Biologia molekularna 2

Budowa DNA

Egbert

Piasecki

26-02-2014

Nukleotydy i kwasy nukleinowe

Nukleozyd = zasada azotowa + ryboza lub deoksyryboza

Nukleotyd = nukleozyd + grupa fosforanowa (x1, x2 lub x3)

Rybonukleotydy

Deoksyrybonukleotydy

…..

Nukleotydy i kwasy nukleinowe

Nukleotydy w kwasach nukleinowych:

Pirymidyny:

Puryny:

Cytozyna (C)

DNA

RNA

Guanina (G)

DNA

RNA

Tymina (T)

DNA

-----

Adenina (A)

DNA

RNA

Uracyl (U)

-----

RNA

Nukleotydy i kwasy nukleinowe

Nukleotydy w kwasach nukleinowych:

Pirymidyny:

Cytozyna (C)

DNA

RNA

Tymina (T)

DNA

-----

Uracyl (U)

-----

RNA

Puryny:

Guanina (G)

DNA

RNA

Adenina (A)

DNA

RNA

Informacja genetyczna

1869 –

odkrycie DNA

(Miesoher) – kwasowa substancja w jądrze

komórkowym: „nukleina”

1889 – Altmann – termin „

kwas nukleinowy

”

1900 – poznano

zasady purynowe i pirymidynowe

XIX/XX w. – geny (inf. genet.)

są przenoszone w chromosomach

zbudowanych z DNA i białka. Jako nośnik genów typowano białka z
powodu większej (jak się wydawało)
komplikacji budowy

Lata 20-te XX w. – rozróż-

nienie

DNA i RNA

1928 – Badania

Griffitha

nad Pneumococcus:
przekazywanie cech
bakterii – transformacja
szczepu R w szczep S

Informacja genetyczna

Lata 40-te XX w. – informacja genetyczna

zbiorem

instrukcji

dotyczących wytwarzania białek

Lata 40-te XX w. – prawdopodobnym

nośnikiem

informacji genetycznej jest DNA

, chociaż

pozorna prostota jego budowy (tylko 4 rodzaje
monomerów) wydawała się przeczyć temu

1944 – Doświadczenie Avery’ego, MacLeoda

i McCarty’ego –

wyjaśnienie

chemicznej natury

czynnika

transformującego bakterie:

DNA

Informacja genetyczna

1952 – Hershey i Chase – ostateczny dowód, że

geny są zbudowane z DNA

1953 – Watson, Crick –

struktura

DNA

: podwójna helisa

 wnioski dotyczące

replikacji informacji
genetycznej i jej kodowania

Budowa DNA

Cząsteczka DNA –

2 łańcuchy

polinukleotydowe (łańcuchy
lub nici DNA)

- 4 rodzaje podjednostek

nukleotydowych:

A, C, G, T

-

Wiązania wodorowe

pomiędzy

łańcuchami,
komplementarność puryna
(A, G)–pirymidyna (C, T): A=T
i G=C

-

Polarność

łańcucha DNA: koniec

5’ i koniec 3’

Budowa DNA

Dwuniciowa helisa: ułożenie

antyrównoległe

łańcuchów

Budowa DNA

Dwuniciowa helisa

: średnica helisy: 2

nm, odległość sąsiednich zasad
0,34 nm 1 skręt – 10 zasad
= 3,4 nm, rowek większy i
mniejszy



05.1-

DNA_structure.mov

Budowa DNA

Trzy rodzaje helis DNA:

• B-DNA

– prawoskrętna, rowek duży i mały

• Z-DNA

– lewoskrętna, kształt zygzakowaty,

większa odległość między pz (0,77 nm),
1 skręt=12 pz

• A-DNA

– prawoskrętna, rzadka postać,

tylko przy niskiej wilgotności i w stanie

bezwodnym,
także w hybrydach
DNA-RNA i dsRNA,
głęboki rowek duży,
płaski rowek mały

Przejście B-DNAZ-DNA: na ograniczonym

odcinku

długiej cząsteczki, wskutek rotacji

zasad

Metylacja cytozyny w pozycji 5 ułatwia

przekształcanie w

Z-DNA

Istnieją białka swoiście wiążące Z-DNA 

niewyjaśnione

znaczenie dla regulacji

transkrypcji

Budowa DNA

• A-DNA

–rzadka postać, tylko przy

niskiej wilgotności i w stanie
bezwodnym, także w hybrydach DNA-
RNA i dsRNA, głęboki rowek duży,
płaski rowek mały

