Budowa DNA: DNA- kwas dezoksyrybonukleinowy – występuje w komórce w postaci podwójnej nici spiralnie za sobą skręconych w
postaci tzn. helisy,, każda nic zbudowana jest z pojedynczych „cegiełek” zwanych nukleotydami.
W skład nukleotydu DNA wchodzą: cukier C 5- deoksyryboza ,reszta kwasu fosforowego, jedna z zasad azotowych:
-adenina (A),tymina (T), cytozyna (C), - guanina (G) Reguła komplementarności: A=T
DNA- zawiera informację genetyczną komórki (organizmu).
RNA- kwas rybonukleinowy. Występuje w komórce w postaci jednej nici i jest wierną kopią DNA, a zatem umożliwia realizowanie
informacji genetycznej. Jego podstawową jednostką budulcową jest nukleotyd zbudowany z:
a) cukier C 5- ryboza, reszta kwasu fosforowego, jedna z zasad azotowych:
-adenina (A), -urazyl (U), -cytozyna (C), -guanina (G).
3 rodzaje RNA: -mRNA – matrycowa RNA- powstaje na matrycy DNA i jest roboczą kopią genu.
-tRNA – transportowy RNA- transportuje aminokwasy do miejsca biosyntezy białek,
-rRNA- rybosomalny RNA- wchodzi w skład rybosomów i uczestniczy w biosyntezie białka.
DNA w komórce występuje: - w jądrze, mitochondriach, plastydach (u roślin),
RNA w komórce występuje: -w jądrze, cytoplazmie, rybosomach.
Replikacja DNA- podwojenie ilości DNA w komórce bezpośrednia przed podziałem.
Przebieg replikacji: polimeraza DNA znajduje na nici DNA miejsce inicjacji replikacji. Takich miejsc w obrębie jednej cząsteczki DNA jest
wiele, z tąd replikacja przebiega na w wielu miejscach jednocześnie.
w miejscu inicjacji replikacji następnie rozplecenie podwójnej helisy. W tym miejscu powstają tzw. widełki replikacyjne.
w widełkach replikacyjnych polimeraza DNA ustawia naprzeciwko każdemu nukleotyd.
Nowe nukleotydy łączą się replikacja DNA pół zachowawcze - nowa cząsteczka DNA zawiera nić starą i jedną nić nową.
Celem replikacji- jest dokładne skupione cząsteczki DNA i następnie przekazane komórkom potomnym identycznej informacji genetycznej.
Miejsce łączenia się helis to miejsce inicjacji
Replikacja –ciągła synteza Synteza fragmentami Polimeraza DNA III
- katalizuje krok po kroku przyłączenie deoksyrybonukleotydów do nowego łańcucha DNA
- katalizuje wytwarzanie wiązania fosfodiestrowegomiędzy grupą –OH na końcu 3’, a fragmentami na końcu 5’ deoksyrybonukleotydu
Składniki niezbędne do syntezy DNA - odcinek starterowy – jego syntezę katalizuje enzym PRUMAZA
- matryca DNA - jony Mg, -5’ – trifosforanydeoksyrybonukleotydów (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
Enzymy i białka uczestniczące w replikacji DNA:
- Helikaza uczestniczy w rozpleceniu nici DNA - wiązanie białek stabilizujących rozwinięcie nici
- prymaza – syntezuje krótki starterowy odcinek RNA - polimeraza DNA III syntezuje łańcuch DNA
- polimeraza DNA I – usuwa starter - ligaza – łączy odcinki DNA (tzw. Fragmenty okazaki)
Transkrypcja – przepisywanie informacji z DNA na mRNA
Nowy RNA jest syntetyzowany zgodnie z regułą komplementarności w stosunku do nici stanowiącej szablon
- katalizowana przez enzym polimeraza zgodnie z matrycą DNA - substancjami są trifosforanyrybonukleozydów
- synteza mRNA odbywa się w kierunku 5’→3’ - obejmuje trzy etapy: inicjację, elongację, terminację
-transkrypcja rozpoczyna się od końca 5’ a jej początek ma miejsce w rejonie zwanym promotorem
- są to rejony w matrycy DNA, które wiążą polimerazę RNA i determinują miejsce startu transkrypcji
- eukariota : w rejonie -25-kasetaTATA, w rejonie -75- kaseta CAAT
- proces transkrypcji inicjuje połączenie polimerazy RNA z promotorem
REPLIKACJA DNA: proces podwojenia ilości DNA. Zachodzi w fazie S (podwojenie ilości histonów ) .
REPLIKACJA SEMIKONSERWATYWNA : (półzachowawcza) - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić
macierzysta i jedna nowa.
-semikonserwatywna
[rozplątanie heliksa, a potomne cząstki DNA są w połowie nowe, a w połowie ze starej nici]
-konserwatywna
[macierzysta cząsteczka DNA nie ulega rozplątaniu, powstaje jedna nowa cząsteczka DNA,
-przypadkowa
[macierzysta cząsteczka DNA ulega fragmentacji, nowa nić zawiera elementy starej i nowej nici]
PRZEBIEG PROCESU :INICJACJA, ELONGACJA, TERMINACJA
U PROKARIOTA : INICJACJA : naga nić w postaci α- helisy , aby można było utworzyć nową nić :
rozplecenie nici DNA : pomiędzy nici wnika
białko inicjatorowe DNA A
, które zgina nić, naprężenie wiązań wodorowych i rozerwanie
wnika kolejne białko enzymatyczne
HELIKAZA
: aby zapobiec powstawaniu ponownie α-helis. powstają
WIDEŁKI REPLIKACYJNE
: 1
oczko (=widełki) replikacyjne. tuż obok miejsca
ORI
(miejsce początku replikacji)
wchodzi kolejny enzym
PRYMAZA
: wytwarza
PRIMERY
( odcinki RNA komplementarne do DNA )
ELONGACJA : Wydłużanie nowopowstałego łańcucha DNA Warunki: - duża ilość wolnych nukleotydów
- dostarczona energia, obecność związków wysoko energetycznych . Donor energii : trifosforany nukleozydu (TTP , CTP, GTP, ATP)
- enzym katalizujący proces * musi mieć miejsce aktywne przestrzennie pasujące do nukleotydów.
