Elementy inżynierii

Elementy inżynierii

genetycznej

genetycznej

Sposoby przekazywania

Sposoby przekazywania

informacji genetycznej

informacji genetycznej



Koniugacja

Koniugacja



Transdukcja

Transdukcja



Transformacja

Transformacja

Koniugacja

Koniugacja



Bezpośrednie przekazanie DNA z jednej

Bezpośrednie przekazanie DNA z jednej

komórki do drugiej, kiedy wchodzą one ze

komórki do drugiej, kiedy wchodzą one ze

sobą w kontakt

sobą w kontakt

(bakterie)

(bakterie)



Plazmid:

Plazmid:

-

małe, pozachromosomalne elementy

małe, pozachromosomalne elementy

genetyczne

genetyczne

-

dwuniciowe, koliste DNA 100x mniejsze

dwuniciowe, koliste DNA 100x mniejsze

od chromosomu bakteryjnego

od chromosomu bakteryjnego

-

występuje w setkach kopii

występuje w setkach kopii

-

warunkują przykładowe fenotypy:

warunkują przykładowe fenotypy:

oporności na antybiotyki, produkcji

oporności na antybiotyki, produkcji

restryktaz, produkcji enterotoksyn

restryktaz, produkcji enterotoksyn

Koniugacja

Koniugacja



Replikacja i przekazanie komórkom potomnym

Replikacja i przekazanie komórkom potomnym



Rekombinacja homologiczna

Rekombinacja homologiczna

→ integracja z genomem

→ integracja z genomem

Rekombinacja

Rekombinacja

homologiczna

homologiczna

Crossing-over

Crossing-over

czyli wymiana

czyli wymiana

odcinków

odcinków

chromatyd

chromatyd

chromosomó

chromosomó

w

w

homologiczny

homologiczny

ch

ch

Transformacja

Transformacja



Pobieranie DNA przez komórkę

Pobieranie DNA przez komórkę

bakterii z otoczenia

bakterii z otoczenia



Podstawowym wymogiem jest

Podstawowym wymogiem jest

kompetencja (cecha dziedziczna) czyli

kompetencja (cecha dziedziczna) czyli

zdolność włączania małych cząst. DNA

zdolność włączania małych cząst. DNA



Zaobserwowana w 1928 roku przez

Zaobserwowana w 1928 roku przez

Griffitha, wyśniona przez Avery’ego w

Griffitha, wyśniona przez Avery’ego w

1944 roku

1944 roku

Transdukcja

Transdukcja



Przenoszenie materiału

Przenoszenie materiału

genetycznego ze szczepu

genetycznego ze szczepu

bakteryjnego dawcy do biorcy z

bakteryjnego dawcy do biorcy z

udziałem bakteriofagów

udziałem bakteriofagów



Wykryta przez Zindera i Ledeberga

Wykryta przez Zindera i Ledeberga

w 1952 roku u

w 1952 roku u

Salmonella

Salmonella

typhimurium

typhimurium

dla faga P22

dla faga P22

W trybie lizogenicznym faga, jego genom integruje się z genomem

bakterii (profag, rekombinacja zlokalizowana), a ta rozmnaża się

normalnie przekazując komórkom potomnym.

Cykl komórkowy

Cykl komórkowy

cyklicznie zachodzące procesy podziału i

cyklicznie zachodzące procesy podziału i

wzrostu komórki

wzrostu komórki

Kontrola cyklu

Kontrola cyklu

komórkowego

komórkowego



Układ kontrolny, zapewniający poprawny

Układ kontrolny, zapewniający poprawny

przebieg cyklu komórkowego oraz

przebieg cyklu komórkowego oraz

regulowanie jego mechanizmu

regulowanie jego mechanizmu

- We właściwym czasie włącza enzymy i inne

- We właściwym czasie włącza enzymy i inne

białka uczestniczące w kolejnych etapach

białka uczestniczące w kolejnych etapach

cyklu, a po ich zakończeniu je dezaktywuje

cyklu, a po ich zakończeniu je dezaktywuje

- Ma zdolność zatrzymania cyklu

- Ma zdolność zatrzymania cyklu

komórkowego (hamowanie molekularne) w

komórkowego (hamowanie molekularne) w

różnych punktach kontrolnych (ang.