Budowa DNA

Denaturacja

(mocznik, podgrzanie, zasady, formamid) i

renaturacja

nici

komplementarnych – podstawa metod identyfikacji kwasów
nukleinowych –

hybrydyzacja

Hybrydyzacja =

Tworzenie

dwuniciowej

struktury przez

komplementarne

nici kwasów

nukleinowych

DNA

Superhelisa

DNA

Kolisty DNA, liczba opleceń (Lk),

zwinięcie dodatnie lub ujemne

Prawie wszystkie cząsteczki DNA w

komórkach są ujemnie
superzwinięte (także pętle
liniowego DNA)

Typowa wartość ΔLk/Lk

0

= -0,06

(6 dodatkowych zwojów na 1000
pz = 100 skrętów helisy)

Topoizomery

– cząsteczki kolistego

DNA różniące się liczbą opleceń

Konformacyjna elastyczność – zwoje i

skręty

Wr – liczba zwojów

Tw – liczba skrętów

ΔLk = ΔTw + ΔWr

DNA

Topoizomerazy

– enzymy regulujące stopień superzwinięcia DNA

Enzymy typu I przecinają 1 nić DNA i zmieniają liczbę opleceń o ±1

Enzymy typu II przecinają 2 nici DNA i zmieniają liczbę opleceń o ±2

Większość topoizomeraz zmniejsza stopień superzwinięcia

Gyraza DNA (bakteryjny enzym typu II) – wprowadza ujemne w miejsce

dodatniego superzwinięcia, umożliwia replikację DNA

Topoizomerazy typu II mogą rozłączać cząsteczki DNA powstające w

czasie replikacji

Energia superzwinięcia

– superhelikalny DNA ma większą energię niż

DNA zrelaksowany  ułatwione rozplatanie helisy np. inicjacja

transkrypcji, replikacji

Interkalatory

– np. bromek etydyny wiąże się z DNA

wchodząc pomiędzy pary zasad  lokalne

rozwinięcie helisy o 26

o

 zmiana kształtu

w kierunku bardziej zrelaksowanego

Chromosom prokariotyczny

Chromosom– zazwyczaj kolisty, ale są wyjątki: liniowy, np. Borrelia,

Brucella

(

nukleoid

) – zwykle w 1 części, ale może być do 3 chromosomów, mogą

być

mieszane: kolisty i liniowy, np. Agrobacterium: 2

nukleoidy

– jeden poziom organizacji nukleoidu, stopień upakowania ok.

1000 x

– od 0,6 do 8,7 Mpz, 480-7600 genów, np. Escherichia coli: 4,6
Mpz

– kilkaset pętli (100-500), o długości 10-100 kpz, długość i

położenie

pętli są zmienne

– ujemnie superhelikalny

Białka wiążące DNA

(histono-podobne):

• Białko HU – małe, zasadowe, dimer,

wiąże DNA przez owijanie wokół
własnej cząsteczki

• Białko H-NS (dawniej H1) – monomer,

obojętny, preferencyjnie wiąże się
z rejonami zagięć helisy DNA

Połowa superhelikalności jest wymuszona przez trwałe owinięcie DNA

wokół białek takich jak HU. Druga połowa skrętów superhelikalnych nie
jest wymuszana

Chromosomy eukariotyczne

Jądro komórki ludzkiej ma 5-8 μm średnicy i zawiera ok. 2 m DNA

DNA jest

upakowane w chromosomy

. Wyspecjalizowane białka wiążąc się z

DNA fałdują go tworząc uporządkowaną strukturę. Upakowany DNA
pozostaje dostępny dla enzymów związanych z replikacją, naprawą i
ekspresją genów (nie dotyczy heterochromatyny)

Genom człowieka

: 3,2 mld nukleotydów w 24 chromosomach

Chromosom

– 1 nić DNA związana z białkami

Chromatyna

– kompleks DNA i białek

Kariotyp

– zestaw chromosomów komórki, u człowieka 46 chromosomów

Liczba chromosomów

: bardzo różna, od 6 (mundżak indyjski, jeleniowate)

do >100 (gatunek karpiowatych), 108 (skrzyp polny)

