jej hydrolizę przy
pomocy stężonego HCl. Chityna może być degradowana do mono- i oligomerów
N-acetyloglukozaminy przez chitynazy. Enzymy te są szeroko rozpowszechnione wśród
bakterii, znaleziono je także u roślin, pierwotniaków, nicieni i stawonogów.

Przez depolimeryzację i częściową deacetylację łańcuchów chityny otrzymuje się

chitozan, będący poliaminą używaną jako nośnik w immobilizacji enzymów, bądź całych
komórek mikroorganizmów.

2

Chitozan jest często wykorzystywany jako nośnik do immobilizacji enzymów

stosowanych w przemyśle spożywczym. Jest on tani (chityna do produkcji chitozanu jest
uzyskiwana m.in. z pancerzy skorupiaków morskich takich jak krewetki, kraby, kryl
antarktyczny, stanowi więc odpad przemysłu spożywczego), łatwo dostępny, nietoksyczny i
wykazuje szereg pozytywnych cech takich jak hydrofilność, duże powinowactwo do białek,
porowatość, duża powierzchnia adhezji. Posiada liczne grupy funkcyjne –OH oraz –NH

2

,

które łatwo wiążą enzymy. Wykazuje także właściwości antybakteryjne i jest mało podatny
na degradację mikrobiologiczną. Chitozan jest nierozpuszczalny w wodzie, ale rozpuszcza się
w roztworach kwaśnych. W formie rozpuszczonej jest silnie naładowany dodatnio i może
tworzyć nierozpuszczalne w wodzie agregaty ze związkami polianionowymi. Ulega również
precypitacji w roztworach o wysokim pH. Dzięki tym cechom można go formować w różna
kształty: kulki, włókna, kapsułki, membrany i inne. Ograniczenia w przemysłowym
stosowaniu płatków lub kulek chitozanowych jako nośnika wynikają natomiast ze zbyt dużej
gęstości w stosunku do wody i delikatnej tekstury. Problem ten można rozwiązać poprzez
stosowanie chitozanu w połączeniach np. ze sproszkowaną gliną.








WYKONANIE ĆWICZENIA

Przygotowanie nośnika: 2,5 g handlowej chityny zalać 50 ml 25% HCl i pozostawić

w temperaturze pokojowej na 2 h. Po tym czasie przemywać wodą destylowaną do uzyskania
odczynu obojętnego. Następnie zalać chitynę 50 ml 25% NaOH i umieścić w temperaturze
90

0

C (suszarka) na 2h. Ponownie płukać wodą destylowaną do uzyskania odczynu obojętnego

i wysuszyć w suszarce z przewiewem w temp. 50

0

C. Tak przygotowaną chitynę można

przechowywać maksymalnie 24 godziny. Na tak przygotowanym nośniku glukoamylaza jest
adsorbowana przy pomocy słabych nieswoistych sił van der Waalsa i wiązań wodorowych.

Przygotowanie enzymu do immobilizacji:

2 ml handlowego preparatu glukoamylazy

NOVO II rozcieńczyć do 100 ml wodą destylowaną (1:50). Z tego, celem oznaczenia
aktywności wyjściowej, pobrać 1 ml do kolby miarowej na 100 ml, uzupełnić wodą
i wymieszać (1:5000). Po dodatkowym trzykrotnym rozcieńczeniu (1 ml + 2 ml wody→
1:15000) oznaczyć aktywność glukoamylazy.

Pozostałe 99 ml roztworu enzymu rozcieńczonego 1:50 mieszać w zlewce na 250 ml

(mieszadło magnetyczne) z chityną przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
Po tym czasie chitynę z immobilizowanym enzymem odsączyć na spieku G3, przemywając
wodą destylowaną (około 150 ml), potem 0,02 M buforem octanowym o pH 4,5 (100 ml
zimnego buforu i 100 ml ogrzanego buforu). Przesącz zbierać ilościowo do kolby miarowej
na 500 ml i oznaczyć w nim aktywność glukoamylazy niezwiązanej z nośnikiem. Przed
analizą na aktywność przesącz rozcieńczyć dodatkowo 10 razy.

Pakowanie kolumny: Przemyty osad chityny z immobilizowanym enzymem zebrać

ze spieku do zlewki na 250 ml, popłukując buforem octanowym o pH 4,5, ogrzanym do
temperatury około 37

o

C. Pakować kolumnę za pomocą pipety o pojemności 10 ml z obciętym

końcem

(Uwagi „techniczne”: złoże zawiesić w dość dużej ilości wody; przed pobraniem pipetą

3

mieszać bagietką złoże w zlewce; podczas pakowania mieszać górę złoża końcówką pipety; przy
pierwszym pipetowaniu końcówkę umieścić głęboko przy dnie kolumny)

. Stosować kolumnę z

płaszczem termostatowym K1, 6/20. Uważać by cząsteczki chityny nie uległy
frakcjonowaniu.