różnych punktach kontrolnych (ang.

checkpoints)

checkpoints)

np. W fazie G1 sprawdzenie wielkości komórki

np. W fazie G1 sprawdzenie wielkości komórki

pozwala zatrzymać układ by komórka dorosła, gdy jest to konieczne

pozwala zatrzymać układ by komórka dorosła, gdy jest to konieczne

zanim zreplikuje DNA lub w G2 informujący o zakończeniu syntezy

zanim zreplikuje DNA lub w G2 informujący o zakończeniu syntezy

DNA

DNA

Kontrola cyklu

Kontrola cyklu

komórkowego

komórkowego



Układ kontroli cyklu komórkowego sprawują

Układ kontroli cyklu komórkowego sprawują

kinazy białkowe zależne od cyklin Cdk (

kinazy białkowe zależne od cyklin Cdk (

c

c

yclin-

yclin-

d

d

ependent protein

ependent protein

k

k

inases)

inases)

-

Cdk są regulowane nagromadzeniem i rozpadem

Cdk są regulowane nagromadzeniem i rozpadem

cyklin,

cyklin,

np.synteza cykliny zaczyna się po mitozie i trwa w interfazie;

np.synteza cykliny zaczyna się po mitozie i trwa w interfazie;

jego późniejszy spadek aktywuje wyjście z mitozy

jego późniejszy spadek aktywuje wyjście z mitozy

-

Różne kompleksy cyklina–Cdk włączają różne

Różne kompleksy cyklina–Cdk włączają różne

etapy cyklu komórkowego

etapy cyklu komórkowego

-

Aktywność Cdk regulują procesy fosforylacji i

Aktywność Cdk regulują procesy fosforylacji i

defosforylacji

defosforylacji

-

Białkowe inhibitory Cdk mogą zatrzymać cykl

Białkowe inhibitory Cdk mogą zatrzymać cykl

komórkowy w fazie G1

komórkowy w fazie G1

→

→

strażnik genomu – białko p53

strażnik genomu – białko p53

Kontrola liczby komórek w

Kontrola liczby komórek w

organizmie wielokomórkowym

organizmie wielokomórkowym

Proliferacja

Apoptoza

Proliferacja

Proliferacja



Substancje odżywcze

Substancje odżywcze



Czynniki wzrostu – są wiązane przez receptory

Czynniki wzrostu – są wiązane przez receptory

znajdujące się na powierzchni komórek

znajdujące się na powierzchni komórek

docelowych po czym aktywują

docelowych po czym aktywują

wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe indukujące

wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe indukujące

wzrost i podziały komórki

wzrost i podziały komórki

-

PDGF (platelet-derived growth factor)

PDGF (platelet-derived growth factor)

→ stymuluje

→ stymuluje

podziały tkanki łącznej

podziały tkanki łącznej

-

EGF (epidermal growth factor) → stymuluje

EGF (epidermal growth factor) → stymuluje

proliferację komórek skóry

proliferację komórek skóry

-

HGF (hepatocyte growth factor) → stymuluje

HGF (hepatocyte growth factor) → stymuluje

proliferację komórek wątroby

proliferację komórek wątroby



Komórki zwierzące mają

Komórki zwierzące mają

ograniczoną zdolność do

ograniczoną zdolność do

podziałów –

podziałów –

starzenie się

starzenie się

komórki

komórki



Czynniki proliferacyjne są

Czynniki proliferacyjne są

więc swego rodzaju

więc swego rodzaju

czynnikami przeżycia

czynnikami przeżycia

.

.