Chromosomy eukariotyczne

Prążki

– powstają po wybarwieniu (barwnik Giemsy: zaciemnienie rejonów

bogatych w AT), charakterystyczne dla chromosomów, pozwalają
identyfikować chromosomy,
rozpoznawać anomalie

Cykl komórkowy

Replikacja DNA, rozdzielenie do komórek potomnych

Interfaza

– duplikacja chromosomów

Mitoza

– rozdzielenie do jąder potomnych

Chromosom

Miejsce początku replikacji

– sekwencja nukleotydowa, w której rozpoczyna

się duplikacja DNA, u eukariontów zwykle wiele miejsc początku replikacji

Telomery

– na końcach chromosomu, powtórzone w setkach kopii sekwencje

nukleotydowe (

u człowieka 5’-TTAGGG-3’

) dzięki którym końce

chromosomów mogą być replikowane. Pozwalają odróżnić koniec
chromosomu od zerwanej nici DNA wymagającej
naprawy,
zabezpieczają końce
chromosomów przed
degradacją i
skracaniu końców
chromosomu w
trakcie replikacji
(niemożność
skopiowania końców),
syntetyzowane przez
telomerazę

Centromer

– miejsce

przyczepu wrzeciona
mitotycznego

Chromosom

Chromosom interfazowy

– w formie rozproszonej – rozciągnięte,

splątane nici DNA w jądrze

Jądro – chromosomy prawdopodobnie zajmują określone miejsce w

jądrze

Jąderko – skupienia części różnych chromosomów zawierających geny

rRNA – synteza rRNA i składanie rybosomów

Chromosom mitotyczny

– najbardziej skondensowana forma (stężenie

DNA: do 200 mg/ml)

DNA

Kondensacja DNA

w chromosomach:

Rozwinięty DNA chr. 22 – 1,5 cm

DNA w chr. interfazowym – 15 μm

DNA w chr. mitotycznym - 2 μm

Białka

zwijają i fałdują

DNA. Upakowanie chromosomów jest zmienne

DNA

Nukleosom

– podstawowa jednostka struktury chromatyny (podstawowy

poziom upakowania DNA)

Białka wiążące DNA w chromosomach eukariotycznych:

■ histony

■ białka niehistonowe

DNA + białka = chromatyna

DNA

Pierwszy stopień upakowania DNA

–

utworzenie nukleosomów
przekształcające DNA w nić chromatyny
(1/3 początkowej długości)

Rdzeń nukleosomu – 8 cząsteczek histonów:

2xH2A, 2xH2B, 2xH3, 2xH4

(oktamer

histonowy, histony rdzeniowe)

Na nukleosom przypada 146 pz DNA (1,65

skrętu helisy)

DNA łącznikowy – od kilku do ponad 100 pz

(przeciętnie 55 pz)

DNA

Histony

:

■ małe białka (10-23 kDa), 20-30% Liz i Arg (dodatnio

naładowane aa) – wiązanie z ujemnie naładowanym szkieletem
DNA

■ białka konserwatywne np. H4 grochu i wołu ma tylko 2 aa

różnicy

■ N-końcowy „ogon” wystający na zewnątrz, podatny

na modyfikacje

Nukleosom + histon H1 =

chromatosom

Histon H5 – zastępuje H1 w DNA nie

ulegającym transkrypcji

Cała

ujemna superhelikalność

eukariotycznego DNA wynika z nawinięcia
DNA na nukleosomy i jest strukturalnie
wymuszona

DNA

Drugi stopień upakowania

DNA

:

– włókna o średnicy 30 nm –

histon H1 łączy nukleosomy
w zwarty szyk

– nukleosomy są zwinięte w

lewoskrętną helisę
(=solenoid), 1 obrót = 6
nukleosomów

–

model zygzaka, różny

stopień

rozciągnięcia

DNA

Trzeci stopień upakowania DNA

:

– Pętle  chromatyna rozproszona

w chromosomie interfazowym.
Przypomina DNA prokariotyczne

Czwarty stopień upakowania DNA

:

– Sfałdowanie  chromatyna

skondensowana w chromosomie
interfazowym i mitotycznym

Generalna zasada: rejony

chromosomu z genami
ulegającymi ekspresji są bardziej
rozproszone, a z genami
wyciszonymi są bardziej
skondensowane



05.2-

chromosome_coil.mov

DNA

Heterochromatyna

– najbardziej skondensowana

chromatyna interfazowa, transkrypcyjnie nieaktywna,
około 10% chromosomu, głównie rejon centromeru i
telomerów, prążki C

Euchromatyna

– pozostała część chromatyny w różnych

stanach rozproszenia, prążki G: jasne (dużo genów,
struktura bardziej rozluźniona) i ciemne (mało genów,
struktura bardziej skondensowana)

DNA

Heterochromatyna i

euchromatyna

Samice XX

– trwała inaktywacja jednego

chromosomu X poprzez kondensację w
heterochromatynę. Mozaika komórek u
samic

Efekt
pozycyjny

DNA

Euchromatyna

:

– regiony częściowo nieaktywne
– regiony aktywnie transkrybowane

(struktura „sznura koralików”, ok. 10%

euchromatyny)

DNaza I

– rozcina DNA odsłonięty,

niezwiązany z białkami
(=transkrybowany lub dostępny dla
białek regulacyjnych)

Metylacja CpG

– metylacja C

5

cytozyny w

sekwencji 5’-CG-3’. Większość takich
sekwencji w genomie jest zmetylowana
(=transkrypcyjnie nieaktywna)

„Wyspy CpG”

– niezmetylowane, wiele

sekwencji CG (ok. 2000 pz), b.wrażliwe
na DNazę I, otaczają regiony
promotorowe genów powszechnie
ulegających ekspresji („housekeeping
genes”). Obszary tych genów są
zazwyczaj wolne od nukleosomów

DNA

Dostęp do DNA

– zmiany w strukturze nukleosomu

Miejsca bezpośredniego dostępu do DNA są ograniczone – odsłonięte

są tylko rejony ulegające aktualnie ekspresji

Sposoby szybkiego dostosowania struktury chromatyny do

wymogów bieżącej ekspresji przez komórki eukariotyczne:

1.

Kompleksy remodelujące chromatynę

–

zmiana struktury nukleosomów
zwiększająca dostępność DNA dla białek
komórkowych związanych z replikacją,
naprawą i ekspresją genów

Podczas mitozy – inaktywacja części

kompleksów remodelujących

DNA

2.

Odwracalna modyfikacja „ogonów” histonowych

Każdy „ogon” histonowy podlega kilku typom modyfikacji

kowalencyjnej przez enzymy jądrowe

Modyfikacja „ogonów” histonowych  zmiana zdolności do wiązania

innych białek, które mogą zwiększać lub zmniejszać kondensację
chromatyny

Genom

Komplet informacji genetycznej danego organizmu =

genom

Gen

– fragment DNA zawierający instrukcje do wytworzenia

określonego białka. Ale: niektóre geny kodują RNA  Gen =
jednostka funkcjonalna

Liczba genów

: od 3 (niektóre wirusy), przez 500 (proste bakterie), do

kilkudziesięciu tysięcy (m.in. ssaki, np. człowiek)

Minimalna liczba genów

niezbędna do funkcjonowania komórki: 200-

300

Najmniejsza liczba genów

wykryta w organizmie komórkowym

(Carsonella ruddii – endosymbiont wszy) - 182

Wielkość genomu

wzrasta wraz ze

złożonością organizmu.
Ale: człowiek ma genom 30 razy
mniejszy niż niektóre rośliny
i 200 razy niż gatunek ameby

Upakowanie genów w chromosomie:

• Wirusy – często geny zachodzące
• Bakterie i jednokomórkowe eukarionty – geny obok siebie
• Eukarionty wielokomórkowe – duża ilość DNA nie przenosząca (?)

informacji [tzw. „śmieciowy DNA”]

DNA jako nośnik informacji genetycznej:

1. W jaki sposób informacja jest zapisana?





2. Jak informacja jest powielana?

 REPLIKACJA

3. Jak informacja jest odczytywana?

 TRANSKRYPCJA,

TRANSLACJA

Genom