Praca kolumny: kolumnę równoważyć (przepłukiwać) dogrzanym do temperatury

37

o

C buforem octanowym o pH 4,5 przez 20 minut z szybkością naturalnego wypływu (około

2 ml/minutę). Po tym czasie przepuścić przez kolumnę w ten sam sposób 50 ml 2% roztworu
skrobi rozpuszczonej w 0,02 M buforze octanowym o pH 4,5. Na koniec podłączyć pompę
(wężyk przetłokowy 2 mm ) i pompować ciepły roztwór skrobi (37-38

0

C) na kolumnę z

szybkością od 40-100 ml/h (pierwsze 30 min szybkość pompowania 0,6 ml/min, następne
30 min szybkość 0,3 ml/min). Frakcje schodzące z kolumny, o objętości około 2 ml każda,
zbierać do probówek między 3 i 6min, 9 i 12; 15 i 18 min itd. Po zmianie szybkości odczekać
15 min i zebrać frakcje jak wyżej.
Zaraz po zebraniu frakcje zagotować (10 min) i ostudzić. Następnie rozcieńczyć 25 razy, tzn.
do 0,5 ml zagotowanej frakcji dodać 12 ml wody i wymieszać. Z tak rozcieńczonych frakcji
do analizy na obecność cukrów redukujących brać po 2 ml.
Jednocześnie, stosując tę samą metodą z DNS oznaczyć tło (kontrola) tj. zawartość cukrów
redukujących w roztworze skrobi pompowanej na kolumnę (przed wykonaniem analizy
metodą z DNS, roztwór skrobi zagotować (10 min.)).

Obliczenia:

1. Na podstawie

aktywności glukoamylazy oznaczonej (metodą z oksydazą glukozową

oraz metodą z DNS) w wyjściowym

preparacie i w

roztworze pozostałym po procesie

wiązania preparatu z nośnikiem, obliczyć procentowo ilość enzymu związanego.

2. Na podstawie oznaczeń zawartości cukrów redukujących w wyjściowym roztworze

skrobi i frakcjach zbieranych z kolumny, obliczyć procent konwersji skrobi do
glukozy dla dwóch różnych szybkości pompowania substratu na kolumnę.

Metody analityczne

A. Oznaczanie aktywności glukoamylazy (metoda z oksydazą glukozową)

Zasada:
β− D−glukoza + O

2

→ kwas glukonowy + H

2

O

2

(oksydaza glukozowa)

H

2

O

2

+ (ODA)

red

→ H

2

O + (ODA)

oksy

(peroksydaza)

(ODA)

oksy

+ H

2

SO

4

→ (ODA)

oksy

SO

4

Powstający kompleks (ODA)

oksy

SO

4

daje maximum absorpcji przy λ = 530 nm.

(ODA)

red

− ortodianizydyna zredukowana

(ODA)

oksy

− ortodianizydyna utleniona

4

Odczynniki:

1. Substrat - 2% roztwór skrobi o pH 4,5 (2,2 g skrobi rozpuścić w około 80 ml wrzącej

wody destylowanej, gotować 3 minuty. Po ostudzeniu dodać 10 ml 1 M buforu
octanowego o pH 4,5, uzupełnić do 100 ml, przesączyć).

2. Reagent GOX:
a) tris-bufor 0,5 M (61g trójhydroksymetyloaminometanu rozpuścić w wodzie dodać 5 ml

5 M HCl, uregulować pH na 7,1 i dopełnić do 1000 ml),

b) oksydaza glukozowa (12 mg/100 ml GOX),

c) roztwór peroksydazy (4 ml 20 mg% roztworu w tris-buforze lub 1 mg na 100 ml GOX),

d) roztwór o-dianizydyny (0,6 ml 1% roztworu w 96% etanolu nieskażonym). W tris-

buforze rozpuścić 12 mg oksydazy glukozowej, dodać 4 ml roztworu peroksydazy
i 0,6 ml o-dianizydyny, uzupełnić trisem do 100 ml.