Pozbawione ich włączają

Pozbawione ich włączają

śródkomórkowy program

śródkomórkowy program

samobójczy -

samobójczy -

apoptozę

apoptozę

Apoptoza

Apoptoza



Programowana śmierć komórki

Programowana śmierć komórki



Odpowiedź komórki na działanie

Odpowiedź komórki na działanie

czynników stresogennych:

czynników stresogennych:

chemioterapeutyki, promieniowanie

chemioterapeutyki, promieniowanie

γ

γ

i

i

UV, niedotlenienie, szok termiczny, brak

UV, niedotlenienie, szok termiczny, brak

czynników wzrostowych, zaburzenia cyklu

czynników wzrostowych, zaburzenia cyklu

komórkowego, cytostatyki, jony wapnia,

komórkowego, cytostatyki, jony wapnia,

granzymy…

granzymy…

zmiany integralności błon mitochondrium oraz

zmiany integralności błon mitochondrium oraz

wartości ich potencjału błonowego, wzrost

wartości ich potencjału błonowego, wzrost

produkcji wolnych rodników tlenowych

produkcji wolnych rodników tlenowych

Przekazanie sygnału apoptozy

Przekazanie sygnału apoptozy

przebiega różnymi szlakami, które są

przebiega różnymi szlakami, które są

regulowane przez procesy

regulowane przez procesy

wewnątrzkomórkowe i

wewnątrzkomórkowe i

zewnątrzkomórkowe, np. związanie

zewnątrzkomórkowe, np. związanie

ligandu z

ligandu z

„receptorem śmierci”

„receptorem śmierci”

→

→

Należą do nadrodziny receptorów dla

Należą do nadrodziny receptorów dla

TNF (tumor necrosis factor – czynnik

TNF (tumor necrosis factor – czynnik

martwicy nowotworów)

martwicy nowotworów)

→

→

wewnętrzna „domena śmierci” DD

wewnętrzna „domena śmierci” DD

(death domain) niezbędna do

(death domain) niezbędna do

transmisji sygnału do wnętrza komórki

transmisji sygnału do wnętrza komórki

Apoptoza

Apoptoza

•

Morfologicznie:

Morfologicznie:

-

Obkurczenie komórki na skutek utraty

Obkurczenie komórki na skutek utraty

wody

wody

-

Kondensacja chromatyny

Kondensacja chromatyny

-

Fragmentacja DNA

Fragmentacja DNA

-

Reorganizacja cytoszkieletu

Reorganizacja cytoszkieletu

-

Kondensacja cytoplazmy

Kondensacja cytoplazmy

-

Powstanie ciałek apoptycznych

Powstanie ciałek apoptycznych

Stymulacja układu immunologicznego

(fagocyty)



Zachodzące w trakcie apoptozy zmiany o

Zachodzące w trakcie apoptozy zmiany o

charakterze biochemicznym i

charakterze biochemicznym i

morfologicznym prowadzą poprzez

morfologicznym prowadzą poprzez

nukleolityczną i proteolityczną degradację

nukleolityczną i proteolityczną degradację

składników komórki do jej śmierci

składników komórki do jej śmierci

Kaspazy

Kaspazy

Endonukleazy

Endonukleazy

-

Proteoliza

Proteoliza

-

Dotychczas 14

Dotychczas 14

-

Występują w komórkach

Występują w komórkach

jako nieaktywne

jako nieaktywne

proenzymy

proenzymy

-

Aktywna enzymatycznie

Aktywna enzymatycznie

forma to tetramer

forma to tetramer

powstający wskutek

powstający wskutek

autoproteolizy 2

autoproteolizy 2

cząsteczek prokaspazy i

cząsteczek prokaspazy i

składania jednostek

składania jednostek

( kompleks białkowy

( kompleks białkowy

DISC

DISC

–

–

D

D

eath

eath

I

I

nduced

nduced

S

S

ignalling

ignalling

C

C

omplex) lub działania

omplex) lub działania

innych kaspaz i proteaz

innych kaspaz i proteaz

-

Nukleoliza

Nukleoliza

-

Aktywowana kaspazą 3

Aktywowana kaspazą 3

CAD

CAD

(

(

C

C

aspase-

aspase-

A

A

ctivated

ctivated

D

D

Nase)