- zachowana komplementarność dobudowywanych nukleotydów
*
enzym
: - czyta tylko w kierunku od 3’ do 5’ - syntetyzuje nową nić od końca 5’ do 3’- jest to enzym który potrafi dobudowywać tylko do
istniejących już fragmentów , nie czyta od nowa
Elongacja trwa do momentu odczytania
REPLIKONU
(jednostka replikacji – od sekwencji ori do sekwencji term)
u prokariota elongacja trwa do momentu dotarcia widełek do przeciwległego końca kolistej cząsteczki genoforu.
Na nici wiodącej ( 3’ – 5’ ) -
replikacja
ciąg
Na nici opóźnionej –
replikacja
opóźniona
.
FRAGMENTY
OKAZAKI
: fragmenty DNA z własnym primerem długości widełek replikacyjnych.
TERMINACJA :• wycięcie primerów ( u prokariota robi to
POLIMERAZA
KORNBERGA
: naprawia fragmenty, wycina primery, w miejscu
wycięcia primerów dobudowuje nukleotydy typowe dla DNA )
LIGAZY
łączą fragmenty DNA powstałe w miejscu po primerach i fragmenty okazaki w 1 ciągłą nić.
odtwarzanie wiązań wodorowych pomiędzy nicią starą a nową
U EUKARIOTA : Dna u prokariota jest cząsteczką nagą, kolistą ; u eukariota bardziej niedostępna ze względu na połączenie z białkami przez
co tworzy kolejne struktury upakowania
Replikacja zaczyna się od uwolnienia cząsteczki DNA od białek towarzyszących
Pierwszy enzym to
TROPOIZOMERAZA
3 polimerazy :-
α
: czyta tylko DNA jądrowe,-
β
: naprawia błędy,-
γ
: replikuje DNA mitochondrialne
szybkość włączania nukleotydu: P: 50 tys/min - E : 500 – 3600/min czas trwania procesu dużo krótszy u E
- P : 1 replikon i 1 oczko replikacyjne - E : wiele replikonów i wiele oczek replikacyjnych
W komórkach embrionalnych wiele więcej replikonów niż w somatycznych →skrócony czas replikacji →szybsze powielanie się komórek
OBRÓBKA POSTREPLIKACYJNA : Do końca 3’ przyłącza się enzym
TELOMERAZA
, który ma właściwości katalityczne ( u Eukariota ! u P nie )
i posiada je tylko dlatego, że ma wbudowaną krótką sekwencję RNA .
W tym procesie na krótkim odcinku RNA tworzone się telomery w procesie
ODWROTNEJ
TRANSKRYPCJI
– czyli przepisania informacji z
RNA na komplementarne DNA , które powstaje w procesie odwrotnej transkrypcji.
Telomery nie są fragmentami kodującymi , ale pełnią bardzo ważną funkcję: chronią DNA przed działaniem
egzonukleaz
(przed skracaniem
* komórka nowotworowa – jedyna komórka , która nie skraca telomerów.
Mechanizm elongacji łańcucha RNA polimeraza RNA – wytwarza wiązanie fosfodiestrowe
Terminacja – nowo syntetyzowany RNA
Regulacja aktywności genów na etapie transkrypcji – na przykładzie operonu laktozowego
Operon – jednostka mechanizmu regulacji aktywności genów
Geny struktury – w nich jest zakodowana informacja o syntezie enzymów
Promotgor - miejsce przyłączenia polimerazy RNA Operator – aktywator genów struktury
Operator laktozowy - odpowiedzialny za syntezę enzymów :
- β – galaktozydaza – podstawowy enzym uczestniczący w rozkładzie laktozy
- permeaza- uczestniczy w regulacji transportu przez błony
- acetylotransferaza – uczestniczy w przeniesieniu grupy acetylowej w metabolizmie laktozy
Negatywna regulacja transkrypcji : negatywny regulator (represor) blokuje przyłączenie polimerazy RNA do miejsc promotorowych i
uniemożliwia transkrypcję
Pozytywna regulacja transkrypcji : pozytywny regulator (aktywator) usprawnia wiązanie polimerazy RNA (RNAP) w miejscach
promotorowych – w efekcie umożliwia transkrypcję
Translacja – proces syntezy białka na rybosomach, przekazywanie informacji genetycznej tzn proces syntezy białka o kolejności
aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym wg sekwencji kodonów w mRNA
Translacja - inicjacja : od połączenie małej jednostki rybosomu z mRNA oraz przyłączenia t-RNA do kodonu startowego (AUG)
- elongacja – przyłączenie kolejnego aminokwasu z wytworzeniem wiązania peptydowego, kolejne przyłączenie aminokwasów
- terminacja- zakończenie syntezy białka w chwili pojawienia się kodonów stop na matrycy mRNA – UAA, UAG, UGA
Transkrypcja- jest to proces przepisywania informacji genetycznej z DNA na mRNA. Zachodzi w jądrze komórki.
Etapy transkrypcji: 1. polimeraza- NRA odnajduje na nici DNA odpowiednie miejsce zwane promotorem w którym rozpoczyna się proces
- rozplecenie podwójnej helisy DNA i ustawianie naprzeciwko nukleotydów nici DNA komplementarnych nukleotydów tworzących nić RNA
3. powstaje pojedyncza nić RNA, która jest jednak niedojrzała i musi zostać poddana obróbce potranskrypcyjnej.
Miejsce styku helis to promotor. T zamienia się na U!!
Dojrzewanie mRNA Powstały mRNA jest produktem w stanie surowym który wymaga wykończenia bo geny mają budowę nieciągłą tz.
zawierają odcinki kodujące ekson oraz odcinki nie kodujące introny. Dojrzewanie mRNA polega więc na wycinaniu odcinków nie
kodujących a łączeniu się sobą odcinków kodujących. powstały mRNA może stanowić matrycę do syntezy białka i opuścić jądro.