3. 2,5 M H

2

SO

4

(138,8 ml stęż. H

2

SO

4

uzupełnić wodą do 1000 ml)

4. standardy glukozowe (z roztworu glukozy o stężeniu 10 mg%):

stężenie

glukoza

woda

0 mg% -

0,0 ml

1,0 ml

2 mg% -

0,2 ml

0,8 ml

4 mg% -

0,4 ml

0,6 ml

6 mg% -

0,6 ml

0,4 ml

8 mg% -

0,8 ml

0,2 ml

10 mg% -

1,0 ml

0,0 ml

Postępowanie:
1. Próby właściwe: 0,5 ml roztworu enzymu (odpowiednio rozcieńczonego) ogrzewać

w ultratermostacie w temperaturze 30

o

C przez 5 minut. Dodać 0,5 ml roztworu skrobi

(stoper!). Dokładnie po 30 minutach (od dodania skrobi) dodać 3 ml odczynnika GOX,
wymieszać i dokładnie po 60 minutach dodać 5 ml 2,5 M H

2

SO

4

, wymieszać, wyjąć

z ultratermostatu. Odczytać ekstynkcję przy 530 nm.

2. Próba kontrolna: do 0,5 ml enzymu dodać 3 ml GOX i 0,5 ml skrobi, inkubować

w temperaturze 30

o

C przez godzinę. Po tym czasie dodać 5 ml H

2

SO

4

i dalej postępować

jak z próbą właściwą.

3. Wzorce glukozowe: do 1 ml roztworu wzorcowego (0, 2, 4, 6, 8 i 10 mg%) dodać

3 ml GOX. Inkubować dokładnie 60 minut w temperaturze 30

o

C. Dodać 5 ml H

2

SO

4

,

wymieszać i odczytać ekstynkcję. Sporządzić krzywą wzorcową, z której odczytać
stężenie glukozy w próbach kontrolnych i właściwych (próba właściwa – kontrola = ∆)

Obliczenia:
Aktywność glukoamylazy (GA) wyrazić jako ilość mikromoli glukozy wytworzonej przez
1 ml enzymu w ciągu 1 godziny w temperaturze 30

o

C.

5

B. Oznaczanie cukrów redukujących z DNS

Zasada: oznaczania cukrów redukujących metodą z kwasem 3,5-dwunitrosalicylowym
polega na utlenieniu grup redukujących w produktach powstałych w wyniku enzymatycznej
degradacji skrobi i jednoczesnej redukcji cząsteczek kwasu 3,5 dwunitrosalicylowego do
kwasu 3,5 dwuaminosalicylowego. Procesowi temu towarzyszy zmiana barwy, której
natężenie oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali równej 530 nm.

C O O H

O H

N O

2

O N

2

+

C -H

O

R

4

C OO H

O H

N H

H N

2

2

+

4 C -OH

O

R

kwas 3,5 dwunitrosalicylowy

kwas 3,5 dwuaminosalicylowy

żółtopomarańczowy czerwonobrunatny

Odczynniki:

1. Odczynnik DNS (0,5 g DNS + 1,6 g NaOH lub 20 ml 2 M NaOH + 30 g winianu

Na-K). Winian, lekko ogrzewając, rozpuścić w wodzie. Dodać zawiesinę DNS
w możliwie dużej objętości wody, poczym dodać ług. Uzupełnić objętość do 100 ml.
Po 1-2 dniach odsączyć przez spiek.

2. Wzorzec glukozy 120 mg%

nr

stężenie [mg%]

glukoza [ml]

woda [ml]

1

0

0,000

2,000

2

10

0,170

1,830

3

20

0,330

1,670

4

40

0,670

1,330

5

60

1,000

1,000

6

80

1,330

0,670

7

100

1,670

0,330

8

120

2,000

0,000

Wykonanie:

Oznaczenie przeprowadzić w skalowanych probówkach.

Próby właściwe: 0,5 ml enzymu (odpowiednio rozcieńczonego) ogrzewać z 1 ml buforu w
ultratermostacie w temperaturze 30

o

C przez 5 minut. Dodać 0,5 ml roztworu skrobi (stoper).

Dokładnie po 30 min. dodać po 2 ml DNS.

Próby kontrolne: 0,5 ml enzymu + 1 ml buforu + 2 ml DNS (zamieszać). Dodać 0,5 ml
skrobi.

Próby właściwe, kontrolne i wzorce gotować 5 minut na wrzącej łaźni wodnej (stoper). Po
ostudzeniu dopełnić wodą destylowaną do 20 ml w probówkach skalowanych, wymieszać
i od razu czytać absorbancję przy 550 nm.

Literatura:

Cieśliński H., Filipkowski P., Kur J., Lass A., Wanarska M., 2007. Podstawy mikrobiologii przemysłowej.

Ćwiczenia laboratoryjne. wydawnictwo Politechniki Gdańskiej.