Nase)

-

Występuje w komórkach

Występuje w komórkach

związana z inhibitorem

związana z inhibitorem

(ICAD), który po sygnale

(ICAD), który po sygnale

apoptotycznym ulega

apoptotycznym ulega

proteolizie

proteolizie

Endogenne białkowe

Endogenne białkowe

regulatory apoptozy

regulatory apoptozy



Rodzina białek BCL-2

Rodzina białek BCL-2

-

Należą tu białka proapoptyczne i inhibujące

Należą tu białka proapoptyczne i inhibujące

apoptozę

apoptozę

-

4 konserwatywne domeny

4 konserwatywne domeny

BH

BH

(

(

B

B

CL-2

CL-2

H

H

omology)

omology)

-

Proapoptyczne działanie opiera się na tworzeniu

Proapoptyczne działanie opiera się na tworzeniu

kanałów w błonie mitochondrialnej, przez które

kanałów w błonie mitochondrialnej, przez które

uwalniane są do cytoplazmy inne czynniki

uwalniane są do cytoplazmy inne czynniki

apoptyczne

apoptyczne

-

Inhibitorowa rola wiąże się z możliwością

Inhibitorowa rola wiąże się z możliwością

połączenia z białkiem Apaf-1 uniemożliwiające

połączenia z białkiem Apaf-1 uniemożliwiające

związanie prokaspaz do apoptosomu lub też

związanie prokaspaz do apoptosomu lub też

hamowaniem uwalniania cytochromu c z

hamowaniem uwalniania cytochromu c z

mitochondriów do cytoplazmy

mitochondriów do cytoplazmy



IAP

IAP

(

(

I

I

nhibitory

nhibitory

A

A

poptosis

poptosis

P

P

roteins)

roteins)

-

Hamują proces apoptozy na etapie pobudzania

Hamują proces apoptozy na etapie pobudzania

receptorów błonowych

receptorów błonowych

-

Hamują aktywację niektórych kaspaz przez ich

Hamują aktywację niektórych kaspaz przez ich

bezpośrednie związanie

bezpośrednie związanie

-

Działają jak ligaza ubikwitynowa prowadząc do

Działają jak ligaza ubikwitynowa prowadząc do

degradacji kaspaz

degradacji kaspaz



p53

p53

-

Czynnik transkrypcyjny wpływający na losy

Czynnik transkrypcyjny wpływający na losy

komórki z uszkodzonym DNA

komórki z uszkodzonym DNA

•

Reperacja uszkodzeń

Reperacja uszkodzeń

•

Zahamowanie cyklu komórkowego w G1

Zahamowanie cyklu komórkowego w G1

•

apoptoza

apoptoza



HSP

HSP

(

(

H

H

eat

eat

S

S

hock

hock

P

P

roteins)

roteins)

- Zahamowanie apoptozy nawet po aktywacji

- Zahamowanie apoptozy nawet po aktywacji

kaspaz efektorowych

kaspaz efektorowych

Nekroza

Nekroza



Najczęściej spowodowana mechanicznym

Najczęściej spowodowana mechanicznym

uszkodzeniem komórek

uszkodzeniem komórek



Następuje w wyniku utraty równowagi

Następuje w wyniku utraty równowagi

osmotycznej komórki:

osmotycznej komórki:

•

Bierny transport jonów (Ca

Bierny transport jonów (Ca

2+

2+

) do wnętrza

) do wnętrza

komórki

komórki

•

Zwiększony napływ wody

Zwiększony napływ wody

•

Zahamowanie syntezy ATP

Zahamowanie syntezy ATP



Zniszczona otoczka jądrowa i błona

Zniszczona otoczka jądrowa i błona

komórkowa ułatwiają wypływ zawartości

komórkowa ułatwiają wypływ zawartości

komórki na zewnątrz, czemu towarzyszy

komórki na zewnątrz, czemu towarzyszy

reakcja zapalna

reakcja zapalna