Ekson 1/ INTRON/ EKSON 2/ INTRON/ EKSON 3/ - (nie dojrzałe pre- mRNA).
Ekson 1/ ekson 2/ ekson 3/ - dojrzały mRNA
Transkrypcja ma na celu: -ochronę oryginału informacji genetycznej zawartej w DNA,
-stworzenie możliwie dużej ilości kopii informacji genetycznej, które będą stanowiły matrycę do biosyntezy białka.
Kolejność ekspresji informacji genetycznej.1. replikacja ZACHODZI W JĄDRZE 2. transkrypcja 3. translapcja (biosynteza białka) –
cytoplazma,4.odwrotna translacja
Kod genetyczny- jest to system zapisu informacji genetycznej w którym każdemu aminokwasowi odpowiada określony kodon.
Kodon- (triplet)- to trzy kolejne nukleotydy wyznaczające aminokwas.
1 aminokwas- 3 nukleotydy, 1 triplet-3 nukleotydy, 1kodon = 30 aminokwasów. 90 nukleotydów = 30 aminokwasów
DNA T A C C G A A T T nić matrycowa
A T G G C U U A A
mRNA A U G G C U U A A
Biosynteza zawsze zaczyna się od aminokwasu Metioniny. 3 kodony kończące to: UUA, UGA, UAG.
Antykodon jest to trójka
tego aminokwasu
znajdującego się w
. Podczas tego procesu przyłącza się on do
komplementarnej trójki zasad w mRNA wraz z znajdującym się na przeciwnym końcu cząsteczki tRNA aminokwasem.
Kod genetyczny jest: – trójkowy – trzy sąsiadujące ze sobą nukleotydy (tzw. kodon) określają jeden aminokwas,
– bezprzecinkowy – sekwencja zasad jest odczytywana kolejno,
– niezachodzący – kodony leżą kolejno jeden za drugim i nie mają elementów wspólnych,
– jednoznaczny – jeden kodon koduje tylko jeden aminokwas,
– zdegenerowany – jeden aminokwas może być kodowany przez kilka rożnych kodonów,
– kolinearny kolejność ułożenia kodonów w łańcuchu polinukleotydowym kwasu odpowiada kolejności ułożenia aminokwasów w białku,
– uniwersalny – zasady kodowania oraz znaczenie kodonów są takie same u wszystkich organizmów.
Informacyjny RNA (mRNA) w sekwencji swoich nukleotydów ma zakodowaną informację o sekwencji aminokwasów w białku. Geny
eukariotyczne składają się z sekwencji kodujących białko (tzw. eksonów) oraz z sekwencji niekodujących białko (tzw. intronów). Z
utworzonej cząsteczki RNA wycinane są introny, a eksony łączone w cząsteczkę mRNA, która dopiero wtedy opuszcza jądro.
Rybosomalny RNA (rRNA) jest głównym składnikiem rybosomów, pełni funkcje katalityczne i strukturalne.
Transportujący RNA (tRNA) przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów. Ma unikalną strukturę przestrzenną określaną mianem
„liścia koniczyny”. Najistotniejsza w tRNA jest pętla antykodonowa, zawierająca tzw. antykodon, tj. trojkę nukleotydów, która umożliwia
rozpoznanie kodonóww mRNA. Do końca 3’ następuje przyłączenie właściwego aminokwasu.
Translacja polega na przetłumaczeniu informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów w mRNA na sekwencję aminokwasóww
syntetyzowanym białku. Proces translacji poprzedza aktywacja aminokwasu (aminoacylacja), która polega na przyłączeniu do tRNA
odpowiedniego aminokwasu. Biosynteza białek odbywa się na rybosomach.
Nukleotydy składają się z zasady organicznej (pochodnej puryny lub pirymidyny), pentozy (D-rybozy lub D-2-deoksyrybozy) oraz kwasu
ortofosforowego. W skład kwasów nukleinowych wchodzą zasady pirymidynowe: cytozyna, uracyl, tymina.
elektrostatyczne oddziaływania rolę kwasu spełniają reszty fosforowe kwasów nukleinowych lub grupy karboksylowe aminokwasów
kwasowych, a rolę zasady – grupy aminowe aminokwasów zasadowych lub grupy aminowe zasad purynowych i pirymidynowych; 2)
wiązania wodorowe między odpowiednimi atomami azotu i tlenu zasad azotowych i aminokwasów; 3) wiązania chelatowe, w
których jon dwuwartościowego metalu łączy się ze związkiem organicznym dwoma wiązaniami, tj. jonowym, w którym zastępuje np. jon
wodoru i drugim – koordynacyjnym – z inną grupą związku organicznego Niewielki dodatek np. NaHCO3, zwiększa rozpuszczalność
nukleoprotein, powoduje odszczepienie się kwasów nukleinowych od białka, a nawet degradację kwasów rybonukleinowych bardziej
wrażliwych na hydrolizę zasadową. 0,6% roztworem NaCl, w którym rozpuszczają się rybonukleoproteiny
deoksyrybonukleoproteiny ekstrahuje się 10% roztworem NaCl, następnie wytrącić za pomocą alkoholu etylowego.
OTRZYMYWANIE DNA Z WĄTROBY. Wątrobę pokroić i homogenizować z 40ml oziębionego do 4st C 0,6% NaCl w
cytrynianie sodu prz
ez 3 minuty, wirować 10 min, osad do zlewki i dodać 10% NaCl, do łaźni z lodem i ekstrahować 15 minut i
odwirować, dodać alkoholu 96% i zebrać DNA.
OTRZYMYWANIE RNA Z DROŻDŻY. Drożdże i 40 ml 0,4% NaOH, osad odwirować, supernatant przenieść i zakwasić 15 ml 5%
kwasu octowego, do wirówki z 40ml etanolu i (3000 obr./min przez 10 minut) i rozpuścić w małej ilości 0,4% NaOH
IDENTYFIKACJA SKŁADNIKÓW NUKLEOPROTEIN. Hydrolizy związków do kwasu fosforowego, pentozy oraz zasad
azotowych, a następnie ich rozdziału. Lub Niehydrolizowane kwasy nukleinowe (DNA i RNA) wykazują reakcję wspólną na obecność
pentoz, tzw. reakcję Biala i Tollensa. reakcją odróżniającą oba typy kwasów w formie niehydrolizowanej jest reakcja Dischego na obecność -
D-2-deoksyrybozy
WYKRYWANIE BIAŁKA - BIURETOWA 1 ml próbki badanej + 2 ml 10% NaOH + 2-3 krople 1% roztworu CuSO4
WYKRYWANIE PENTOZ: PRÓBA TOLLENSA 1ml stężonego HCl i po 1 ml floroglucyny i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej,
czerwona PRÓBA BIALA 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% roztworze HCl i dodać kroplę 1% roztworu FeCl3. Ogrzewać we wrzącej
łaźni wodnej 5-10 minut. Zielona
ODRÓŻNIENIE DNA OD RNA – REAKCJA DISCHEGO polega na tworzeniu w środowisku kwaśnym przez 2-
d
eoksyrybozę zdifenyloaminą produktu kondensacji o barwie niebieskiej
.
3 ml 0,4% NaOH i dokładnie rozgnieść bagietką
(przesączyć. Do 1 ml przesączu 2 ml odczynnika dwufenyloaminy. ogrzewać 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. DNA barwa niebieska.
WYKRYWANIE ZASAD PURYNOWYCH PRÓBA Z AgNO3 5 ml 5% H2SO4 i ogrzewać 30 minut na wrzącej łaźni. Zobojętnić
stężonym amoniakiem wobec czerwieni metylowej i odsączyć. dodać kilka kropli 10% AgNO3. biały osad
PRÓBA MUREKSYDOWA próbki do parowniczek, kilka kropel HNO3 i odparować do sucha. zwilżyć kilkoma kroplami amoniaku
w obecności zasad purynowych pojawia się czerwone zabarwienie purpuranu amonu (mureksydu).
WYKRYWANIE KWASU ORTOFOSFOROWEGO0,3 ml 0,5 M HCl i po przykryciu korkami plastikowymi ogrzewać we wrzącej
łaźni 15 minut. Po oziębieniu dodać 1 ml odczynnika molibdenowego i 1 ml reduktora. na chwilę do wrzącej łaźni wodnej. niebieski
kompleks fosforowo-molibdenowego.
Kodon- fragment DNA określający jeden aminokwas, odczyt od N-końca
Pirymidowe:
Cytozyna- 2-hydroksy-4-aminopirymidyna
Uracyl- 2,4-dihydroksypirymidyna
Tymina- 2,4-dihydroksy-5-metylopirymidyna
Purynowe:
Adenina- 6-aminopuryna
Guanina- 2-amino-6-hydroksypuryna
Hipoksantyna- 6-hydroksypuryna
Forma laktamowa: ketonowa forma przy C-2
Nietypowe: 6-Nmetylo-, 6-N-dimetyloadeniny, pseudourydyny
Pentozy w kw: B-D-ryboza i B-D-2-deoksyryboza, łączą się przez C-1 z NH i estrowym z OH przy C-3 i 5
Zasada org+ aldopentozą wiązaniem N-glikozydowym daje nukleozyd, a estrowo w C-5 fosforanu – nukleotyd
W hydrolizatach (śr. Naturalne) są też nukleozydo-3-monofosforany
Nukleotrifosforany: ATP, GTP, UTP, koenzymy: NAD+,NADP+,FAD
Budowa DNA: łańcuch dwuniciowy skręcony w heliks w którym obie nici są spojone jednoznacznie (deoksy)rybozy i fosforanu, zasady na
zewnątrz, nukleotydy powiązane diestrowo przez fosforan z OH i z C-5` pentozy własnego nukleotydu, a drugą grupą OH łączy się z C-
3`następnego nukleotydu.
Cechy: -2 odwrotnie skierowane łańcuchy oplatają hipotetyczną oś
-Płaszczyzny zasad są prostopadłe do osi heliksu
-wielkości cząsteczek pary zasad pasują do odległości miedzy łańcuchami sacharydonowo-fosforanowymi
-średnica heliksu 2 nm, odległość między zasadami 0,34 nm
-kolejność zasad w łańcuchu nie jest ograniczona
Mutacje: efekt metaboliczny, morfologiczny, letarny
Genomy prokariotów: np. E.coli. chromosom bakteryjny, DNA nie oddzielony od cytosolu, chromosom kulisty, ok 59 domen(pętli)
Eukariotów: w jądrze, 10^8 par zasad i 40k odrębnych genów, sekwencje pojedyncze i powtarzalne
Geny: podzielone: introny(wewnętrzne) i eksony(do syntezy białek) DNA jako chromosomy-ściśle upakowane z białkami histonowymi
Selenoidem-heliks wyższego rzędu, z 6 nukleosomów
RNA-mniejsze masy od DNA, w cytoplazmie i w jądrze. Zamiast tyminy uracyl, często pojedyncze łańcuchy
RNA komórkowy: transportujący 25kDa, informacyjny mRNA- w jądrze i w cytoplazmie rRNA-w rybosomach, matryca do łańcuchów
polipeptydowych, snRNA do dojrzewania mRNA
Replikacja-rozplecienie podwójnego heliksu na dwie nici i odbudowę od każdej z nich nowej. Polimeraza do syntezy DNA
Replikacja DNA u prokariotów:
Różnice: u prokariotów kolistych chromosomów, replikacja zaczyna się w oczku replikacyjnym
Replikacja Dna u eukariotów: 10 razy wolniej,
Budowa DNA: DNA- kwas dezoksyrybonukleinowy – występuje w komórce w postaci podwójnej nici spiralnie za sobą skręconych w postaci tzn. helisy,,
każda nic zbudowana jest z pojedynczych „cegiełek” zwanych nukleotydami.
W skład nukleotydu DNA wchodzą: cukier C 5- deoksyryboza ,reszta kwasu fosforowego, jedna z zasad azotowych:
-adenina (A),tymina (T), cytozyna (C), - guanina (G) Reguła komplementarności: A=T
DNA- zawiera informację genetyczną komórki (organizmu).
RNA- kwas rybonukleinowy. Występuje w komórce w postaci jednej nici i jest wierną kopią DNA, a zatem umożliwia realizowanie informacji
genetycznej. Jego podstawową jednostką budulcową jest nukleotyd zbudowany z:
a) cukier C 5- ryboza, reszta kwasu fosforowego, jedna z zasad azotowych:
-adenina (A), -urazyl (U), -cytozyna (C), -guanina (G).
3 rodzaje RNA: -mRNA – matrycowa RNA- powstaje na matrycy DNA i jest roboczą kopią genu.
-tRNA – transportowy RNA- transportuje aminokwasy do miejsca biosyntezy białek,
-rRNA- rybosomalny RNA- wchodzi w skład rybosomów i uczestniczy w biosyntezie białka.
DNA w komórce występuje: - w jądrze, mitochondriach, plastydach (u roślin),
RNA w komórce występuje: -w jądrze, cytoplazmie, rybosomach.
Replikacja DNA- podwojenie ilości DNA w komórce bezpośrednia przed podziałem.
Przebieg replikacji: polimeraza DNA znajduje na nici DNA miejsce inicjacji replikacji. Takich miejsc w obrębie jednej cząsteczki DNA jest wiele, z tąd
replikacja przebiega na w wielu miejscach jednocześnie.
w miejscu inicjacji replikacji następnie rozplecenie podwójnej helisy. W tym miejscu powstają tzw. widełki replikacyjne.
w widełkach replikacyjnych polimeraza DNA ustawia naprzeciwko każdemu nukleotyd.
Nowe nukleotydy łączą się replikacja DNA pół zachowawcze - nowa cząsteczka DNA zawiera nić starą i jedną nić nową.
Celem replikacji- jest dokładne skupione cząsteczki DNA i następnie przekazane komórkom potomnym identycznej informacji genetycznej. Miejsce
łączenia się helis to miejsce inicjacji
Replikacja –ciągła synteza Synteza fragmentami Polimeraza DNA III
- katalizuje krok po kroku przyłączenie deoksyrybonukleotydów do nowego łańcucha DNA
- katalizuje wytwarzanie wiązania fosfodiestrowegomiędzy grupą –OH na końcu 3’, a fragmentami na końcu 5’ deoksyrybonukleotydu
Składniki niezbędne do syntezy DNA - odcinek starterowy – jego syntezę katalizuje enzym PRUMAZA
- matryca DNA - jony Mg, -5’ – trifosforanydeoksyrybonukleotydów (dATP, dGTP, dTTP, dCTP)
Enzymy i białka uczestniczące w replikacji DNA:
- Helikaza uczestniczy w rozpleceniu nici DNA - wiązanie białek stabilizujących rozwinięcie nici
- prymaza – syntezuje krótki starterowy odcinek RNA - polimeraza DNA III syntezuje łańcuch DNA
- polimeraza DNA I – usuwa starter - ligaza – łączy odcinki DNA (tzw. Fragmenty okazaki)
Transkrypcja – przepisywanie informacji z DNA na mRNA
Nowy RNA jest syntetyzowany zgodnie z regułą komplementarności w stosunku do nici stanowiącej szablon
- katalizowana przez enzym polimeraza zgodnie z matrycą DNA - substancjami są trifosforanyrybonukleozydów
- synteza mRNA odbywa się w kierunku 5’→3’ - obejmuje trzy etapy: inicjację, elongację, terminację
-transkrypcja rozpoczyna się od końca 5’ a jej początek ma miejsce w rejonie zwanym promotorem
- są to rejony w matrycy DNA, które wiążą polimerazę RNA i determinują miejsce startu transkrypcji
- eukariota : w rejonie -25-kasetaTATA, w rejonie -75- kaseta CAAT
- proces transkrypcji inicjuje połączenie polimerazy RNA z promotorem
REPLIKACJA DNA: proces podwojenia ilości DNA. Zachodzi w fazie S (podwojenie ilości histonów ) .
REPLIKACJA SEMIKONSERWATYWNA : (półzachowawcza) - w każdej z dwóch uzyskanych podwójnych nici DNA będzie jedna nić macierzysta i jedna
nowa.
-semikonserwatywna
[rozplątanie heliksa, a potomne cząstki DNA są w połowie nowe, a w połowie ze starej nici]
-konserwatywna
[macierzysta cząsteczka DNA nie ulega rozplątaniu, powstaje jedna nowa cząsteczka DNA,
-przypadkowa
[macierzysta cząsteczka DNA ulega fragmentacji, nowa nić zawiera elementy starej i nowej nici]
PRZEBIEG PROCESU :INICJACJA, ELONGACJA, TERMINACJA
U PROKARIOTA : INICJACJA : naga nić w postaci α- helisy , aby można było utworzyć nową nić :
rozplecenie nici DNA : pomiędzy nici wnika
białko inicjatorowe DNA A
, które zgina nić, naprężenie wiązań wodorowych i rozerwanie
wnika kolejne białko enzymatyczne
HELIKAZA
: aby zapobiec powstawaniu ponownie α-helis. powstają
WIDEŁKI REPLIKACYJNE
: 1 oczko (=widełki)
replikacyjne. tuż obok miejsca
ORI
(miejsce początku replikacji)
wchodzi kolejny enzym
PRYMAZA
: wytwarza
PRIMERY
( odcinki RNA komplementarne do DNA )
ELONGACJA : Wydłużanie nowopowstałego łańcucha DNA Warunki: - duża ilość wolnych nukleotydów
- dostarczona energia, obecność związków wysoko energetycznych . Donor energii : trifosforany nukleozydu (TTP , CTP, GTP, ATP)
- enzym katalizujący proces * musi mieć miejsce aktywne przestrzennie pasujące do nukleotydów.
- zachowana komplementarność dobudowywanych nukleotydów
*
enzym
: - czyta tylko w kierunku od 3’ do 5’ - syntetyzuje nową nić od końca 5’ do 3’- jest to enzym który potrafi dobudowywać tylko do istniejących
już fragmentów , nie czyta od nowa
Elongacja trwa do momentu odczytania
REPLIKONU
(jednostka replikacji – od sekwencji ori do sekwencji term)
u prokariota elongacja trwa do momentu dotarcia widełek do przeciwległego końca kolistej cząsteczki genoforu.
Na nici wiodącej ( 3’ – 5’ ) -
replikacja
ciąg
Na nici opóźnionej –
replikacja
opóźniona
.
FRAGMENTY
OKAZAKI
: fragmenty DNA z własnym primerem długości widełek replikacyjnych.
TERMINACJA :• wycięcie primerów ( u prokariota robi to
POLIMERAZA
KORNBERGA
: naprawia fragmenty, wycina primery, w miejscu wycięcia
primerów dobudowuje nukleotydy typowe dla DNA )
LIGAZY
łączą fragmenty DNA powstałe w miejscu po primerach i fragmenty okazaki w 1 ciągłą nić.
odtwarzanie wiązań wodorowych pomiędzy nicią starą a nową
U EUKARIOTA : Dna u prokariota jest cząsteczką nagą, kolistą ; u eukariota bardziej niedostępna ze względu na połączenie z białkami przez co tworzy
kolejne struktury upakowania
Replikacja zaczyna się od uwolnienia cząsteczki DNA od białek towarzyszących
Pierwszy enzym to
TROPOIZOMERAZA
3 polimerazy :-
α
: czyta tylko DNA jądrowe,-
β
: naprawia błędy,-
γ
: replikuje DNA mitochondrialne
szybkość włączania nukleotydu: P: 50 tys/min - E : 500 – 3600/min czas trwania procesu dużo krótszy u E
- P : 1 replikon i 1 oczko replikacyjne - E : wiele replikonów i wiele oczek replikacyjnych
W komórkach embrionalnych wiele więcej replikonów niż w somatycznych →skrócony czas replikacji →szybsze powielanie się komórek
OBRÓBKA POSTREPLIKACYJNA : Do końca 3’ przyłącza się enzym
TELOMERAZA
, który ma właściwości katalityczne ( u Eukariota ! u P nie ) i posiada je
tylko dlatego, że ma wbudowaną krótką sekwencję RNA .
W tym procesie na krótkim odcinku RNA tworzone się telomery w procesie
ODWROTNEJ
TRANSKRYPCJI
– czyli przepisania informacji z RNA na
komplementarne DNA , które powstaje w procesie odwrotnej transkrypcji.
Telomery nie są fragmentami kodującymi , ale pełnią bardzo ważną funkcję: chronią DNA przed działaniem
egzonukleaz
(przed skracaniem
* komórka nowotworowa – jedyna komórka , która nie skraca telomerów.
Mechanizm elongacji łańcucha RNA polimeraza RNA – wytwarza wiązanie fosfodiestrowe
Terminacja – nowo syntetyzowany RNA
Regulacja aktywności genów na etapie transkrypcji – na przykładzie operonu laktozowego
Operon – jednostka mechanizmu regulacji aktywności genów
Geny struktury – w nich jest zakodowana informacja o syntezie enzymów
Promotgor - miejsce przyłączenia polimerazy RNA Operator – aktywator genów struktury
Operator laktozowy - odpowiedzialny za syntezę enzymów :
- β – galaktozydaza – podstawowy enzym uczestniczący w rozkładzie laktozy
- permeaza- uczestniczy w regulacji transportu przez błony
- acetylotransferaza – uczestniczy w przeniesieniu grupy acetylowej w metabolizmie laktozy
Negatywna regulacja transkrypcji : negatywny regulator (represor) blokuje przyłączenie polimerazy RNA do miejsc promotorowych i uniemożliwia
transkrypcję
Pozytywna regulacja transkrypcji : pozytywny regulator (aktywator) usprawnia wiązanie polimerazy RNA (RNAP) w miejscach promotorowych – w
efekcie umożliwia transkrypcję
Translacja – proces syntezy białka na rybosomach, przekazywanie informacji genetycznej tzn proces syntezy białka o kolejności aminokwasów w
łańcuchu polipeptydowym wg sekwencji kodonów w mRNA
Translacja - inicjacja : od połączenie małej jednostki rybosomu z mRNA oraz przyłączenia t-RNA do kodonu startowego (AUG)
- elongacja – przyłączenie kolejnego aminokwasu z wytworzeniem wiązania peptydowego, kolejne przyłączenie aminokwasów
- terminacja- zakończenie syntezy białka w chwili pojawienia się kodonów stop na matrycy mRNA – UAA, UAG, UGA
Transkrypcja- jest to proces przepisywania informacji genetycznej z DNA na mRNA. Zachodzi w jądrze komórki.
Etapy transkrypcji: 1. polimeraza- NRA odnajduje na nici DNA odpowiednie miejsce zwane promotorem w którym rozpoczyna się proces
- rozplecenie podwójnej helisy DNA i ustawianie naprzeciwko nukleotydów nici DNA komplementarnych nukleotydów tworzących nić RNA
3. powstaje pojedyncza nić RNA, która jest jednak niedojrzała i musi zostać poddana obróbce potranskrypcyjnej.
Miejsce styku helis to promotor. T zamienia się na U!!
Dojrzewanie mRNA Powstały mRNA jest produktem w stanie surowym który wymaga wykończenia bo geny mają budowę nieciągłą tz. zawierają
odcinki kodujące ekson oraz odcinki nie kodujące introny. Dojrzewanie mRNA polega więc na wycinaniu odcinków nie kodujących a łączeniu się sobą
odcinków kodujących. powstały mRNA może stanowić matrycę do syntezy białka i opuścić jądro.
Ekson 1/ INTRON/ EKSON 2/ INTRON/ EKSON 3/ - (nie dojrzałe pre- mRNA).
Ekson 1/ ekson 2/ ekson 3/ - dojrzały mRNA
Transkrypcja ma na celu: -ochronę oryginału informacji genetycznej zawartej w DNA,
-stworzenie możliwie dużej ilości kopii informacji genetycznej, które będą stanowiły matrycę do biosyntezy białka.
Kolejność ekspresji informacji genetycznej.1. replikacja ZACHODZI W JĄDRZE 2. transkrypcja 3. translapcja (biosynteza białka) –
cytoplazma,4.odwrotna translacja
Kod genetyczny- jest to system zapisu informacji genetycznej w którym każdemu aminokwasowi odpowiada określony kodon.
Kodon- (triplet)- to trzy kolejne nukleotydy wyznaczające aminokwas.
1 aminokwas- 3 nukleotydy, 1 triplet-3 nukleotydy, 1kodon = 30 aminokwasów. 90 nukleotydów = 30 aminokwasów
DNA T A C C G A A T T nić matrycowa
A T G G C U U A A
mRNA A U G G C U U A A
Biosynteza zawsze zaczyna się od aminokwasu Metioniny. 3 kodony kończące to: UUA, UGA, UAG.
Antykodon jest to trójka
tego aminokwasu znajdującego się w
. Podczas tego procesu przyłącza się on do komplementarnej trójki zasad w mRNA
wraz z znajdującym się na przeciwnym końcu cząsteczki tRNA aminokwasem.
Kod genetyczny jest: – trójkowy – trzy sąsiadujące ze sobą nukleotydy (tzw. kodon) określają jeden aminokwas,
– bezprzecinkowy – sekwencja zasad jest odczytywana kolejno,
– niezachodzący – kodony leżą kolejno jeden za drugim i nie mają elementów wspólnych,
– jednoznaczny – jeden kodon koduje tylko jeden aminokwas,
– zdegenerowany – jeden aminokwas może być kodowany przez kilka rożnych kodonów,
– kolinearny kolejność ułożenia kodonów w łańcuchu polinukleotydowym kwasu odpowiada kolejności ułożenia aminokwasów w białku,
– uniwersalny – zasady kodowania oraz znaczenie kodonów są takie same u wszystkich organizmów.
Informacyjny RNA (mRNA) w sekwencji swoich nukleotydów ma zakodowaną informację o sekwencji aminokwasów w białku. Geny eukariotyczne
składają się z sekwencji kodujących białko (tzw. eksonów) oraz z sekwencji niekodujących białko (tzw. intronów). Z utworzonej cząsteczki RNA wycinane
są introny, a eksony łączone w cząsteczkę mRNA, która dopiero wtedy opuszcza jądro.
Rybosomalny RNA (rRNA) jest głównym składnikiem rybosomów, pełni funkcje katalityczne i strukturalne.
Transportujący RNA (tRNA) przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów. Ma unikalną strukturę przestrzenną określaną mianem „liścia
koniczyny”. Najistotniejsza w tRNA jest pętla antykodonowa, zawierająca tzw. antykodon, tj. trojkę nukleotydów, która umożliwia rozpoznanie
kodonóww mRNA. Do końca 3’ następuje przyłączenie właściwego aminokwasu.
Translacja polega na przetłumaczeniu informacji genetycznej zawartej w sekwencji nukleotydów w mRNA na sekwencję aminokwasóww
syntetyzowanym białku. Proces translacji poprzedza aktywacja aminokwasu (aminoacylacja), która polega na przyłączeniu do tRNA odpowiedniego
aminokwasu. Biosynteza białek odbywa się na rybosomach.
Nukleotydy składają się z zasady organicznej (pochodnej puryny lub pirymidyny), pentozy (D-rybozy lub D-2-deoksyrybozy) oraz kwasu
ortofosforowego. W skład kwasów nukleinowych wchodzą zasady pirymidynowe: cytozyna, uracyl, tymina.
elektrostatyczne oddziaływania rolę kwasu spełniają reszty fosforowe kwasów nukleinowych lub grupy karboksylowe aminokwasów
kwasowych, a rolę zasady – grupy aminowe aminokwasów zasadowych lub grupy aminowe zasad purynowych i pirymidynowych; 2) wiązania
wodorowe
między odpowiednimi atomami azotu i tlenu zasad azotowych i aminokwasów; 3) wiązania chelatowe, w których jon
dwuwartościowego metalu łączy się ze związkiem organicznym dwoma wiązaniami, tj. jonowym, w którym zastępuje np. jon wodoru i drugim –
koordynacyjnym – z inną grupą związku organicznego Niewielki dodatek np. NaHCO3, zwiększa rozpuszczalność nukleoprotein, powoduje
odszczepienie się kwasów nukleinowych od białka, a nawet degradację kwasów rybonukleinowych bardziej wrażliwych na hydrolizę zasadową. 0,6%
roztworem NaCl, w którym rozpuszczają się rybonukleoproteiny
deoksyrybonukleoproteiny ekstrahuje się 10% roztworem NaCl, następnie wytrącić za pomocą alkoholu etylowego.
OTRZYMYWANIE DNA Z WĄTROBY. Wątrobę pokroić i homogenizować z 40ml oziębionego do 4st C 0,6% NaCl w cytrynianie
sodu prz
ez 3 minuty, wirować 10 min, osad do zlewki i dodać 10% NaCl, do łaźni z lodem i ekstrahować 15 minut i odwirować, dodać
alkoholu 96% i zebrać DNA.
OTRZYMYWANIE RNA Z DROŻDŻY. Drożdże i 40 ml 0,4% NaOH, osad odwirować, supernatant przenieść i zakwasić 15 ml 5% kwasu
octowego, do wirówki z 40ml etanolu i (3000 obr./min przez 10 minut) i rozpuścić w małej ilości 0,4% NaOH
IDENTYFIKACJA SKŁADNIKÓW NUKLEOPROTEIN. Hydrolizy związków do kwasu fosforowego, pentozy oraz zasad azotowych, a
następnie ich rozdziału. Lub Niehydrolizowane kwasy nukleinowe (DNA i RNA) wykazują reakcję wspólną na obecność pentoz, tzw. reakcję Biala i
Tollensa. reakcją odróżniającą oba typy kwasów w formie niehydrolizowanej jest reakcja Dischego na obecność -D-2-deoksyrybozy
WYKRYWANIE BIAŁKA - BIURETOWA 1 ml próbki badanej + 2 ml 10% NaOH + 2-3 krople 1% roztworu CuSO4
WYKRYWANIE PENTOZ: PRÓBA TOLLENSA 1ml stężonego HCl i po 1 ml floroglucyny i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej, czerwona
PRÓBA BIALA 2 ml 0,2% roztworu orcyny w 20% roztworze HCl i dodać kroplę 1% roztworu FeCl3. Ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej 5-10
minut. Zielona
ODRÓŻNIENIE DNA OD RNA – REAKCJA DISCHEGO polega na tworzeniu w środowisku kwaśnym przez 2-deoksyrybozę
z
difenyloaminą produktu kondensacji o barwie niebieskiej
.
3 ml 0,4% NaOH i dokładnie rozgnieść bagietką
(przesączyć. Do 1 ml przesączu 2 ml odczynnika dwufenyloaminy. ogrzewać 10 minut we wrzącej łaźni wodnej. DNA barwa niebieska.
WYKRYWANIE ZASAD PURYNOWYCH PRÓBA Z AgNO3 5 ml 5% H2SO4 i ogrzewać 30 minut na wrzącej łaźni. Zobojętnić stężonym
amoniakiem wobec czerwieni metylowej i odsączyć. dodać kilka kropli 10% AgNO3. biały osad
PRÓBA MUREKSYDOWA próbki do parowniczek, kilka kropel HNO3 i odparować do sucha. zwilżyć kilkoma kroplami amoniaku w
obecności zasad purynowych pojawia się czerwone zabarwienie purpuranu amonu (mureksydu).
WYKRYWANIE KWASU ORTOFOSFOROWEGO0,3 ml 0,5 M HCl i po przykryciu korkami plastikowymi ogrzewać we wrzącej łaźni 15
minut. Po oziębieniu dodać 1 ml odczynnika molibdenowego i 1 ml reduktora. na chwilę do wrzącej łaźni wodnej. niebieski kompleks fosforowo-
molibdenowego.
Kodon- fragment DNA określający jeden aminokwas, odczyt od N-końca
Pirymidowe:
Cytozyna- 2-hydroksy-4-aminopirymidyna
Uracyl- 2,4-dihydroksypirymidyna
Tymina- 2,4-dihydroksy-5-metylopirymidyna
Purynowe:
Adenina- 6-aminopuryna
Guanina- 2-amino-6-hydroksypuryna
Hipoksantyna- 6-hydroksypuryna
Forma laktamowa: ketonowa forma przy C-2
Nietypowe: 6-Nmetylo-, 6-N-dimetyloadeniny, pseudourydyny
Pentozy w kw: B-D-ryboza i B-D-2-deoksyryboza, łączą się przez C-1 z NH i estrowym z OH przy C-3 i 5
Zasada org+ aldopentozą wiązaniem N-glikozydowym daje nukleozyd, a estrowo w C-5 fosforanu – nukleotyd
W hydrolizatach (śr. Naturalne) są też nukleozydo-3-monofosforany
Nukleotrifosforany: ATP, GTP, UTP, koenzymy: NAD+,NADP+,FAD
Budowa DNA: łańcuch dwuniciowy skręcony w heliks w którym obie nici są spojone jednoznacznie (deoksy)rybozy i fosforanu, zasady na zewnątrz,
nukleotydy powiązane diestrowo przez fosforan z OH i z C-5` pentozy własnego nukleotydu, a drugą grupą OH łączy się z C-3`następnego nukleotydu.
Cechy: -2 odwrotnie skierowane łańcuchy oplatają hipotetyczną oś
-Płaszczyzny zasad są prostopadłe do osi heliksu
-wielkości cząsteczek pary zasad pasują do odległości miedzy łańcuchami sacharydonowo-fosforanowymi
-średnica heliksu 2 nm, odległość między zasadami 0,34 nm
-kolejność zasad w łańcuchu nie jest ograniczona
Mutacje: efekt metaboliczny, morfologiczny, letarny
Genomy prokariotów: np. E.coli. chromosom bakteryjny, DNA nie oddzielony od cytosolu, chromosom kulisty, ok 59 domen(pętli)
Eukariotów: w jądrze, 10^8 par zasad i 40k odrębnych genów, sekwencje pojedyncze i powtarzalne
Geny: podzielone: introny(wewnętrzne) i eksony(do syntezy białek) DNA jako chromosomy-ściśle upakowane z białkami histonowymi
Selenoidem-heliks wyższego rzędu, z 6 nukleosomów
RNA-mniejsze masy od DNA, w cytoplazmie i w jądrze. Zamiast tyminy uracyl, często pojedyncze łańcuchy
RNA komórkowy: transportujący 25kDa, informacyjny mRNA- w jądrze i w cytoplazmie rRNA-w rybosomach, matryca do łańcuchów
polipeptydowych, snRNA do dojrzewania mRNA
Replikacja-rozplecienie podwójnego heliksu na dwie nici i odbudowę od każdej z nich nowej. Polimeraza do syntezy DNA
Replikacja DNA u prokariotów:
Różnice: u prokariotów kolistych chromosomów, replikacja zaczyna się w oczku replikacyjnym
Replikacja Dna u eukariotów: 10 razy wolniej,